一種曲馬多檢測(cè)抗原及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域;具體涉及利用化學(xué)合成方法從曲馬多開(kāi)始合成去 甲曲馬多及其衍生物，再與大分子蛋白偶聯(lián)制成曲馬多檢測(cè)抗原的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 下面的【背景技術(shù)】用于幫助讀者理解本發(fā)明，而不能被認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù)。
[0003 ]曲馬多（Tramado 1)是一種非阿片類中樞性鎮(zhèn)痛藥，對(duì)μ-阿片類受體的親和力相當(dāng) 于嗎啡的1/6000對(duì)κ和δ受體的親和力僅為μ受體的1/25。鹽酸曲馬多由德國(guó)格蘭泰公司研 制開(kāi)發(fā)，于1977年首先在德國(guó)上市，目前已在包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家上市，得到了廣泛的 臨床應(yīng)用。曲馬多可口服給藥、直腸內(nèi)給藥、肌肉注射或靜脈緩慢注射，或稀釋后靜脈內(nèi)滴 注。曲馬多主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，用藥過(guò)量會(huì)產(chǎn)生依賴，對(duì)人體的作用類似嗎啡和海洛 因。曲馬多可用于治療中等至嚴(yán)重的疼痛。有研究表明，曲馬多對(duì)去甲腎上腺素和血清張力 素系統(tǒng)的作用以及減輕痛感的作用，可以減輕抑郁癥和焦慮癥的痛苦。
[0004] 作為目前唯一一種非阿片類中樞性鎮(zhèn)痛藥，由于其鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)大而成癮性低故而 在臨床上得到廣泛使用。多見(jiàn)用于各種術(shù)后止痛、癌痛、分娩痛等的治療，隨著對(duì)其研究的 深入，在抗寒戰(zhàn)、止咳及其他一些治療方面，曲馬多均發(fā)揮了極大的作用。
[0005] 但隨著曲馬多的廣泛使用，曲馬多成癮的問(wèn)題引起關(guān)注。據(jù)有關(guān)資料顯示，正常人 如每天服用曲馬多200毫克，大約半年后會(huì)產(chǎn)生藥物依賴，而如果每天服用300到400毫克(6 到8顆藥)甚至更多，可在短期內(nèi)上癮。2008年，中國(guó)將鹽酸曲馬多作為精神藥品進(jìn)行管制。
[0006] 因此進(jìn)行曲馬多濫用檢測(cè)的相關(guān)試劑及其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)就成為需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明以曲馬多為原料合成半抗原，從苯環(huán)上的0位接上交聯(lián)臂再與具有免疫原 性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以此來(lái)獲得具有反應(yīng)原性和免疫原性的完全抗原;將這一抗原應(yīng)用于檢 測(cè)卡中來(lái)進(jìn)行曲馬多是否濫用的檢測(cè)。為了獲得針對(duì)半抗原的特異性抗體，交聯(lián)臂一般要 遵循兩個(gè)原則:①盡量不要具備復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，一般以烴鏈為佳，這樣可以盡量避免產(chǎn)生抗交 聯(lián)臂的抗體;②要具備一定的長(zhǎng)度，一般為1-10個(gè)原子，最好是1-6個(gè)，這樣可以將半抗原暴 露在蛋白質(zhì)的外表，而不是被蛋白質(zhì)遮掩住。因此合成的免疫抗原選擇的交聯(lián)劑一般是溴 乙酸乙酯、溴丁酸乙酯或溴己酸乙酯等，再通過(guò)脫乙酯與蛋白質(zhì)上的氨基反應(yīng)，其交聯(lián)臂為 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的烴鏈，長(zhǎng)度為4-8個(gè)原子。
[0008] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供的一種曲馬多檢測(cè)抗原，其結(jié)構(gòu)通式如下：
[0009]
[0010] 其中，m=l，2,3,4,5
[0011] -些優(yōu)選的實(shí)施方式中，大分子蛋白為牛血清白蛋白（BSA)、牛γ-球蛋白（BGG)或 雞卵清蛋白（0VA)。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供的曲馬多檢測(cè)抗原的制備方法，具體是：以曲馬多為原料， 首先將曲馬多苯環(huán)上〇位去甲基，然后通過(guò)溴丁酸乙酯在〇-去甲曲馬多的〇位上引出羧基， 再脫去乙酯，通過(guò)羧基與蛋白質(zhì)偶聯(lián);其反應(yīng)式如下：
[0013] 反應(yīng)式一：
[0014]
[0016] 4
[0017]其中，產(chǎn)物1:去甲曲馬多，
[0018] 產(chǎn)物2:4-(3-(-((二甲基氨基）甲基)-羥基環(huán)己基)苯氧基)丁酸乙酯，
[0019] 產(chǎn)物3:4-(3-(-((二甲基氨基）甲基)_羥基環(huán)己基)苯氧基)丁酸，
[0020] 產(chǎn)物4:曲馬多抗原。
[0021] 其中，反應(yīng)式一是由曲馬多原料合成得到產(chǎn)物3的合成過(guò)程;反應(yīng)式二則是產(chǎn)物3 偶聯(lián)大分子蛋白的過(guò)程。
[0022] 本發(fā)明還提供具體的曲馬多檢測(cè)抗原的制備方法，其步驟如下：
[0023] (1)在氬氣保護(hù)下，將曲馬多和蛋氨酸溶解在甲磺酸中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48_96h;反 應(yīng)完成后用NaOH調(diào)PH至11-12后用乙酸乙酯萃取，干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀拉干，柱層析提 純，得到產(chǎn)物1;其中，曲馬多和蛋氨酸摩爾比為1:2~1:6;
[0024] (2)將產(chǎn)物1溶于乙腈中，加入溴代烷烴酯和碳酸鉀，回流12~16小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后 過(guò)濾，干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀拉干，得到產(chǎn)物2;其中，產(chǎn)物1和溴代烷烴酯摩爾比為1:1.2~1.5; [0025] (3)將產(chǎn)物2溶解于甲醇中，加入4N NaOH，室溫?cái)嚢?-16H，反應(yīng)結(jié)束以后加入陽(yáng)離 子樹脂攪拌，檢測(cè)PH〈7后過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀拉干，柱層析純化得產(chǎn)物3;其中，甲醇和4N NaOH 體積比為5:1;
[0026] (4)將產(chǎn)物3,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)溶解于氮氮二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫?cái)嚢?H。然后滴入蛋白溶液中，攪拌過(guò)夜 得到產(chǎn)物4;其中，產(chǎn)物3，DEC，NHS比例為1:1.2~1.5:1.2~1.5。
[0027]有益效果
[0028]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0029] 1、本發(fā)明的合成制備工藝中所使用的材料和催化劑均為普通產(chǎn)品，因此更具實(shí)用 性，適于工業(yè)生產(chǎn)并能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)價(jià)值；
[0030] 2、本發(fā)明沒(méi)有用到氯仿，毒性較低，更具有安全性。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為曲馬多檢測(cè)抗原的結(jié)構(gòu)通式；
[0032] 圖2為膠體金檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖3為色卡示意圖；
[0034]圖4為曲馬多抗原對(duì)于小分子檢測(cè)結(jié)果圖片；
[0035] 圖5為抗原的加速穩(wěn)定性結(jié)果圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0037] 以曲馬多為原料合成檢測(cè)抗原，具體做法是曲馬多為原料合成半抗原，從苯環(huán)上 的0位接上交聯(lián)臂再與具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以此來(lái)獲得具有反應(yīng)原性和免疫原性 的完全抗原。
[0038]實(shí)施例1:曲馬多檢測(cè)抗原的制備
[0039] 1.中間產(chǎn)物(產(chǎn)物3) :4-(3-(-((二甲基氨基）甲基)_羥基環(huán)己基）苯氧基）丁酸的 制備
[0040]第一步：在氬氣保護(hù)下，將曲馬多l(xiāng)〇〇mg和蛋氨酸150mg溶解在甲磺酸3.5ml中，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)72h; TLC(二氯甲烷/甲醇=3/1)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，原料點(diǎn)Rf = 0.7，產(chǎn)物點(diǎn)Rf = 0.8;用4N NaOH調(diào)PH至12，用20ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，用Na2S04干燥，過(guò)濾，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀拉干，柱層析提純，得到產(chǎn)物1(去甲曲馬多)計(jì)68mg。得率81.8%;
[0041 ] 13CNMR(DMS0)5：158,564,145.233,131.187,118.365,114.219,112.365,70.552, 58.089,48.223,46.586,41.858,37.126,28.023,24.835,22.635
[0042] ESI m/z = 250(M+l)
[0043] 第二步：將68mg產(chǎn)物1溶于10ml乙腈，加入4-溴丁酸乙酯64mg，碳酸鉀225mg，80°C 加熱回流12小時(shí)。TLC (二氯甲烷/甲醇=3/1)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，產(chǎn)物點(diǎn)Rf = 0.9。反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾， 用Na2S04干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀拉干，得到84mg產(chǎn)物2(4-(3-(-((二甲基氨基）甲基)-羥基 環(huán)己基)苯氧基)丁酸乙酯）.得率85.3% ;