學(xué)合成全基因序列（全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交貨時 人工合成的基因片段連于載體PUC57上），記為P6。其基因全序列如序列表所示。具體的說， P6基因編碼的蛋白質(zhì)序列為天然人流感嗜血桿菌膜蛋白P6(accessionnumber:AAA24994) 的48-153aa。將含有該段人工合成的DNA片段的載體pUC57用NdeI及XhoI進(jìn)行雙酶切后 按常規(guī)方法回收目的片段，備用。同時采用NdeI及XhoI對載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切，并 按常規(guī)方法將經(jīng)雙酶切后獲得的P6基因連入pET-28a(+)載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10， 構(gòu)建PET-P6表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列測定證實表達(dá)載體構(gòu)建無誤。該載體表達(dá)重組P6-His 融合蛋白。
[0085] 2?重組P6-His融合蛋白的表達(dá)與純化
[0086] 將鑒定正確的陽性克隆菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，按常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)入感受態(tài) E.coliBL21 (DE3)plysS中，轉(zhuǎn)化完成后將菌液涂布于含50iig/mL卡那霉素的LB平板上， 按常規(guī)方法篩選表達(dá)菌株。挑取PET-P6轉(zhuǎn)化的具有外源蛋白表達(dá)能力的單個菌落并接種 入IOOmLLB培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)過夜。取出菌液后，按1:100接種于IOOmL含有50iig/ mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)至0D6。。= 0. 6時，加入lmol/LIPTG至終濃度為 lmmol/L，于30°C搖菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4h后于8000r/min下離心IOmin收 集菌體。將此菌體用 20mL磷酸鹽緩沖液（8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/ LNa2HP04pH= 7. 4)洗滌 3 次并用IOmL上樣緩沖液（20mMNa3PO4,0? 5MNaCl;30mM咪唑， pH7. 4)重懸后進(jìn)行超聲破碎，操作條件為：50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲 完成后，12000g離心15min分別收集沉淀和上清后進(jìn)行電泳檢測。發(fā)現(xiàn)重組P6-His融合蛋 白以可溶性表達(dá)方式存在于菌體中。
[0087] 將上述獲得的超聲破碎上清液用0.45iim的濾膜進(jìn)行過濾后用HisTrapaffinity columns(GEhealthcare公司產(chǎn)品），按照說明書的方法進(jìn)行重組P6_His融合蛋白的純化。 具體方法如下：
[0088] 1)用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0089] 2)用IOmL上樣緩沖液平衡，lmL/min流速。
[0090] 3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0091] 4)用IOmL上樣緩沖液，以lmL/min流速洗柱。
[0092]5)用IOmL洗脫緩沖液（20mMNa3PO4,0? 5MNaCl，300mM咪唑，pH7. 4)，以lmL/min 流速洗脫，分管收集，每管lml，12%SDS-PAGE檢測，合并洗脫組分中含有目的蛋白的樣品。 經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定后，調(diào)整濃度為0. 2mg/mL。
[0093](二）兔及鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的制備
[0094] 1.兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的制備
[0095] 用步驟（一）純化的重組P6-His融合蛋白按照200iig(lmL)與ImL弗氏完全 佐劑混勻乳化后免疫雄性新西蘭大白兔（由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供），于背部皮 下多點注射，間隔7d后再免疫一次，再過14d后用上述純化的重組P6-His融合蛋白按照 200iig(ImL)與ImL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進(jìn)行加強免疫,加強免疫7d后再按上述同 樣方法再加強免疫一次。7d后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復(fù)進(jìn)行一到兩次加強免 疫，至抗體滴度滿意（用ELISA法測定抗體效價大于IXIO5)。若滿意則心臟采血，分離血 清，以ProteinG親和層析柱（GEhealthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說明書純化多克 隆抗體IgG,用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖液（8g/L NaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4PH= 7. 4)調(diào)整為lmg/mL，-20°C保藏 備用，至此制得兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG。Westenblot試驗表明，此 多克隆抗體IgG能特異性識別人流感嗜血桿菌全長膜蛋白P6。
[0096] 2.鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的制備
[0097] 用步驟（一）純化的重組P6_His融合蛋白作為完全抗原免疫豚鼠（由湖北省疾 病預(yù)防控制中心提供），肩胛下注射抗原200yg/只?；A(chǔ)免疫為等體積的抗原與弗氏完全 佐劑進(jìn)行乳化，每隔2周進(jìn)行一次加強免疫，加強免疫用等體積抗原與等體積弗氏不完全 佐劑進(jìn)行乳化，總共免疫4次。末次免疫IOd后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復(fù)進(jìn)行 一到兩次加強免疫，至抗體滴度滿意（用ELISA法測定抗體效價大于IXIO5)。若滿意則處 死豚鼠取血清，以ProteinG親和層析柱（GEhealthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說明書 純化多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖 液（8g/LNaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4PH= 7. 4)調(diào)整為lmg/mL，備 用，至此制得鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG。Westenblot試驗表明，此多 克隆抗體IgG能特異性識別人流感嗜血桿菌全長膜蛋白P6。
[0098] 實施例2抗人流感嗜血桿菌免疫納米磁珠的制備
[0099] 1.抗人流感嗜血桿菌多克隆抗體偶聯(lián)磁珠反應(yīng)條件的優(yōu)化：
[0100] 以偶聯(lián)了抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體的磁珠作為固相載體，量子點 標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體作為檢測抗體，通過雙抗夾心法原理檢測 人流感嗜血桿菌抗原，觀察磁珠與多抗的偶聯(lián)情況。分別對磁珠的粒徑，以及EDC/NHS活化 劑濃度、偶聯(lián)抗體濃度、偶聯(lián)時間、封閉劑種類等偶聯(lián)條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化選擇。
[0101] 1. 1磁珠粒徑的選擇
[0102] 選擇粒徑為 50nm、180nm、350nm、1150nm、3um的竣基磁珠，均加入含 4mg/mlEDC 及4mg/mlNHS的PBS緩沖液進(jìn)行活化反應(yīng)后，分別與實施例1所描述的兔抗人流感嗜血桿 菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。分別將制備好的免疫納米磁珠檢測IO4CFUAiL 的人流感嗜血桿菌（ATCC編號53781)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，選擇熒光強度大，背景熒光 干擾少，以及在磁場作用下分離速度較快者為最適磁珠粒徑。結(jié)果表明粒徑350nm的磁珠 最符合本發(fā)明的要求，確定最適磁性微球粒徑為350nm。
[0103]I. 2EDC/NHS活化劑濃度的選擇
[0104] 將反應(yīng)體系中EDC和NHS濃度各自設(shè)為1~lOmg/ml后進(jìn)行濃度梯度組合，分別 活化粒徑350nm的羧基磁珠。將制備好的免疫納米磁珠檢測104CFU/mL的人流感嗜血桿菌 (ATCC編號53781)，選擇熒光最強者為EDC和NHS溶液的最適活化濃度。結(jié)果表明當(dāng)EDC 濃度為5mg/ml、NHS濃度為5mg/ml時偶聯(lián)效果最好。
[0105] 1.3偶聯(lián)抗體濃度的選擇
[0106]將 20ug、40ug、60ug、80ug、100ug、120ug、140ug的兔抗人流感嗜血桿菌膜 蛋白P6多克隆抗體IgG分別與Img按上述最優(yōu)方法活化的粒徑為350nm的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)。 將制備好的免疫納米磁珠檢測IO4CFUAiL的人流感嗜血桿菌（ATCC編號53781)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)抗體的投放量小于IOOug/mg時，熒光強度隨著抗體的濃度增加而增加，而當(dāng)抗體的質(zhì) 量濃度大于100Ug/mg時，熒光強度基本不變甚至略有減小，因此本實施例選擇兔抗人流 感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的偶聯(lián)量為100iig/mg。
[0107]I. 4偶聯(lián)時間的選擇
[0108] 確定磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度及抗體偶聯(lián)量后，將抗體與磁珠的偶聯(lián)反應(yīng) 時間分別設(shè)為〇. 5h、lh、2h、3h、4h、5h，將制備好的免疫納米磁珠檢測IO4CFUAiL的人流感嗜 血桿菌（ATCC編號53781)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)偶聯(lián)時間>3h時，熒光強度趨于穩(wěn)定，此后再延長 偶聯(lián)時間，熒光不再增強。因此，確定兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG與磁 珠的最適偶聯(lián)反應(yīng)時間為3h。偶聯(lián)時間遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)ELISA法的24h。
[0109] 1.5封閉劑的選擇
[0110] 按照上述確定的最優(yōu)條件選擇磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度、抗體偶聯(lián)量及偶 聯(lián)時間后進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)結(jié)束后，選擇BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖鹽酸鹽作為 免疫納米磁珠封閉劑，制得成品免疫納米磁珠。將制備好的免疫納米磁珠檢測IO4CFlVmL的 人流感嗜血桿菌（ATCC編號53781)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙醇胺作為封閉劑的免疫納米磁珠的 檢測熒光值最高。我們推測由于乙醇胺的分子較小，可以較好的消耗由于空間位阻未與抗 體結(jié)合的表面羧基，使封閉更為完全，并且有效減少空間位阻效應(yīng)對已連接抗體的結(jié)構(gòu)影 響。
[0111] 2.偶聯(lián)過程：
[0112] 取5mg磁珠（以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠）于I. 5ml普 通離心管中，用ImlMES緩沖液（2g/LMES，pH6. 0)洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁 分離（0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES緩沖液配制的濃度為lOmg/ml的EDC溶液及 用上述MES緩沖液配制的濃度為lOmg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以15rpm/min于旋 轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，磁分離后移除上清，用Iml上述的MES緩沖液重懸；取5個離心管，每 個離心管中加入200iiL上述活化的磁珠，磁分離后吸出上清，向各管中加入用PBS緩沖液 (8g/LNaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,pH7. 4)稀釋的濃度為 100iig/ ml的實施例I所制備的兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG溶液各lml，室溫 下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h,磁分離移除上清后,各加入Iml含lmg/ml乙醇胺 的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反 應(yīng)的羧基。磁分離后移除各管上清，各用Iml洗滌緩沖液（8g/LNaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/ LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0. 5ml/LTween-20,pH7. 4)洗滌三遍，最后各用Iml保存緩沖液 (8g/LNaCL, 0. 2g/LKC1,0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0. 3g/LNaN3, 5g/LBSA,pH7. 4) 重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 實施例3量子點標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針的制備
[0114] 1.納米羧基量子點標(biāo)記鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG反應(yīng)條件 的優(yōu)化：
[0115]I. 1、羧基量子點標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記pH的確定
[0116] 將標(biāo)記反應(yīng)中磷酸鹽緩沖液pH分別設(shè)為5,6, 7,8,9,對標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn) 行熒光強度測定，觀察不同PH值對偶聯(lián)反應(yīng)的影響，確定了量子點標(biāo)記多抗反應(yīng)的最佳pH 為7. 0-8.0。本實驗選擇pH7. 4。
[0117] 1. 2、羧基量子點標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記量的確定
[0118]將量子點摩爾濃度與多抗?jié)舛戎确謩e設(shè)置為I:I，