專利名稱：以鷹嘴豆為原料制備功能性α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用中壓柱層析、Biogel Ρ-2凝膠過(guò)濾層析柱，以鷹嘴豆為原料制備功能性α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇的方法。
背景技術(shù)：
α -低聚半乳糖(a -Galactooligosaccharides, a -G0S)是一類含有 ct -半乳糖苷鍵的低分子量的可溶性低聚糖，廣泛分布于豆科植物中。以往，人們一直認(rèn)為α-低聚半乳糖是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，是引起腸胃脹氣的主要原因，因此在豆類食品的加工過(guò)程中強(qiáng)力去除。隨著上世紀(jì)80年代日本開(kāi)始對(duì)功能性低聚糖的研究，人們對(duì)α-低聚半乳糖也有了重新的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌雙歧桿菌的增殖，同時(shí)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。許多學(xué)者對(duì)α-低聚半乳糖重新進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它并不是造成腸胃脹氣的原因，α-低聚半乳 糖才開(kāi)始被人們重新研究利用。目前國(guó)內(nèi)外主要從豆類植物中提取α-低聚半乳糖，報(bào)道的提取原料主要有大豆、羽扇豆、豇豆、豌豆等，其中從大豆中提取α-低聚半乳糖的研究較為廣泛，目前已被應(yīng)用于飲料、酸奶、保健食品等領(lǐng)域。但是，大豆來(lái)源的α-低聚半乳糖含有的蔗糖含量較高，因此限制了其在肥胖人群中的應(yīng)用。鷹嘴豆中含有豐富的碳水化合物，其中的功能性低聚糖有棉子糖、鷹嘴豆糖醇、水蘇糖和毛蕊花糖，據(jù)報(bào)道鷹嘴豆中總低聚糖的含量在5.89%-10. I %，是α-低聚半乳糖的重要來(lái)源之一。與大豆相比，鷹嘴豆中α -低聚半乳糖的含量較高，而蔗糖的含量較低，可以很好的解決大豆低聚糖中因蔗糖含量較高而限制應(yīng)用范圍的問(wèn)題。因而，鷹嘴豆是生產(chǎn)α-低聚半乳糖較為理想的原料。鷹嘴豆中的低聚糖有蔗糖、棉籽糖、鷹嘴豆糖醇、水蘇糖，以及少量的毛蕊花糖等，其中鷹嘴豆糖醇是鷹嘴豆中特征性的三糖。鷹嘴豆是目前世界上栽培面積較廣的食用豆類品種之一，是世界第二大消費(fèi)豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三。由于鷹嘴豆非常耐干旱和貧瘠，非常適于我國(guó)西部地區(qū)種植，在新疆已有2500年的生長(zhǎng)歷史。鷹嘴豆?fàn)I養(yǎng)成分豐富，是不可多得的理想的天然綠色保健食品，具有廣闊的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景，研究開(kāi)發(fā)利用鷹嘴豆對(duì)我國(guó)西部地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展也具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以鷹嘴豆為原料，利用中壓柱層析，Biogel Ρ-2凝膠過(guò)濾層析柱，分離純化制備不同純度α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇純品。


圖I為鷹嘴豆α -低聚半乳糖的HPLC2為鷹嘴豆醇的ESI-TOF-MS圖譜
圖3為鷹嘴豆糖醇的1H-NMR圖譜圖4不同提取時(shí)間對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響圖5不同提取料液比對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響圖6不同提取溫度對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響圖7不同濃度的乙醇水溶液對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例I :
(I)鷹嘴豆α -低聚半乳糖的提取、分離及純化選取籽粒飽滿的鷹嘴豆，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。稱取適量鷹嘴豆粉，按料液比I 10加入50%的乙醇水溶液，于50°C恒溫振蕩器中振蕩提取，然后5000轉(zhuǎn)離心，收集上清液，下層豆粉按以上條件再次提取，離心收集上清液。將兩次的上清液合并、濃縮和凍干，得到鷹嘴豆粗提物。將鷹嘴豆粗提物溶解于適量的去離子水中，經(jīng)濾膜過(guò)濾，濾液上活性炭-硅藻土(I I)中壓層析柱。層析柱用一系列線性梯度的乙醇溶液(0% 50%)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，利用苯酚-硫酸法和HPLC法分析洗脫液的糖含量與組成，合并合適的組分，并經(jīng)真空濃縮與冷凍干燥，分別制備得到α -低聚半乳糖含量為70 % 80 %、85 % 90 %和90 %以上的鷹嘴豆α-低聚半乳糖樣品。(2) α -低聚半乳糖含量的測(cè)定方法采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定樣品中的低聚糖含量。色譜條件色譜柱Sugar-D，檢測(cè)器RID，柱溫40°C，流動(dòng)相為乙腈-水體積比75 25，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20yL。糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確稱取果糖、蔗糖、棉籽糖、鷹嘴豆糖醇、水蘇糖、毛蕊花糖的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC分析。(3)鷹嘴豆糖醇的制備與結(jié)構(gòu)分析鷹嘴豆提取物(提取液冷凍干燥)溶解于適量的去離子水中，經(jīng)濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土(I I, w/w)中壓層析柱。層析柱用一系列線性濃度梯度(0% 50%)的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)苯酚硫酸法初步檢測(cè)后，收集其中含糖的洗脫液，進(jìn)一步通過(guò)HPLC檢測(cè)各峰洗脫液中的糖組分。將其中未知三糖含量較高的洗脫液合并、濃縮，濃縮液上Biogel P-2層析柱，用水進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)苯酚硫酸法和HPLC檢測(cè)，將只含有未知三糖的洗脫液合并、濃縮、冷凍干燥，得到白色的粉末。純化得到的未知三糖樣品進(jìn)行1H-NMR和ESI-TOF-MS分析，1H-NMR分析時(shí)以D2O為溶劑，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)。(4)鷹嘴豆α -低聚半乳糖的腸道益生功能評(píng)價(jià)以不同純度的鷹嘴豆α -低聚半乳糖作為碳源，采用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)法，培養(yǎng)結(jié)束后，采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)菌體計(jì)數(shù)。最后，以益生指數(shù)(PI)作為鷹嘴豆α -低聚半乳糖腸道益生功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。PI= (Bif/Total) + (Lac/Total)—(Bac/Total)—(His/Total)
式中Bif代表不同時(shí)間點(diǎn)Bifidobacterium spp.的數(shù)量除以接種時(shí)的數(shù)量；Lac代表不同時(shí)間點(diǎn)Lactobacillus-Enterococcus spp.的數(shù)量除以接種時(shí)的數(shù)量；Bac代表不同時(shí)間點(diǎn)Bacteroides-Prevotella group的數(shù)量除以接種時(shí)的數(shù)量；His代表不同時(shí)間點(diǎn)Clostridiu mhistolyticum group的數(shù)量除以接種時(shí)的數(shù)量；Total代表不同時(shí)間點(diǎn)總菌群的數(shù)量除以接種時(shí)的數(shù)量。實(shí)施例2 鷹嘴豆α -低聚半乳的提取方法及條件優(yōu)化
(I)鷹嘴豆α -低聚半乳的提取方法①整粒提取法豆粒未經(jīng)粉碎在低溫下經(jīng)水浸泡后，高溫下采用乙醇水溶液進(jìn)行浸提。②粉碎提取法粒經(jīng)粉碎、脫脂后高溫下采用水溶液、甲醇或乙醇水溶液進(jìn)行浸提。由表I可以看出，兩種提取方法的提取率是不同的。相比之下，采用粉碎提取方法得到的蔗糖和α-低聚半乳糖的含量均明顯高于采用整粒提取法。表I兩種提取方法低聚糖提取率
鹿糖(％)~棉子糖(％)鷹嘴豆糖醇~蘇糖(％) I methods Sucrose Raffinose ciceritolStachyose a-G0S(%)
整粒提取法~1.61±0.02~0.35±0.03 2.06±0.02 1.10±0.023.51±0.06 粉碎提取法 2.55±0.04 0.49±0.03 3.26±0.02 1.66±0.04 5.83±0.08(2)鷹嘴豆a -低聚半乳的提取條件優(yōu)化選擇粉碎提取法為基礎(chǔ)，進(jìn)行鷹嘴豆低聚糖的提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。①不同提取時(shí)間對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響提取時(shí)間為15min、30min、60min、90min，提取溫度、料液比和提取次數(shù)分別為70°C、1 2和2次，計(jì)算不同提取時(shí)間下，鷹嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖和低聚半乳糖的提取率。每個(gè)水平重復(fù)3次。結(jié)果表明當(dāng)提取時(shí)間增加至30min以上時(shí)，提取時(shí)間對(duì)低聚糖的提取率沒(méi)有顯著的影響。提取時(shí)間為30min時(shí)，低聚糖就能完全被提取出來(lái)。②不同提取料液比對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響提取的料液比為I : 5、1 8、1 IOU 15、1 20，提取溫度、時(shí)間和提取次數(shù)分別為70°C、30min和2次。計(jì)算采用不同提取料液比，鷹嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖和α-低聚半乳糖的提取率。每個(gè)水平重復(fù)3次。結(jié)果表明當(dāng)料液比為I : 10時(shí)，低聚糖能被完全的浸提出來(lái)。③不同提取溫度對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響提取溫度為室溫(20°C )、50°C、70°C、90°C，提取時(shí)間、料液比和次數(shù)分別為30min、l 10和2次。計(jì)算不同提取溫度下，鷹嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖和a -低聚半乳糖的提取率。每個(gè)水平重復(fù)3次。結(jié)果表明50°C是一個(gè)最佳的提取溫度。④不同濃度的乙醇水溶液對(duì)鷹嘴豆低聚糖提取率的影響提取液乙醇水溶液的濃度為0% (純水)、30%、50%、70%、90%，提取時(shí)間、料液比和次數(shù)分別為30min、l 10和2次。計(jì)算采用不同濃度的提取液時(shí)，鷹嘴豆中主要的可 溶性低聚糖蔗糖和α-低聚半乳糖的提取率。每個(gè)水平重復(fù)3次。結(jié)果表明50%乙醇溶液是比較理想的提取溶劑。
權(quán)利要求
1.一種以鷹嘴豆為原料制備功能性α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇的方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)以產(chǎn)于我國(guó)西部地區(qū)的鷹嘴豆作為原料，選取籽粒飽滿、無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)缺失的鷹嘴豆種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，得到鷹嘴豆粉用于磨粉提取。
(2)稱取適量步驟(I)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒溫條件下振蕩提取。將提取液離心，收集上清液，下層豆粉重復(fù)上述步驟兩次，收集上清液，并將上清液合并。
(3)凍干步驟(2)所得提取物加適量水復(fù)溶，經(jīng)濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土中壓層析柱。
(4)使用苯酚硫酸法對(duì)步驟(3)所得洗脫液進(jìn)行糖含量測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，收集含糖的組分進(jìn)行HPLC分析，收集合適的組分，得到α-低聚半乳糖含量不同的鷹嘴豆α-低聚半乳糖樣品。
(5)步驟(4)所得鷹嘴豆α-低聚半乳糖過(guò)BiogelΡ_2凝膠過(guò)濾層析柱，收集只含有鷹嘴豆糖醇的組分，真空濃縮，冷凍干燥，得到鷹嘴豆糖醇純品。
(6)步驟(5)所得鷹嘴豆糖醇的結(jié)構(gòu)鑒定方法為分離純化得到的鷹嘴豆糖醇樣品進(jìn)行 1H-NMR 和 ESI-TOF-MS 分析。
(7)采用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)法，對(duì)步驟(4)所制備得不同純度的鷹嘴豆α-低聚半乳糖的腸道益生功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2.體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆α-低聚半乳糖對(duì)雙歧桿菌、乳酸菌都有較好的增殖作用，對(duì)擬桿菌、梭狀菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用；鷹嘴豆α-低聚半乳糖只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成，對(duì)總體菌群的數(shù)量基本沒(méi)有影響；α -低聚半乳糖含量高于90%的鷹嘴豆α-低聚半乳糖樣品對(duì)有益菌的增殖作用最強(qiáng)，同時(shí)對(duì)有害菌的抑制作用也最強(qiáng)，表現(xiàn)出最高的PI值(2.00)，α-低聚半乳糖含量為70-80%、85-90%的鷹嘴豆α -低聚半乳糖樣品及鷹嘴豆粗提物的PI值依次為I. 39、I. 73和O. 89，而對(duì)照組為負(fù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鷹嘴豆α-低聚半乳糖具有很好的腸道益生功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及以鷹嘴豆為原料制備功能性α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇的方法。包括如下步驟選取鷹嘴豆種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，按一定料液比加入乙醇水溶液提取，將提取液離心，收集上清液，重復(fù)上述步驟三次，得到提取液。利用中壓層析柱，用一系列線性濃度梯度的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫。對(duì)洗脫液進(jìn)行糖含量測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，收集含糖的組分進(jìn)行HPLC分析，得到不同純度的鷹嘴豆α-低聚半乳糖。鷹嘴豆α-低聚半乳糖經(jīng)Biogel P-2凝膠過(guò)濾層析柱，得到鷹嘴豆糖醇。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鷹嘴豆α-低聚半乳糖及鷹嘴豆糖醇具有很好的腸道益生功能，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07H15/207GK102898485SQ201210047769
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者曾曉雄, 張蕓, 賀晉艷, 向小麗 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)