液態(tài)奶中低聚半乳糖含量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及奶制品檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及液態(tài)奶中低聚半乳糖含量的檢測(cè)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚半乳糖不能被人體上消化道消化吸收，可以直接進(jìn)入大腸，具有低能量、促進(jìn) 腸道雙歧桿菌的增殖、改善礦物質(zhì)元素的吸收、防止骨質(zhì)減少、改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防和治療 便秘、低致齲齒性、生成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、改善營(yíng)養(yǎng)狀況、提高免疫力、增強(qiáng)抗腫瘤和抗衰老的功 能。我國(guó)衛(wèi)生部已經(jīng)批準(zhǔn)低聚半乳糖為新資源食品，并且允許添加在嬰幼兒食品、乳制品、 飲料、焙烤食品和糖果中，食用量每天不超過15克。
[0003] 由于低聚半乳糖是人體腸道中雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌等有益菌極好的營(yíng)養(yǎng)源和 有效的增殖因子，可以改善人體腸道的消化吸收功能，所以，液態(tài)奶中常常添加低聚半乳糖 這一營(yíng)養(yǎng)成分。
[0004] 廠家在生產(chǎn)液態(tài)奶的過程中，將低聚半乳糖原料按照一定的比例添加至原料中制 得成品。在出廠檢驗(yàn)時(shí)，為了確保成品中低聚半乳糖的含量符合添加要求，需要對(duì)其含量進(jìn) 行檢測(cè)，符合低聚半乳糖添加標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品方可作為成品進(jìn)行銷售。因此，液態(tài)奶中低聚半乳 糖含量的檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確至關(guān)重要。
[0005] 公布號(hào)為CN102353730A的專利公開了一種基于生物酶技術(shù)的低聚半乳糖檢測(cè)方 法，首先采用三氯乙酸及乙酸鉛脫蛋白質(zhì)法對(duì)待測(cè)對(duì)象進(jìn)行預(yù)處理后通過膜過濾去掉雜質(zhì) 獲得待測(cè)樣品，然后用不同濃度的氫氧化鈉和乙酸鈉進(jìn)行離子交換和梯度洗脫，最后用四 電位脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
[0006] 上述檢測(cè)方法中需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分解，將樣品中的各種低聚半乳糖成分進(jìn)行分 離和含量檢測(cè)，而不能直接對(duì)樣品中的低聚半乳糖含量進(jìn)行檢測(cè)。
[0007] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種適用于液態(tài)奶生產(chǎn)廠家在出廠前對(duì)液態(tài)奶中添加的 低聚半乳糖含量進(jìn)行檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法中無(wú)法直接對(duì)樣品中的低聚 半乳糖進(jìn)行檢測(cè)的缺陷，選擇與液態(tài)奶中添加的低聚半乳糖的品牌號(hào)相同的低聚半乳糖作 為標(biāo)準(zhǔn)物添加至樣品中配成定標(biāo)液，與樣品液經(jīng)過相同的處理后得到色譜峰，將兩者的色 譜峰進(jìn)行對(duì)比篩選出特異峰進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算。由于本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是直接通過確定 低聚半乳糖的色譜峰而進(jìn)行定量計(jì)算，步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的操作，最大程度地減少了檢測(cè) 過程中的不確定因素帶來的誤差。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0010] -種液態(tài)奶中低聚半乳糖含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0011] (1)采用與樣品中添加的低聚半乳糖的品牌號(hào)相同的低聚半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，配 制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；
[0012] (2)稱取兩份相同質(zhì)量的樣品，一份加入所述標(biāo)準(zhǔn)物，加水溶解后配成加標(biāo)液，另 一份直接加水配成相同體積的樣品液，將所述加標(biāo)液和所述樣品液經(jīng)預(yù)處理后連同所述工 作液依次加至離子色譜儀中進(jìn)行梯度洗脫，并分別得到色譜圖；
[0013] (3)將所述加標(biāo)液和所述樣品液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比后篩選出用于定量的特異峰， 擬合得到所述工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品液色譜圖中特異峰的峰面積找出所述標(biāo)準(zhǔn)曲 線上對(duì)應(yīng)的濃度，得到液態(tài)奶中低聚半乳糖含量。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理如下：
[0015] 選擇與液態(tài)奶中添加的低聚半乳糖的品牌號(hào)相同的低聚半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，配制 成不同濃度的工作液。由于所用的標(biāo)準(zhǔn)物與液態(tài)奶中的低聚半乳糖出自同一生產(chǎn)廠家，確 保標(biāo)準(zhǔn)物在色譜檢測(cè)過程中和液態(tài)奶中的低聚半乳糖具有相同的色譜行為和響應(yīng)特性。
[0016] 其次，在樣品液中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)物作為加標(biāo)液，將加標(biāo)液和樣品液經(jīng)過相同 的處理后進(jìn)樣至離子色譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。由于加標(biāo)液中的樣品質(zhì)量和樣品液中的樣品質(zhì)量 相同，且加標(biāo)液和樣品液均經(jīng)過相同的處理，從而使得兩者的色譜圖在相同保留時(shí)間處具 有峰形相同的色譜峰，這一色譜峰既包含低聚半乳糖的色譜峰也包含液態(tài)奶中其它組分的 色譜峰，但由于加標(biāo)液中低聚半乳糖的含量大于樣品液，而其他組分的含量均相同，因此， 加標(biāo)液中低聚半乳糖生成的色譜峰雖然和樣品液中的低聚半乳糖生成的色譜峰具有相同 的保留時(shí)間和峰形，但前者的峰高一定大于后者，即前者的峰面積一定大于后者。因此，可 通過對(duì)比篩選出液態(tài)奶中低聚半乳糖生成的特異峰，將其用作定量計(jì)算。根據(jù)不同濃度工 作液的特異峰的峰面積得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，后根據(jù)所述樣品液中特異峰的峰面積，找出所述標(biāo) 準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度，得到所述樣品液中低聚半乳糖的濃度，計(jì)算得到液態(tài)奶中低聚半乳 糖含量。
[0017] 由上述內(nèi)容可以看出，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是直接通過確定低聚半乳糖的色譜 峰而進(jìn)行定量計(jì)算的，由于不通過檢測(cè)乳糖的含量來推算出低聚半乳糖的含量，從而無(wú)需 使用酶對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行酶解，也就不存在因酶水解而在檢測(cè)體系中引入外來乳糖的問題， 保證了檢測(cè)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。
[0018] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的操作，最大程度地減少了檢測(cè)過程 中的不確定因素帶來的誤差。
[0019] 而且，本發(fā)明的檢測(cè)方法中利用的離子色譜儀直接得到峰面積、擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到樣品液中低聚半乳糖的濃度，不但方便快捷，而且計(jì)算機(jī)操作也進(jìn)一步保證了結(jié)果的 準(zhǔn)確性。
[0020] 利用離子色譜儀進(jìn)行檢測(cè)過程中，多種因素均會(huì)對(duì)色譜圖產(chǎn)生影響。為了保證加 標(biāo)液和樣品液中的低聚半乳糖產(chǎn)生的色譜峰峰形好，不拖尾，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述梯度 洗脫的步驟中，所用的流動(dòng)相包括超純水、2 50-26Ommo 1 /L NaOH溶液、1 · 0-1 · 2mo 1 / LCH3C00Na溶液+100-120mmol/L NaOH溶液和 100-120mmol/L CH3C00Na溶液。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)中，所述梯度洗脫的步驟中，洗脫時(shí)間為60~65min，流動(dòng) 相的流速為〇. 40~0.45mL/min，且所述超純水的體積分?jǐn)?shù)為0-58%，所述NaOH溶液的體積 分?jǐn)?shù)為0-100 %，所述混合溶液的體積分?jǐn)?shù)為0-100 %，所述CH3C00Na溶液的體積分?jǐn)?shù)為0-45% 〇
[0022] 其梯度洗脫的具體條件如下表所示，在離子色譜檢測(cè)過程中，可根據(jù)下表設(shè)置離 子色譜儀流動(dòng)相的各個(gè)參數(shù)。
[0023] 表1離子色譜儀流動(dòng)相的參數(shù)設(shè)置表
[0024]
[0
[0026]基于同樣的考慮，優(yōu)選地，步驟（2)中，所述離子色譜儀的分析柱為3mmX 150mm Dionex CarboPac PA20,保護(hù)柱為3mmX30mm Dionex CarboPac PA20。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述分析柱的柱溫為30_35°C。
[0028] 優(yōu)選地，步驟(2)中，所述預(yù)處理的步驟具體包括：
[0029]加入相同體積的乙腈，混勻后經(jīng)高速離心獲得上清液，依次取相同體積的所述加 標(biāo)液和所述樣品液的上清液，加入等量水稀釋后再過濾，收集濾液。
[0030] 上述預(yù)處理步驟中，通過水浴使得加標(biāo)液和樣品液充分溶解，再通過加入乙腈去 除加標(biāo)液和樣品液中的蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，避免對(duì)色譜圖的峰形和峰位置產(chǎn)生影 響;通過高速離心和過濾進(jìn)一步將大分子物質(zhì)沉淀。
[0031] 為了保證離心效果，優(yōu)選地，所述高速離心的步驟中，離心溫度為25-28°C，轉(zhuǎn)速為 9000-10000rpm，且離心時(shí)間為10-13分鐘。
[0032]為了保證過濾效果，優(yōu)選地，所述過濾的步驟具體包括：
[0033]將稀釋后的上清液依次通過0.22μπι的PES濾膜。
[0034] 優(yōu)選地，步驟(3)中，當(dāng)存在1個(gè)以上的特異峰時(shí)，分別測(cè)得所述工作液在每個(gè)特異 峰處的標(biāo)準(zhǔn)曲線，后根據(jù)所述樣品液中相應(yīng)特異峰的峰面積，一一找出相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì) 應(yīng)的濃度，取所有濃度的平均值作為所述樣品液中低聚半乳糖的濃度。
[0035] 優(yōu)選地，步驟(3)中，所述將所述加標(biāo)液和所述樣品液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比后篩選出 用于定量的特異峰的步驟具體包括：
[0036] 所述加標(biāo)液和所述樣品液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比，選擇保留時(shí)間和峰形相同且所述加 標(biāo)液的峰面積大于所述樣品液的峰面積的色譜峰作為定量的特異峰。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0038] (1)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法中無(wú)法直接檢測(cè)低聚半乳糖含量的 缺陷，選擇與液態(tài)奶中添加的低聚半乳糖的品牌號(hào)相同的低聚半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)物添加至樣 品中配成定標(biāo)液，與樣品液經(jīng)過相同的處理后得到色譜峰，將兩者的色譜峰進(jìn)行對(duì)比，選擇 保留時(shí)間和峰形相同且加標(biāo)液峰面積大于樣品液峰面積的色譜峰為特異峰進(jìn)行相應(yīng)的計(jì) 算。由于本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是直接通過確定低聚半乳糖的色譜峰而進(jìn)行定量計(jì)算，步 驟簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的操作，最大程度地減少了檢測(cè)過程中的不確定因素帶來的誤差。
[0039] (2)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中通過對(duì)離子色譜檢測(cè)過程中的梯度洗脫條件、色譜 柱條件進(jìn)行優(yōu)選，保證加標(biāo)液和樣品液中的低聚半乳糖產(chǎn)生的色譜峰峰形好，不拖尾。
[0040] (3)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中在預(yù)處理過程中，通過水浴使得加標(biāo)液和樣品液充 分溶解，再通過加入乙腈去除加標(biāo)液和樣品液中的蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，避免對(duì)色 譜圖的峰形和峰位置產(chǎn)生影響;通過高速離心和過濾進(jìn)一步將大分子物質(zhì)沉淀。
【附圖說明】
[0041] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0042] 圖1為某品牌液態(tài)奶的樣品液和加標(biāo)液的色譜圖；
[0043] 圖2為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0045]本實(shí)施例中所用到的試劑和儀器的詳細(xì)情況如下：
[0046] 超純水：電阻率達(dá)到18.2 Ω ;氫氧化鈉：色譜純，購(gòu)于ACR ORGANICS;醋酸鈉：色譜 純，購(gòu)于SIGMA;乙腈:色譜純，購(gòu)于SIGMA;氦氣:設(shè)備級(jí)，純度:99.996%。
[0047] 離子色譜儀：ICS5000+，配備四元