一種羊口瘡重組蛋白抗原疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫疫苗技術領域，具體涉及一種羊口瘡重組蛋白抗原疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]羊傳染性膿皰(Contag1us ecthyma)又稱羊口瘡(Orf )，是由羊口瘡病毒(Orfvirus ,0RFV)引起的羊的一種病毒性傳染病，也可以感染人。感染羊口瘡病毒的羊生產性能下降，采食困難、消瘦并長期帶毒，給養(yǎng)羊業(yè)及飼養(yǎng)人員的健康帶來嚴重的危害。該病幾乎遍布全世界所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)，而且我國是該病流行嚴重的國家，每年感染ORFV的羊不少于500萬只。
[0003]目前對該病尚無特效的治療方法，只能采取臨床外傷處置及支持療法，在防控上國內外主要采取接種羊口瘡弱毒活疫苗進行預防，但這種疫苗仍不能夠徹底消除和控制該病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此創(chuàng)制安全、高效的新型疫苗勢在必行。亞單位疫苗免疫動物既可以避免弱毒疫苗株基因重排而致毒力返強的風險，又可以避免滅活疫苗滅活不徹底散毒的可能性，可誘導全面而持久的免疫反應，因此，亞單位疫苗是減毒活苗和滅活苗的首選替代品。
[0004]羊口瘡病毒(ORFV)的成熟病毒粒子呈磚形或橢圓形毛線團樣外觀，外層由較厚的囊膜包裹，與VACV相似也具有頂V、EEV等多種病毒粒子形式(Rziha et al.，2003)。單獨利用其中的一種蛋白作為疫苗抗原保護效果較差。

【發(fā)明內容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種既含有羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白又含有頂V 0RF047重組蛋白的羊口瘡重組蛋白抗原疫苗，本疫苗克服了活疫苗及弱毒疫苗在免疫方面的缺陷，而且具有安全、高效、廉價的特點；同時提供一種制備這種疫苗的方法。
[0006]在痘苗病毒的研究中將IMV LI和EEV A33同時構建到同一個啟動子下形成的DNA疫苗免疫小鼠，二者同時表達能夠引發(fā)高的免疫應答及免疫保護效率，而單獨利用其中的一種蛋白作為疫苗抗原保護效果較差。0RF059基因編碼的蛋白FlL是ORFV的主要結構蛋白，也是主要的免疫優(yōu)勢抗原，能夠刺激機體產生抗體以利于機體清除病原體;0RF047基因編碼成熟病毒粒子的膜蛋白LI。在痘苗病毒的研究中已表明LI是一種與頂V膜蛋白必需的豆蔻?；鞍祝以贛V粘附和滲透中起著重要的作用，同時利用LI DNA疫苗免疫動物能夠產生高的中和抗體。本發(fā)明中為了克服單一重組蛋白疫苗的缺點，將具有免疫優(yōu)勢抗原的EEV蛋白0RF059和能夠產生強的中和病毒抗體頂V蛋白0RF047蛋白聯(lián)合并配伍佐劑，制備成一種重組亞單位新型疫苗，來彌補單一蛋白疫苗的不足，這種疫苗既可以促進體液免疫也可以促進細胞免疫，為開發(fā)預防及根除該疾病的疫苗提供了好的理論基礎。
[0007]本發(fā)明的第一個目的是提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物由羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白、IMV 0RF047重組蛋白和佐劑組成。
[0008]羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白的氨基酸序列是指0RF059基因的全長337氨基酸，具體參見序列表SEQ ID N0.2；
IMV 0RF047重組蛋白的氨基酸序列是指頂V 0RF047的胞外區(qū)183氨基酸，具體參見序列表SEQ ID N0.4ο
[0009]上述羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白、頂V 0RF047重組蛋白為原核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白。
[0010]作為優(yōu)選，所述佐劑為ISA201佐劑。
[0011 ] 作為優(yōu)選，所述疫苗中羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白的濃度為lmg/mL、IMV0RF047重組蛋白的濃度為lmg/mL。
[0012]作為優(yōu)選，所述羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白、MV 0RF047重組蛋白和佐劑的體積比為:1:1:2。
[0013]本發(fā)明的第二個目的是提供一種羊口瘡重組蛋白抗原疫苗，所述疫苗的有效成分為上述任一所述的免疫原性組合物。
[0014]本發(fā)明的第三個目的是提供上述疫苗的制備方法，步驟如下:
(1)制備羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白；
(2)制備頂V0RF047重組蛋白；
(3)將羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白、頂V0RF047重組蛋白、佐劑混合制劑，得到疫苗。
[0015]本發(fā)明的第四個目的是提供上述免疫原性組合物或疫苗在制備預防羊口瘡的藥物中的應用。用于防止羊口瘡病毒在羊中的傳播，減少羔羊的發(fā)病率。
[0016]本發(fā)明的第五個目的是提供編碼上述的羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白、IMV0RF047重組蛋白的基因分子。
[0017]比如，編碼上述的羊口瘡EEV囊膜0RF059重組蛋白的基因序列為序列表SEQ IDN0.1，編碼頂V 0RF047重組蛋白的基因序列為序列表SEQ ID N0.3。
[0018]本發(fā)明的第六個目的是提供包含上述基因的表達載體。
[0019]本發(fā)明的第七個目的是提供包含上述表達載體的宿主細胞。
[0020]本發(fā)明中的疫苗與現(xiàn)有的疫苗相比，具有明顯的特點和優(yōu)勢:首先，本發(fā)明中的抗原既包括免疫優(yōu)勢EEV蛋白又包含有產生較強中和病毒能力抗體的MV蛋白，這對一個基因組較大的痘病毒的防控是較合理的；其次本發(fā)明中應用了 ISA201佐劑，該佐劑是水包油形式的佐劑，配制疫苗簡單方便、不存在乳化的麻煩，成本低廉，而且效果理想;最后本發(fā)明中的疫苗包含了不同病毒粒子形式上的重組蛋白抗原，克服了單一蛋白保護效果不全面，也不存在弱毒苗毒力返強的缺點。
[0021 ]對于本發(fā)明制備的新型羊口瘡重組蛋白抗原疫苗效果好主要表現(xiàn)在:(I)該疫苗免疫小鼠后產生針對于這兩種重組蛋白特異性的抗體，而且抗體效價在21天可達10萬；(2)兩種重組蛋白抗原混合與佐劑配伍，既誘導產生IgGl抗體，也產生IgG2a抗體，表明這種疫苗可以促進抗體的免疫應答；(3)兩種重組蛋白抗原混合與佐劑配伍，產生的細胞因子既有Thl型又有Th2型的，這說明這種疫苗既能夠引發(fā)細胞免疫也能夠引發(fā)體液免疫應答，而且兩種蛋白配伍后主要促進細胞免疫應答。細胞免疫對抵抗羊口瘡病毒的感染十分重要，這為羊口瘡的根除及預防提供堅實的基礎。
【附圖說明】
[0022]附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1 為PET-30-0RF059 和pET-30-0RF047-183AA(0RF047 共有 245 個AA,前面 183AA 是胞外區(qū)，而剩余的是跨膜區(qū)和胞內區(qū)，本申請表達的是胞外區(qū))的原核表達及westernbloting鑒定圖；
圖2為免疫小鼠2 Id血清中IgGl、IgG2a測定結果圖；
圖3為免疫小鼠14d脾淋巴細胞分泌IFNγ、IL-6測定結果圖。
【具體實施方式】
[0023]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
[0024]本發(fā)明的實施例分成2個部分完成，實施例一:0RF059、0RF047重組蛋白抗原的制備;實施例二:重組蛋白抗原新型疫苗的制備及免疫效果試驗。
[0025]實施例1羊口瘡0RF059、0RF047重組蛋白的制備 I 0RF059、0RF047表達載體的構建及表達蛋白的純化
本發(fā)明利用實驗室已分離鑒定的羊口瘡病毒株ORFV/GSYM/2012/China，克隆擴增基因組中的0RF059基因(王盈盈等，2013)和0RF047基因，設計原核表達引物，克隆獲得目的片段，通過限制性內切酶消化目的片段和原核表達載體，進一步通過連接酶連接目的基因和載體，然后轉化BL21感受態(tài)細胞，通過誘導劑誘導表達目的蛋白，通過鎳層析柱純化目的蛋白。具體如下:
1.1引物設計
分析本實驗室已經克隆的0RF059、0RF047基因序列，利用01ig06.0軟件設計表達引物，并利用seman軟件分析原核表達載體Pet_30a(+)及目的基因的酶切位點:
0RF059上游引物:5，-CCGGAATTCATG GAT CCA CCC GAA ATC ACG-3’，劃線部分為EcoRI限制酶切位點；下游引物:5 ’ -CCGCTCGAGTCA CAC GAT GGC CGT GAC C-3’，劃線部分為XhoI限制酶切位點。
[0026]0RF047上游引物:5’-CCG GAA TTC ATG GGG GCC GCC AGC A，劃線部分為EcoRI限制酶切位點；下游引物:CGG AAG CTT TTA CTT GCC GGC CTC CTG GTC，劃線部分為HindIII限制酶切位點。
[0027]ORFO59 PCR總反應體積為50yL:滅菌去離子水40yL，10XPCR buffer 5yL，2.5 mMdNTP Mixture 4yL,含有0RF059基因質粒0.3yL，上、下游引物(50ymol/L)各0.lyL，rTaq酶
0.5yL;表達片段0RF059 PCR擴增條件:95°C 5min；94°C 50 s，52°C50s，72°C Imin，35個循環(huán);72°C 5 min0
[0028]0RF047 PCR總反應體積為50yL:滅菌去離子水40yL，10XPCR buffer 5yL,2.5 mMdNTP Mixture 4yL,含有0RF047 基因質粒0.3yL，上、下游引物(50ymol/L)各0.lyL，rTaq酶0.5yL;表達片段0RF047PCR擴增條件:95°C 5min；94°C 50 s，65°C 50s,72°C Imin，35個循環(huán);72°C 5 min。
[0029]1.2表達載體的構建
利用EcoRI和XhoI將0RF059(1011bp)和pET-30a載體雙酶切，利用EcoRI和Hind III將0RF047(552bp)和pET-30a載體雙酶切，并回收，在16°C連接12-16h，連接產物轉化BL21(DE3)感受態(tài)，挑取單克隆進行PCR、酶切和測序鑒定，0RF059的基因序列參見序列表SEQ IDN0.l，0RF047的基因序列參見序列表SEQ ID N0.3。
[0030]測序正確的菌株，按1%的比例接種到含有50ug/mLAmp的LB培養(yǎng)基中，220rpm/min在37°C搖床震蕩搖振2_3h，當OD值達到0.6左右，加誘導劑IPTG終濃度為0.1mM，誘導5h，離心收集菌體。菌體SDS-PAGE電泳，并