專利名稱：表達β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及從地衣芽孢桿菌中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因。本發(fā)明還涉及在畢赤酵母中表達β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，以及分泌表達β-1，3-1，4葡聚糖酶的畢赤酵母。
背景技術：
β-葡聚糖廣泛分布于植物和微生物細胞壁中，不同來源的β-葡聚糖的葡聚糖苷鍵的結合方式和比例不盡相同。大麥中的葡聚糖含量很高，而且這些葡聚糖是有葡萄糖經(jīng)由β-1，3和β-1，4鍵，以30％和70％的比例聚合而成的高分子化合物，具有很高的黏度，在以麥類為原料的啤酒生產(chǎn)領域和以麥類為飼料原料的動物養(yǎng)殖領域，都是不良影響因子，由于其特性會增加啤酒生產(chǎn)中的過濾困難和降低原料的利用率，同時，葡聚糖是一種抗營養(yǎng)因子，它在腸道中會形成很粘稠的物質，影響營養(yǎng)物質吸收，有害于腸道健康，有利于一些病原菌繁殖，增加發(fā)病率。因此，研究能夠降解葡聚糖的葡聚糖酶具有重要意義；β-葡聚糖酶是一類能夠降解β-葡聚糖的酶類。國內外研制的葡聚糖酶90％以上都為β-1，4葡聚糖酶，而對于降解葡聚糖更為實用和有效的β-1，3-1，4葡聚糖酶很少研究，更少有產(chǎn)業(yè)化。因此，β-1，3-1，4葡聚糖酶的研制具有比β-1，4葡聚糖酶更重要的理論和現(xiàn)實意義。
發(fā)明內容
本發(fā)明篩選得到一株產(chǎn)β-1，3-1，4葡聚糖酶的菌株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)EGWO39(CGMCC NO0635)。
本發(fā)明提供了從芽孢桿菌菌株地衣芽孢桿菌EGWO39中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因。
本發(fā)明還提供了含有不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重組表達載體。
本發(fā)明進一步提供了在畢赤酵母中表達β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，該方法包括將上述重組表達載體轉化畢赤酵母PMAD16得到了重組子。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及從芽孢桿菌菌株地衣芽孢桿菌EGW039中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因，稱之為eg1314基因。
本發(fā)明制備了含有不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重組表達載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，將不帶有原信號肽編碼序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后與EcoRI和BamHI雙酶切的pMETaA載體(從Invitrogen購買)連接，得到酵母重組表達載體pMETaA-1。
本發(fā)明制備了含有不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314基因的酵母重組子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，將酵母重組表達載體pMETaA-1，經(jīng)酶切后得到線性化pMETaA-11，用于轉化畢赤酵母PMAD16得到了能夠分泌表達β-1，3-1，4葡聚糖酶的重組畢赤酵母。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，將上述含有不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314基因的重組畢赤酵母PMAD16進行誘導發(fā)酵，分泌獲得β-1，3-1，4葡聚糖酶。
有益效果本發(fā)明利用基因工程手段制備了能夠分泌表達β-1，3-1，4葡聚糖酶的重組子。首先實現(xiàn)了β-1，3-1，4葡聚糖酶的生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化。
圖1.eg1314 PCR瓊脂糖電泳。其中1號樣品為MW標記物；5，6號為以出發(fā)菌株基因組為模板的eg1314PCR產(chǎn)物；2，3，4號樣品為以重組載體總DNA為模板的eg1314PCR產(chǎn)物。
圖2.eg1314 PCR產(chǎn)物序列和編碼的AA序列(以出發(fā)菌株基因組為模板)圖3.pMETaA-1的構建過程。
圖4.pMETaA-1 PCR產(chǎn)物和序列測定結果。
圖5，基因組DNA，重組質粒，線性化重組質粒電泳圖譜。其中樣品1為DNA MW標記物；樣品2為環(huán)狀重組載體pMETaA-1；樣品3為單酶切線性化重組載體pMETaA-1；樣品4為單點雙酶切線性化重組載體pMETaA-11(6.5kb+2.2kb)。
圖6.eg1314目標陽性重組子篩選。
圖7.重組酵母外源eg1314PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜。
圖8.重組酵母表達EG1314的SDS-PAGE電泳圖譜。其中1號為MW標記物；2號樣品為EG1314。
下面描述實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式。
本發(fā)明使用的酶和試劑限制酶，pfuDNA聚合酶，T4DNA連接酶，溶菌酶等分別購自Biolabs，Invitrogen和Promega公司。四種dNTP購自Promega公司。大麥葡聚糖購自Sigma公司，DNA和蛋白質分子量標準為Biolabs產(chǎn)品，其它常規(guī)試劑采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。
使用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，YPAD，BMDY，BMMY，MW，MD培養(yǎng)基見Invitrogen畢赤酵母操作手冊。
SDS-PAGE參照BIO-RAD實驗手冊進行。下面實施例中涉及的菌種和質粒概述于表1。
表1 供試菌種和質粒材料與質粒 特性來源說明地衣芽孢桿菌EGW039 beta-1，3-1，4- 發(fā)明專利01134381.8CGMCC0635 endoglucanase基因 CGMCC0635E.coli DH5 Sup E44，ΔlacU169，從國鼎生物技術公司hsdR17，recA1， 購買gryA966，thi-1，relA1嗜甲醇畢赤酵母PMAD16ade2-11 pep4從Invitrogen公司購買PMAD16(pMETaA-1)重組酵母本發(fā)明構建pMETaA 起始載體，8023bp從Invitrogen公司購買pMETaA-1Amp+8.7kb 本發(fā)明構建pMETaA-11 --Amp+0.6kb 本發(fā)明構建實施例一β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的克隆與基因特征一、總DNA的提取取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)EGW039 CGMCC NO0635(CN01134381.8)的濕菌體6g懸浮于50ml 0.05mol磷酸鈉緩沖液中(內含0.6mol/L蔗糖)加入溶菌酶(終濃度達0.5mg/ml)，37℃，溫育1小時；離心收取沉淀，沉淀用無菌水和1.5mol/LNaCl(0.034mol/LNa3citrate)分別洗二次；離心后收取沉淀重懸于0.6ml無菌水中，加入25ul RNase，37℃溫育10分鐘；離心后上清液用等體積酚，酚氯仿，氯仿依次抽提，異丙醇常溫沉淀，沉淀用70％乙醇洗后真空干燥，溶于50ul無菌水中備用。
二、PCR擴增用Techgene0.5型擴增儀擴增，擴增條件94℃5min；94℃1min 55℃1min72℃1min，35循環(huán)；72℃10min。合成特異性引物上游引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；下游引物Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′在上游引物Plf中引入EcoRI酶切位點(下劃線標示)，下游引物中引入BamHI酶切位點(下劃線標示)。以地衣芽孢桿菌EGW039染色體DNA為模板克隆出去掉信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因eg1314，擴增出約650bp的DNA片段(圖1)。
該基因不含N端28AA信號肽序列，eg1314長645bp，A 31％，C 20％，G23％，T 26％，G+C％43％。215 AA，MW 23.1kDa。同源性與3個枯草芽孢桿菌(Murphy，N.，et al.，1984；Borriss A.，1990；van Rensburg，P.，etal.，1997)，Bacillus alkalophilus(Hillen，W.，et al.，2001)，Bacillus circulans(Lee，D.-S.，et al.，2000)bgl同源性分別90％，80％，91％，41％和34％。
AA特征圖2是該基因PCR產(chǎn)物序列測定結果，分析具有如下特征，尤其是同類蛋白質所具有的3個特征序列(Llobera J.，1991)(1)endoglucanase CenA序列AA89-126SSFFTYTGPTDGTPWDE(106)IDIE(110)FLGKDTTKVQFNYYTNG；
(2)T4Lysozyme序列AA104-128DIEFLGKDTTKVQFNYYTNGVG；(3)卵清Lysozyme序列AA130-150HEKIVNLGFDAANSYHTYAFD；(4)以Pichia methanolica分泌特征3個N-糖基化位點Asn-X-Ser/Thr，X為任意AA)AA32-34，39-41，65-67實施例2酵母重組表達載體的構建一.酵母重組表達載體pMETaA-1的構建不帶有原信號肽編碼序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后回收轉化片段。此片段與EcoRI和BamHI雙酶切的pMETaA載體(從Invitrogen購買)連接，可得到pMETaA-1(圖3)，電泳顯示約8.9kb大小(圖4，圖5)，與設計大小吻合。DNA片段用QIAgene公司的PCRPurification Kit和Gel Extraction Kit回收，酶切，連接和轉化等實驗程序共同參照《分子克隆實驗指南》3版(中文譯本，科學出版社，2002年)和所購買相關試劑的試驗說明進行。
因pMETaA中在13bp和5830bp有PacI限制性酶切位點，而在eg1314上無此切點，所以該質粒經(jīng)PacI酶切后可出現(xiàn)約2.2kb和約6.7kb兩片段(圖6)，eg1314和后續(xù)表達元件位于大片段上，而抗性標記因子位于小片段上，后續(xù)工作無須此標記而又無其他表達元件，因此在此丟棄此片段并不影響以后的工作；如從圖5和圖6可以看出，重組質粒長度符合理論值。序列測定結果(圖5)表明，整個開放閱讀框系列完全正確。
二酵母重組表達載體pMETaA-1的鑒定以重組質粒為模板，分別以原始基因eg1314特異性引物Plf和Plr，和包含插入片段在內的原始質粒的特異性引物Pfactorf和PAUGlr做PCR從DNA水平上驗證外源基因插入是否正確。2種引物所得PCR產(chǎn)物序列(見圖1和圖5)分別長645bp和849bp。經(jīng)過酵母分泌表達二者在AA序列上分析均有3個潛在N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr，X為任意AA)，與出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌EGW039原始基因eg1314序列以及其他特征一致?？偟慕Y論驗證結論是eg1314插入位點、方向和序列正確(圖5)。
(1)上游引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；下游引物Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′→645bp(圖1)；
(2)Pfactorf5′TACTATTGCCAGCATTGCTGC3′+PAUGlr5′GAAGAGAAAACATTAGTTGGC-3′→849bp(圖5)；(3)總的結論驗證結論是eg1314插入位點、方向和序列正確(圖5，圖6)；(4)PacI→pMETaA-1→2.2kb和6.7kb，與設計吻合(圖6)。
實施例3含有β-1，4葡聚糖酶基因重組酵母的制備一.β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重組酵母的轉化和篩選不帶有原信號肽編碼序列的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后以正確的閱讀框架克隆到表達載體pMETaA上的酵母α-factor信號肽編碼序列之后，得到重組質粒pMETaA-1。pMETaA-1經(jīng)PacI或者AscI酶切，得到線性化重組載體pMETaA-11，其核苷酸序列長6.5kb，含有插入片段，而氨卞抗性標記基因隨著另外一個2.2kb的小片段被丟棄；酵母菌株嗜甲醇畢赤酵母PMAD16(從Invitrogen公司購買)于50ml的YPAD中30℃培養(yǎng)A600＝0.6-1.0，1500g離心收集菌體，用40ml LKD緩沖液30℃保溫15min后，離心去上清，用50ml預冷STM緩沖液洗二次，離心后菌體用1ml預冷STM緩沖液懸浮，取100ul加入1-3ug經(jīng)PacI線性化重組pMETaA-11，冰浴5min，用電轉化儀電擊，電擊結束后立即加入1ml上YPAD，30℃培養(yǎng)1小時后，離心，沉淀懸浮于200ul 1XYNB中，取100ul平鋪于固體MD平板上，30℃培養(yǎng)3-4天直到平板上出現(xiàn)轉化子，用牙簽挑取白色轉化子對應點種在MM和MD平板上，30℃培養(yǎng)2天，在MD生長而在MM上生長不正常或不生長轉化子為陽性克隆子。
重組酵母具有如下特性嗜甲醇畢赤酵母PMAD16為腺嘌呤缺陷型(Ade-)，缺乏ADE2基因而具有復制起始子；而重組載體pMETaA-11上帶有ADE2基因而無酵母復制起始子。在不加腺嘌呤的選擇培養(yǎng)基MM上缺少ADE2基因的非重組菌株呈紅色或粉紅色菌落，而pMETaA-11的ADE2基因整合到酵母染色體上的重組酵母呈白色菌落。另外，外源基因非同源重組到酵母染色體上后會破壞受體酵母的酒精氧化酶基因，使它不能利用甲醇作為碳源正常生長，這樣，重組子(Mut-)在以甲醇作為唯一碳源的MM培養(yǎng)基上就不生長或緩慢生長，而在以葡萄糖為碳源的MD培養(yǎng)基上能正常生長，靠肉眼就能夠判斷白色單一的菌落是重組酵母；在MM培養(yǎng)基上就不生長或緩慢生長，而在以葡萄糖為碳源的MD培養(yǎng)基上能正常生長的就是陽性重組酵母。(圖6)。
二.重組酵母的培養(yǎng)和誘導表達將重組酵母于25ml BMDY培養(yǎng)基中，于30℃劇烈振蕩培養(yǎng)16-18h后至飽和狀態(tài)(A600＝10-20)，離心收集菌體，加入2.5mlBMMY培養(yǎng)基30℃繼續(xù)培養(yǎng)(每24h添加甲醇至終濃度為0.5％)。
實施例4β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重組酵母分子水平的鑒定重組酵母基因組作為模板，以β-1，3-1，4葡聚糖酶基因特異性引物Plf5′ACAATTGAATTCATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG3′；Plr5′ACGATCGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG3′做PCR，PCR產(chǎn)物的測序結果(圖8)與原始供體的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因序列完全一樣。
實施例5搖瓶水平上，β-1，3-1，4葡聚糖酶基因重組酵母功能性檢測酶活性的測定用重組酵母誘導所產(chǎn)生粗酶液水解大麥葡聚糖(Sigma)，用DNS法測定反應液中的還原糖產(chǎn)物量。酶活力單位定義在最適反應條件下，以每1min生成1umol還原糖所需酶量為一個活力單位(IU)。
對300多個轉化子在試管水平上做表達篩選，其中0-39號在64小時分泌的酶活性達到26U/ml(表2)，比搖瓶水平上的出發(fā)菌株的酶活性低16％，其他的更低；從轉基因技術路線來講本發(fā)明篩選轉化子的基因轉化是成功的(圖7，圖8)，所轉入基因得到正常表達，表達產(chǎn)物也具有正常的功能性(表2)，因為空白對照是0。依據(jù)該表達系統(tǒng)的高耗氧和對生物量依賴性高的特性，預期預期通過上罐加大通氣量后能夠滿足該工程菌株的表達特性的需求而大幅度提高表達水平，是有科學依據(jù)的；比較研究β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因重組酵母和其供體菌株產(chǎn)酶水平和所產(chǎn)酶性質發(fā)現(xiàn)轉化子所產(chǎn)酶性質卻發(fā)生一些有益的改變(表3)。以上轉化子表達的水平較低和酶的性質發(fā)生變化的特性可能與從原核生物向真核生物轉化存在較多未知的變量因素有關。
表2.工程菌株表達(試管水平)異源蛋白質β-1，3-1，4葡聚糖酶的功能性測定菌株eg1314重組子No.活性，U/ml +/--相同時間的供體菌株(64h)1)0-392683.9％2)4-3511.1 35.8％3)4-455.7 18.4％原始菌株 31100％*與試管水平相比，發(fā)酵罐規(guī)模時重組酵母表達EG1314增加5-10倍。
表3.重組子與出發(fā)菌株EG1314酶學性質差異出發(fā)菌株重組酵母最適溫度，℃ 37 55最適宜pH 7 4.5分子量，kDa 23 25糖基化位點-- 3
參考文獻1 R.Borriss，J.Zemek，Zentralbl，Bakteriol.[Naturwiss.]136(1981)63-69.
2 O.Olsen，R.Borriss，Gen.Genet.225(1991)177-185.
3 J.Lloberas，E.Querol，Appl.Microbiol.Biotecchnol.29(1998)32-34.
4 M.E.Louw，S.J.R.Watson，Appl.Microbiol.Biotecchnol.38(1993)507-513.
5 C.Tabernero，P.M.Coll，Appl，Environ.Microbiol.60(1994)1213-1220.
6 H.J.Flint，J.Martin，C.AmcPherson，A.S.Daniel，J.Bacteriol.175(1993)2943-2951.
7 S.Schimming，W.H.Schwarz，Biochem.Biophys.Res.Commun.177(1991)447-452.
8 J.D.Erfle，R.M.Teather，P.J.Wood，J.E.Irvin，Biochem.J.255(1998)833-841.
9 H.Chen，X.L.Li，L.G.Ljungdahl，J.bacterial.179(1997)6028-6034.
10 宋大新等西南農(nóng)業(yè)科學報，3173-175，1990.
11 Cantwell B A，McConnell DJ.Gene，23(1983)21112 R.Borriss，K.Buettner，P.Maentsaelae，Mol.Gen.Genet.222(1990)278-28313 E.P.Gormley，B.A.Cantwell，P.J.Barker，R.S.Glimour，ol.Microbiol.2(1998)813-819.
14 M..Juncosa，J.Pons，T.dot，T.Querol，A.Planas，J.Biol.Chem.269(20)(1994)14530-14535.
15 G.Miksch，E.Fiedler，P.Dobrowolski，E.Flaschel，Appl.Microbiol.Biotechnol.47(1997)530-536.
16 G.Miksch，R.Neitzel，K.Friedhs，E.Flashel，Appl.Microbiol.Biotechnol.51(1999)627-632.
17 M.S.Ekinci，S.I.Mccrae，H.J.Flint，Appl.Environ.Microbiol.63(1997)3752-3756
18 Hinchliff，E.current genetics，8471-475，1984.
19 B.A.Cantwell，G.Brazil.N.Murphy，D.J.McConnell，Curr，Genet.11(1986)65-70.
20 P.Van Rensburg.W.H.van Zy1，I.S.Pretorius，J.Biotechnol.55(1997)43-53.
21 M.Meldgaard，J.Harthill，B.Petersen，O.Olsen，Glycoconjugate J.12(1995)380-390.
22 O.Olsen，K.K.Thomsen，J.Gen.Microbiol.137(1991)579-585.
23 L.G.Jensen，O.Olsen，O.Kops，N.Wolf，K.K.Thomsen，D.von Wettstein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)3487-3491.
24 M.Meldgaard，J.Harthill，B.Petersen，O.Olsen，Glycoconjugate J.12(1995)380-390.
25 L.G.Jensen，O.Olsen，O.Kops，N.Wolf，K.K.Thomsen，D.von Wettstein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)3487-3491.
26 H.Hovarth，J.Huang，O.Wong，E.Koh1，T.Okita，C.G.Kannangara，D.vonWettstein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)1914-1919.
27 E.s.Piruzian，B.Monzavi-Karbassi，N.S.Darbinian，I.V.Goldenkova，N.S.Kobets，A.V.Mochulsky，Mol，Gen.Genet，257(1998)561-567.
28.王建華等.一種beta-1，3-1，4-葡聚糖酶基因和地衣芽孢桿菌EGW039，2001年11月2日.中國發(fā)明專利01134381.8.(公開)29.Argos et al.″Thermal stability and Protein Structure″，Biochemistry，185698-5703(1979).
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所<120>表達β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株<160>1<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>849<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<220><400>1TATCTCTCGA GAAAGAGAGG CTGAAGCTGA ATTCATGCAA ACAGGTGGAT CGTTTTTTGA 60ACCTTTTAAC AGCTATAACT CCGGATTATG GCAAAAAGCA AATGGTTACT CCAATGGAGA 120TATGTTCAAC TGCACGTGGC GTGCAAATAA TGTATCCATG ACGTCATCAG GTGAAATGCT 180TTTGGCGCTG ACAAGCCCGT CTTATAACAA GTTTGACTGC GGGGAGAACC GCTCCGTTCA 240AACCTATGGC TATGGACTTT ATGAAGTCAG AATGAAACCG GCTAAAAACA CAGGGATCGT 300TTCATCGTTC TTCACTTATA CAGGTCCAAC GGATGGAACT CCTTGGGATG AGATTGATAT 360TGAATTTTTA GGAAAAGACA CAACAAAGGT TCAATTTAAT TATTATACAA ATGGCGCGGG 420AAACCATGAG AAGGTTGCGG ATCTCGGATT TGACGCGGCC AATGCCTATC ATACGTATGC 480GTTCGATTGG CAGCCAAACT CTATTAAATG GTATGTCGAT GGGCAATTAA AACATACTGC 540GACAAGCCAA ATCCCGACAA CACCGGGAAA GATCATGATG AACTTGTGGA ATGGGATAGG 600TGTCGATGAC TGGCTCGGTT CCTACAATGG TGTAAATCCG CTATACGCTC ATTATGACTG 660GGTGCGCTAT ACAAAAAAAT AAGGATCCAC GCGTCGTCGA CCCGCGGCGG CCGCCAGCTT 720ACTAGTAGGT AAGCCTATCC CTAACCCTCT CCTCGGTCTC GATTCTACGC GTACCGGTCA 780TCATCACCAT CACCATTGAT CTAGTATACA ATTCTAGGGC TGCCTGTTTG GATATTACTA 840TACCAGCGA
權利要求
1.一種含有不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因的重組表達載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組表達載體，它是酵母重組表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組表達載體，其中不帶有原信號肽編碼序列的β-1，3-1，4-葡聚糖基因克隆到表達載體上的酵母-factor信號肽編碼序列之后。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，是通過將經(jīng)β-1，3-1，4-葡聚糖基因經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后與EcoRI和BamHI雙酶切的pMETaA載體連接，得到的酵母重組表達載體pMETaA-1。
5.含有權利要求1-4任一項所述的重組表達載體的重組子。
6.根據(jù)權利要求5所述的重組子，它是酵母。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組子，它是畢赤酵母PMAD16。
8.生產(chǎn)β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，將權利要求5-7任一項所述的的重組子進行誘導發(fā)酵，分泌獲得β-1，3-1，4葡聚糖酶。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中發(fā)酵包括在BMDY培養(yǎng)基中，于30℃劇烈振蕩培養(yǎng)16-18小時后至飽和狀態(tài)(A600＝10-20)，離心收集菌體，加入BMMY培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)(每24小時添加甲醇至終濃度為0.5％)。
全文摘要
從芽孢桿菌菌株Bacillus licheniformis EGW039中克隆出β－1，3－1，4葡聚糖酶基因，將不帶有DNA原基因信號肽編碼序列的β－1，3－1，4葡聚糖酶基因插入到畢赤酵母表達載體pMETaA上，得到重組載體pMETaA－1，將pMETaA－1經(jīng)酶切后得到更短的線性化重組載體pMETaA－11，用以轉化畢赤酵母PMAD16得到了重組子，該基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了分泌表達。將重組酵母進行誘導發(fā)酵，對重組酶進行初步酶學性質分析表明，最適反應pH約為5.5，最適反應溫度約為55℃。
文檔編號C12N9/46GK1485431SQ0315363
公開日2004年3月31日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權日2003年8月19日
發(fā)明者王建華, 滕達, 姚怡 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 王建華