低聚半乳糖的檢測定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對含低聚半乳糖和糊精的試樣中的低聚半乳糖進(jìn)行檢測定量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚半乳糖是W半乳糖為主要成分的結(jié)合方式不同的寡糖的混合物，一般，通過 在乳糖中進(jìn)行基于e-半乳糖巧酶的轉(zhuǎn)移反應(yīng)而制造。作為低聚半乳糖的生理效果，被報道 了使在腸道內(nèi)生存的乳酸桿菌增加來調(diào)理腸內(nèi)環(huán)境的效果、通過減少腸間膜脂肪而有助于 預(yù)防生活習(xí)慣病等效果，作為特定保健用食品、各種功能性食品或者它們的原材料，從W前 開始就被重視。在作為特定保健用食品等的成分使用低聚半乳糖的情況下，為了保證其品 質(zhì)、規(guī)格、對作為功能性成分的定量分析數(shù)據(jù)進(jìn)行表示等，要求確立正確性高的定量法。
[0003] 對飲食品中的低聚半乳糖進(jìn)行定量的方法有如下方法:使0-半乳糖巧酶作用于低 聚半乳糖，對由酶解產(chǎn)生的半乳糖進(jìn)行定量，算出寡糖(非專利文獻(xiàn)1)。但是，生成的半乳糖 的檢測需要使用安裝有昂貴的脈沖型電化學(xué)檢測器的陰離子交換高效液相色譜，有通用性 低的問題。另外，在飲食品中含乳糖等營養(yǎng)成分的情況下，不能對由酶處理產(chǎn)生的半乳糖和 從乳糖游離的半乳糖進(jìn)行判斷，結(jié)果是，低聚半乳糖的定量精度下降。
[0004] 也存在如下方法:對低聚半乳糖中的特征性成分、例如少-半乳糖基乳糖(少-GL Gaiei-4Gaim-4Glc)進(jìn)行定量，根據(jù)其量進(jìn)行逆運(yùn)算，算出低聚半乳糖的總量。該方法可判 明使用的低聚半乳糖中的少-CiL的含量，在該含量穩(wěn)定而沒有批次差異等的情況下特別有 效。作為對飲食品試樣中的少-化進(jìn)行定量的方法，W往主要使用如下方法:利用凝膠滲透 色譜，根據(jù)分子的尺寸將飲食品中的其他成分和少-CiL分離。
[0005] 但是，如上所述，低聚半乳糖大多使用營養(yǎng)成分豐富的飲食品、例如育兒用調(diào)制奶 粉、發(fā)酵乳制品等作為功能性的原材料，在該飲食品中也大多含分子的大小與少-CiL同等的 糖質(zhì)源，所W在凝膠滲透色譜中不能將那些糖質(zhì)源和少-化分離。例如，在想要用凝膠滲透 色譜對含作為糊精所含的一種糖類的麥芽=塘的飲食品中的少-CiL進(jìn)行分離和定量的情況 下，因?yàn)辂溠縎塘和少-化的分子大小相同，所W從柱洗脫后的兩者的峰重合，因此給少-GL 的定量、即低聚半乳糖的定量帶來障礙。
[0006] 作為用反向色譜檢測寡糖的方法，已知使用C8或者C18反相色譜柱的方法(專利文 獻(xiàn)1)。但是，在使用運(yùn)些柱嘗試進(jìn)行飲食品中的低聚半乳糖的分離的情況下，不能將飲食品 的其他成分和低聚半乳糖成分分離。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) [000引專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1:特表2007-523352號公報
[0010] 非專利文獻(xiàn)
[0011] 非專利文獻(xiàn)IiJournal of AOAC InternationaliVolume 85 ,Number 2 ,March 2002,pp.417-423(7)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 因此，本發(fā)明的目的在于：提供從含低聚半乳糖和糊精的試樣中簡單且低成本地 分離少-CiL并對少-CiL和低聚半乳糖正確地進(jìn)行定量的方法。
[0013] 本發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過使含低聚半乳糖和 糊精的試樣與衍生物化試劑反應(yīng)，使所述試樣中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接著，提供 于使用C30反相色譜柱的高效液相色譜，從而能將該試樣中的低聚半乳糖成分充分分離，由 此完成了本發(fā)明。
[0014] 目P，本發(fā)明提供低聚半乳糖的檢測定量方法，其對含低聚半乳糖和糊精的試樣中 的低聚半乳糖進(jìn)行檢測定量，所述低聚半乳糖的檢測定量方法的特征在于，使所述試樣與 衍生物化試劑反應(yīng)，使試樣中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接著通過使用C30反相色譜柱 的高效液相色譜將該試樣中的低聚半乳糖成分分離。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的檢測定量方法，能簡單地W低成本將試樣中的低聚半乳糖和其他成 分分離，能正確地進(jìn)行低聚半乳糖的定量。通過使用本發(fā)明的方法對飲食品等的低聚半乳 糖進(jìn)行檢測定量，能對該飲食品等所含的低聚半乳糖的量正確地進(jìn)行管理，能保證品質(zhì)，并 且能正確地進(jìn)行各種有效性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的取得、表示等。
【附圖說明】
[0016] 圖1是使用凝膠滲透柱的HPLC的色譜圖。
[0017] 圖2是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)。
[001引圖3是PMP衍生物-反相HPLC色譜圖（C18反相柱）。
[0019] 圖4是PMP衍生物-反相HPLC色譜圖（C8反相柱）。
[0020] 圖5是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(pH4)/C出CN(78/22)。
[0021] 圖6是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(P冊)/C出CN(79/21)。
[0022] 圖7是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(pH7)/C出CN(81/19)。
[0023] 圖8是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(pH7)/C出CN(82/18)。
[0024] 圖9是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(P冊)/C出CN(82/18)。
[0025] 圖10是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)，憐酸鐘緩沖液(P冊)/C出CN(83/17)。
[0026] 圖11是PMP衍生物反相HPLC色譜圖（C30)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明的檢測定量方法是如下方法:在使飲食品等試樣中所含的低聚半乳糖衍生 物化的基礎(chǔ)上提供于使用C30反相色譜柱的高效液相色譜化PLC)，對試樣中的其他成分和 低聚半乳糖進(jìn)行分離和定量。低聚半乳糖用通式:Gal-(Gal)n-Glc(其中，式中Gal是半乳糖 殘基，Glc是葡萄糖殘基，n是0~4的整數(shù))表示，是在分子內(nèi)含一分子W上半乳糖的2~6糖 的混合物。其中，乳糖不含于低聚半乳糖中。
[0028] 低聚半乳糖的主要成分是在乳糖的非還原末端鍵合有1個半乳糖的3糖的少-半乳 糖基乳糖(4'-GL)。作為其他的具體成分，可列舉Gaim-3Glc、Gaiei-2Glc、Gaim-6Glc、Gal ei-6Gaim-4Glc、Gaiei-6Gaim-4Gaiei-4Glc、Gaim-4Gaiei-4Gaiei-4Glc 等。在本發(fā)明的 檢測定量方法中，可W將低聚半乳糖作為混合物對其進(jìn)行檢測定量，也可W對各個低聚半 乳糖成分進(jìn)行檢測定量，但是從定量的精度的方面出發(fā)，優(yōu)選在-化為對象將其分離后 進(jìn)行檢測定量，根據(jù)其量進(jìn)行逆運(yùn)算，算出低聚半乳糖的總量。
[0029] 低聚半乳糖W任何方法得到均可，例如，能使用W乳糖為原料，通過基于乳糖分解 酶(e-半乳糖巧酶）的轉(zhuǎn)移反應(yīng)而制成的低聚半乳糖。也可W在轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，使產(chǎn)生酶的微 生物作用于原料。作為含乳糖的原料，例如可列舉市售的乳糖、乳汁、奶粉、干酪乳清等。使 用的酶只要是能得到低聚半乳糖的酶就沒有特別限定，例如可列舉使原料中的乳糖水解， 使通過分解產(chǎn)生的半乳糖轉(zhuǎn)移到乳糖或葡萄糖的酶，具體地可列舉e-半乳糖巧酶、Q-半乳 糖巧酶。運(yùn)些酶能單獨(dú)使用或者組合巧巾W上使用。酶處理?xiàng)l件沒有特別限定，一般原料濃 度是10~70%，pH是3~8，酶濃度是0.01~100units/ml，溫度是20~7(rC，反應(yīng)時間是2小 時~3天較合適。另外，也能使用市售的低聚半乳糖液糖，例如能列舉化IGOMATE 55N(才IJj' 斗H55N)(日本養(yǎng)樂多藥品工業(yè)株式會社）。另外，也能使用從含低聚半乳糖的天然物中利 用通用方法進(jìn)行離析、精制而得到的低聚半乳糖。含低聚半乳糖的天然物的種類沒有任何 限定，可列舉例如哺乳動物的乳汁。
[0030] 在本發(fā)明中，成為低聚半乳糖的檢測定量的對象的試樣只要含低聚半乳糖和糊精 就沒有特別限制，可列舉特定保健用食品、功能性食品、健康食品、營養(yǎng)補(bǔ)充食品、嬰兒用、 幼兒用、孕產(chǎn)婦用、病人用的特殊用途食品、吞咽困難者用食品、育兒用調(diào)制奶粉等飲食品、 它們的原材料、或者醫(yī)藥品等。其中，在含糖質(zhì)成分較多的育兒用調(diào)制奶粉應(yīng)用本發(fā)明的方 法的情況下，能高精度地進(jìn)行低聚半乳糖的檢測定量，因此優(yōu)選。所謂糊精是3分子W上的 葡萄糖聚合的物質(zhì)的統(tǒng)稱。另外，作為糊精的一種有麥芽糊精，所謂麥芽糊精是D-葡萄糖利 用曰-1，4鍵而聚合的聚合物，葡萄糖當(dāng)量不足20，通過淀粉水解而得到。
[0031] 麥芽糊精含由3分子的葡萄糖構(gòu)成的麥芽=塘、4分子的葡萄糖聚合的4糖、或者其 W上的葡萄糖聚合的多聚糖類。麥芽=塘是3分子的葡萄糖聚合的物質(zhì)，分子量和分子尺寸 與少-化相同，一部分徑基的立體結(jié)構(gòu)不同。在飲食品等試樣中存在與運(yùn)樣的少-化相同大 小的分子的情況下，在凝膠滲透色譜等的現(xiàn)有方法中，將少-化和麥芽S塘等分離，不能對 低聚半乳糖進(jìn)行定量，但是根據(jù)本發(fā)明的方法，能將兩者充分地分離。所謂葡萄糖當(dāng)量是將 試樣中的還原糖表示為葡萄糖并作為相對于固體成分的百分率求出的值。葡萄糖當(dāng)量最大 為100,是指全部固體