一種高溫糖苷水解酶CoGH1A基因及其表達蛋白與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術、生物質(zhì)利用和食品領域，具體設及一種高溫糖巧水解酶基 因及其表達蛋白與應用。
【背景技術】：
[0002] 糖巧水解酶是水解兩個糖分子或糖分子與非糖分子之間糖巧鍵的一類酶。糖巧水 解酶廣泛應用于生物和化學產(chǎn)業(yè)，如食品、飲料、飼料、醫(yī)藥、化工、服裝和造紙等領域。其 中，纖維素酶由于生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)的迫切需求而受到最為廣泛的重視。另外，有些糖巧水解酶具 有轉糖巧作用，用于合成低聚糖和巧類物質(zhì)，如一些半乳糖巧酶能利用乳糖合成低聚半乳 糖，有些β-葡萄糖巧酶能利用醇和糖合成烷基糖巧。低聚半乳糖具有保濕性良好、甜度低、 熱能低(非消化）、對酸和熱穩(wěn)定等特性，它能促進腸道益生菌(雙歧桿菌）的生長，促進脂類 代謝等，有重要保健作用和醫(yī)用價值，在功能食品領域受到廣泛的關注，被廣泛應用在保健 品、乳品工業(yè)、糖果、飲料等領域。而烷基糖巧是一種重要的化工原料?？傮w而言，目前糖巧 水解酶存在催化效率低、穩(wěn)定性不足、應用成本高等問題，限制了相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，開發(fā)高 效、穩(wěn)定的糖巧水解酶是生物、化工和食品等產(chǎn)業(yè)的迫切需求。極端高溫菌長期生活在高溫 環(huán)境，形成獨特的酶體系，其分泌的酶有耐熱性強、催化效率高、催化機理獨特等特點，高溫 糖巧水解酶的開發(fā)將加快生物和化工相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本發(fā)明提供一種高效多功能高溫糖 巧水解酶基因及表達產(chǎn)物。該酶在75°C下水浴12h其酶活仍保持100%，表現(xiàn)出極強的熱穩(wěn) 定性，該酶同時具有β-葡萄糖巧酶、纖維素外切酶、β-木糖巧酶、β-半乳糖巧酶和低聚半乳 糖合成酶活性，其中β-葡萄糖巧酶和β-半乳糖巧酶活性分別接近和超過文獻報道的最高 值。該酶與商業(yè)纖維素酶協(xié)同水解賴桿，能明顯提高葡萄糖和木糖產(chǎn)率;催化低聚半乳糖 (GalOS)合成速率是文獻報道的10-15倍，達265.2g L-化-1，具有潛在的工業(yè)應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：
[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有糖巧水解酶存在熱穩(wěn)定性差、催化效率低、使用成本高 等問題，提供一種高溫糖巧水解酶CoGHlA基因及其表達蛋白與應用，包含高溫糖巧水解酶 CoGHlA基因、基因的重組載體和重組工程菌、高溫糖巧水解酶CoGHlA氨基酸序列經(jīng)過一個 或多個氨基酸殘基取代、缺失及添加形成的具有糖巧水解酶活性的衍生蛋白質(zhì)，W及該糖 巧水解酶的蛋白表達和應用。具體包括如下：
[000引 1、一種高溫糖巧水解酶CoGHlA的基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 2、一種高溫糖巧水解酶CoG化A，其氨基酸系列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 3、高溫糖巧水解酶CoGHlA氨基酸序列SEQ ID NO.2中的氨基酸經(jīng)過一個或多個氨 基酸殘基取代、缺失及添加形成的具有糖巧水解酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
[0008] 4、一種用于擴增高溫糖巧水解酶CoGHlA基因的方法，其特征在于所使用的引物 為：
[0009] PX13001 5'-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3'
[0010] PX13002 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3'
[0011] 5、一種高溫糖巧水解酶CoGHlA基因序列的重組載體祀T-28b-CoGHlA及其轉化而 得的重組工程菌株，所述菌株為大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)。
[0012] 6、本發(fā)明提供制備上述高溫糖巧水解酶CoGHlA表達和純化的方法。
[0013] 7、高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物質(zhì)水解中的應用，與商業(yè)纖維素酶協(xié)同水解，能 同時提高葡萄糖和木糖的得率。
[0014] 8、高溫糖巧水解酶CoGHlA在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的應用。它能迅速分解 牛
[0015] 奶中的乳糖，利用乳糖合成低聚半乳糖的合成速率是文獻報道的10-15倍。
[0016] 技術方案：
[0017] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0018] (1)高溫糖巧水解酶CoGHlA基因重組載體和重組工程菌的構建
[0019] 提取熱解纖維素菌C.owensensis的基因組，設計引物分別PCR擴增高溫糖巧水解 酶CoGHlA的基因，再酶切連接到載體祀上，轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，篩選并通 過測序鑒定陽性重組載體，提取重組載體質(zhì)粒，轉化大腸桿菌化2UDE3)感受態(tài)細胞，獲得 還有重組載體的重組工程菌。
[0020] (2)上述高溫糖巧水解酶CoGHlA的蛋白純化和酶學活性測定
[0021] 將獲得的重組工程菌轉接培養(yǎng)，IPTG誘導酶蛋白表達。通過超聲波破碎細胞，高速 離屯、和Ni-NTA sepharose 4B親和層析分離純化;然后通過SDS-PAGE電泳和分子篩鑒定蛋 白分子大小和聚合態(tài)，發(fā)現(xiàn)高溫糖巧水解酶CoGHlAW單體或Ξ聚體的形式存在;最后濃縮， 測定蛋白濃度，分析蛋白的酶學性質(zhì)。
[0022] (3)上述高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物質(zhì)水解中的應用
[0023] W賴桿等生物質(zhì)為原料，用不同比例的高溫糖巧水解酶CoGHlA和商業(yè)纖維素酶酶 解在50-70°C，pH 5-7的條件下酶解48-7化，測定纖維素和半纖維素的酶解率，說明添加高 溫糖巧水解酶CoGHlA對纖維素和半纖維素酶解的促進作用。
[0024] (4)高溫糖巧水解酶CoGHlA在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的應用
[002引 W不同濃度4%-50%(w/w)的乳糖為底物，高溫糖巧水解酶Co細lA在70-80°C，pH 5-7條件下下催化lOmin-化，高效液相色譜儀(P化C)分析乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳 糖濃度變化，測定該酶對乳糖水解和低聚半乳糖合成的效率。
[0026] 有益效果:高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物質(zhì)制備可發(fā)酵糖和低聚半乳糖生產(chǎn)等方 面具有潛在的工業(yè)應用價值。
【附圖說明】
[0027] 圖1:高溫糖巧水解酶CoGHlA凝膠層析和凝膠電泳圖
[0028] 圖2:圖2高溫糖巧水解酶CoGHlA最適溫度、pH和熱穩(wěn)定性
【具體實施方式】
[0029] 實施例1:高溫糖巧水解酶CoGHlA重組工程菌株的構建
[0030] 細菌基因組DM的提取：
[0031 ] 在75°C，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)C.owensensis菌，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng) 細菌的基因組DNA，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0032] PCR引物設計：
[0033]根據(jù)公開的C.owensensis基因組序列信息，預測高溫糖巧水解酶Co細1A基因，設 計克隆所用的PCR引物。用于擴增高溫糖巧水解酶CoGHlA基因的引物如下：
[0034] PX13001 5'-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3'
[0035] PX13002 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3'
[0036] 從基因組DM中PCR擴增基因：
[0037] WC.owensensis基因組DNA為模板，應用設計引物進行PCR擴增高溫糖巧水解酶 CoGHlA基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測確認擴增DNA片段，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回 收PCR產(chǎn)物。
[0038] 高溫木聚糖酶Co Xylosidase A基因的酶切與連接：
[0039] 高溫木聚糖酶Co Xylosidase A基因 DNA片段和質(zhì)粒pET-28b進行雙酶切(Nde 1/ 化0 I)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因 DM及質(zhì)粒載體。將酶切回收后的基因 DNA 和質(zhì)粒載體用T4DNA連接酶反應連接。
[0040] 高溫糖巧水解酶CoGHlA基因 DNA的處理與連接：
[0041 ]用高保真DNA聚合酶依據(jù)所設計引物擴增質(zhì)粒祀T-28b。用T4DNA聚合