適于在玉米中表達(dá)的優(yōu)化α-半乳糖苷酶基因aga-F75及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及適于在玉米中表達(dá)的優(yōu)化α -半乳糖苷酶基 因 aga_F75及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豆柏和其它豆類餅柏作為最主要的蛋白原料在動物飼料中廣泛使用，主要是因為 它們的蛋白含量較高，而且來源比較廣。然而由于這些豆類餅柏中通常含有許多抗?fàn)I養(yǎng)因 子而限制了它們在飼料中應(yīng)用的比例。其中脹氣因子的大豆中低聚糖主要是α-半乳糖苷 之類的寡聚糖。α-半乳糖苷是由一個蔗糖單位（果糖-葡萄糖）與多個半乳糖單位，以 α-l，6-糖苷鍵連接而成的長短不同的一類物質(zhì)，如棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等。單胃動物 體內(nèi)缺乏α-半乳糖苷酶而不能分解這些物質(zhì)。當(dāng)這些物質(zhì)經(jīng)過大腸消化時，會被發(fā)酵產(chǎn) 生大量氣體，導(dǎo)致動物出現(xiàn)脹氣和腹瀉等不良癥狀。
[0003] α -半乳糖苷酶（EC 3. 2. 1. 22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，催化移除不同 底物中α -連接的末端非還原性D-半乳糖。除此外該酶還可以把a(bǔ) -D-半乳糖基殘基轉(zhuǎn) 移到不同的羥基類衍生物上即轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花 糖等低聚糖，還能水解含有α-半乳糖苷鍵的雜多糖。α-半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植 物、微生物中，現(xiàn)已篩選出不少產(chǎn)α -半乳糖苷酶活性高的微生物，并進(jìn)行了廣泛深入的研 宄，尤其在酶制劑的制備和食品工業(yè)的應(yīng)用方面，已取得很大進(jìn)展。
[0004] 現(xiàn)在生產(chǎn)上通常需要添加 α -半乳糖苷酶制劑來促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化并消除或 減少飼料組成中α -半乳糖苷糖類對營養(yǎng)物質(zhì)消化的副作用，從而改善動物的生產(chǎn)性能， 降低飼料成本。已經(jīng)利用微生物發(fā)酵進(jìn)行飼α-半乳糖苷酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并在飼料工業(yè) 中廣泛應(yīng)用，但其具有發(fā)酵過程耗能高，生產(chǎn)門檻高和成本高等缺點。而利用轉(zhuǎn)基因植物生 產(chǎn)α-半乳糖苷酶能夠很好的解決如上問題，因而是進(jìn)一步的發(fā)展方向，基因工程研宄領(lǐng) 域的進(jìn)展使利用植物表達(dá)α-半乳糖苷酶用于飼料工業(yè)成為可能。
[0005] 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)α -半乳糖苷酶，其優(yōu)勢在于：1)轉(zhuǎn)基因植物尤其是轉(zhuǎn)基因 玉米作為主要飼料原料，可以直接飼喂，避免了目前酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)和添加過程；2)生 產(chǎn)規(guī)模不受限制，成本比較低。農(nóng)作物的生產(chǎn)、運輸、加工和貯藏等各種基礎(chǔ)設(shè)施及技術(shù)早 已具備，轉(zhuǎn)基因植物高水平表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白可以通過大規(guī)模種植來完成；3)目前初步的 研宄發(fā)現(xiàn)，在植物，尤其是種子中表達(dá)的非淀粉多糖酶具有更好的貯存穩(wěn)定性和抗逆性；4) 安全性好，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑，細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染極其普遍，但在植物表達(dá)系統(tǒng)中 沒有這種污染。
[0006] 玉米作為我國最主要的能量飼料糧之一，被稱為"飼料之王"，其用量占配合飼料 成份的60-70%。玉米籽粒是動物飼料最主要的成分，與其他飼料作物相比，轉(zhuǎn)基因玉米作 為生物反應(yīng)器這具有更好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和新技術(shù)的綜合應(yīng) 用，玉米已成為最重要的糧食、飼料和經(jīng)濟(jì)兼用作物。所以，在此新形勢下，加強(qiáng)優(yōu)質(zhì)、專用 和資源高效飼用型玉米新品種的培育和推廣具有十分重要的現(xiàn)實意義。
[0007] 來源于Gibberella sp. F75的α -半乳糖苷酶具有較優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，它同時具 有很好的蛋白酶抗性，利用該α-半乳糖苷酶可培育具有優(yōu)良性質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。多種 半乳糖苷酶資源分離、微生物重組表達(dá)的研宄已經(jīng)被報道，但由于大多數(shù)酶的蛋白質(zhì)分 子量較大，酶特性不能滿足要求等原因，目前還沒有在植物中重組表達(dá)該酶的報道，因此， 本發(fā)明通過基因改造，載體選擇、組織特異性表達(dá)等方式成功進(jìn)行了玉米中的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一是將來源于Gibberella sp. F75的α-半乳糖苷酶基因 aga_F75進(jìn)行一系列優(yōu)化獲得能夠在玉米中高效表達(dá)、穩(wěn)定性好的α-半乳糖苷酶基因 aga_F75m ;
[0009] 本發(fā)明的目的之二是提供在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)優(yōu)良性質(zhì)α -半乳糖苷酶的 具體方法。利用重組技術(shù)將aga-F75m構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，利用高效的組織特異性啟 動子介導(dǎo)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，整合到植物染色體上，通過選擇培養(yǎng)基得到陽性植株。再通過 PCR、Southern blot、Western blot及酶活檢測等方法篩選高效表達(dá)優(yōu)良性質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植 株。
[0010] 為了提高α -半乳糖苷酶基因玉米中的表達(dá)效率和穩(wěn)定性，在不改變α -半乳糖 苷酶氨基酸序列的前提下，本發(fā)明將來源于Gibberella sp.F75的aga_F75基因 （GenBank 登錄號FJ392036)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，各氨基酸對應(yīng)的密碼子與玉米最適 密碼子更加匹配，GC含量由優(yōu)化前的51. 29%提高到優(yōu)化后的55. 82% ;密碼子適應(yīng)指數(shù) (Codon Adaptation Index，CAI)由優(yōu)化前的0· 71提高到優(yōu)化后的0· 82。
[0011] 通過采用上述優(yōu)化手段使優(yōu)化后的α -半乳糖苷酶基因 aga-F75m的密碼子使用 頻率更加符合玉米中高表達(dá)基因的情況，而且去除了可能影響基因轉(zhuǎn)錄翻譯的負(fù)面因素， 最終得到SEQ ID NO. 2所示的aga-F75m基因，密碼子優(yōu)化過程中沒有改變?nèi)鏢EQ ID NO. 3 所示的α-半乳糖苷酶氨基酸序列。
[0012] SEQ ID NO: 1 α -半乳糖苷酶基因 aga-F75核苷酸序列
【主權(quán)項】
1. 優(yōu)化a-半乳糖苷酶基因aga-F75,其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 包含權(quán)利要求1所述基因的植物表達(dá)載體。
3. 權(quán)利要求1所述基因用于在外源宿主中表達(dá)其編碼的酶的應(yīng)用。
4. 一種在植物中高效表達(dá)a -半乳糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法包括在植物 宿主中表達(dá)權(quán)利要求1所述優(yōu)化a -半乳糖苷酶基因aga-F75的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物宿主為玉米、油菜、大豆或小麥。
6. -種含a -半乳糖苷酶的植物飼料，其特征在于，所述飼料以表達(dá)權(quán)利要求1所述優(yōu) 化a -半乳糖苷酶基因aga_F75的植物宿主為原料制成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及適于在玉米中表達(dá)的優(yōu)化α-半乳糖苷酶基因aga-F75及其應(yīng)用，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明針對α-半乳糖苷酶在生產(chǎn)中的重要性，利用轉(zhuǎn)基因植物較微生物發(fā)酵生產(chǎn)具有的高效、簡便、環(huán)保等優(yōu)勢，并著力其分子量大、難以重組表達(dá)等技術(shù)難點，通過優(yōu)化的基因和載體，組織特異的高效表達(dá)等方式，首次進(jìn)行利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)該酶的研究，獲得了遺傳穩(wěn)定的植物材料。
【IPC分類】C12N15-82, A23K1-14, C12N9-40, A01H5-00, C12N15-56
【公開號】CN104805101
【申請?zhí)枴緾N201510098545
【發(fā)明人】姚斌, 楊培龍, 張宇宏, 楊文霞, 孟昆, 袁建華, 陳茹梅, 孟慶長, 張偉, 周曉今
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年3月6日