Hib綜合培養(yǎng)基、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及疫苗生產(chǎn)制備工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種HIB綜合培養(yǎng)基、B型流感 嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感嗜血桿菌化aemo地ilusInfluenzae,HI)是一種革蘭氏陰性短小桿菌，是引 起小兒呼吸系統(tǒng)原發(fā)性感染和病毒性疾病時(shí)繼發(fā)感染的重要致病菌。通常有芙膜型和非芙 膜型兩大類。按其芙膜多糖抗原的特異性可分為a-f六個(gè)血清型和一組不可分型的流感嗜 血桿菌。其中b型流感嗜血桿菌的致病性最強(qiáng)，f次之，可引起多器官、組織的侵襲性感染。 從發(fā)達(dá)國(guó)家的流行病學(xué)資料可知，b型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎約占小兒化脈性腦膜炎 的一半左右，且具有發(fā)病率高、死亡率高和致死率高的特點(diǎn)。雖然臨床上對(duì)b型流感嗜血桿 菌有多種抗生素可治療，但由于細(xì)菌抗藥性不斷增加，b型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎、肺 炎死亡率高，加之在抗生素治療有效的情況下也不能阻止神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生，給臨床 治療帶來(lái)了很大的困難。
[0003] b型流感嗜血桿菌的主要致病能力是其表面的芙膜，運(yùn)個(gè)芙膜使細(xì)菌具有了抵抗 吞隧細(xì)胞和防止血清殺菌物質(zhì)殺菌的能力。b型流感嗜血桿菌芙膜多糖（CP巧由若干個(gè)多 聚核糖基核糖醇一憐酸鹽（PR巧組成?；糱型流感嗜血桿菌感染性疾病后血清中可產(chǎn)生抗 特異性(PS抗體。從其血清流行病學(xué)可見(jiàn)，b型流感嗜血桿菌芙膜多糖（CP巧是b型流感 嗜血桿菌有效的保護(hù)性抗原，理想的疫苗應(yīng)該是能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗CPSIgG抗體，其抗體水 平> 0. 15ug/ml和> 1.Oug/ml，才能分別為嬰兒提供短期和長(zhǎng)期的免疫保護(hù)。
[0004] b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗可有效地預(yù)防其疾病的發(fā)生，顯著地降低b型流感嗜 血桿菌侵襲性疾病的發(fā)病率，保護(hù)嬰幼兒的健康。目前，現(xiàn)有的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗 生產(chǎn)工藝，其關(guān)鍵步驟存在工藝復(fù)雜、成本較高，并且所制得的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗 不穩(wěn)定，含有血源性成分且容易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，核酸、蛋白、內(nèi)毒素含量高；同時(shí)，用于培養(yǎng) b型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)基均含有血源性成分和大分子過(guò)敏原性成分，從而影響疫苗生產(chǎn) 安全，另外，現(xiàn)有的用于培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)基的組成成分最少為12種，最多可達(dá) 至IJ14、15種，運(yùn)無(wú)形之中增加了培養(yǎng)基成本，而且成分越多越復(fù)雜，可能給b型流感嗜血桿 菌結(jié)合疫苗帶來(lái)不利影響。
[0005] 從已有的醫(yī)院流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和人群流行病學(xué)報(bào)道結(jié)果看，雖然b型流感嗜血桿菌 引起腦膜炎的發(fā)病率較工業(yè)化國(guó)家低，但b型流感嗜血桿菌也是造成我國(guó)嬰幼兒下呼吸道 急性感染的重要病原菌之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有用于培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌的培養(yǎng)基存在的組分多、成本高、含有 血源性成分和大分子過(guò)敏原性成分W及現(xiàn)有b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵 步驟存在工藝復(fù)雜、成本較高，并且所制得的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗不穩(wěn)定，含有血源 性成分且容易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，核酸、蛋白、內(nèi)毒素含量高的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種無(wú)血源性 成分和大分子過(guò)敏原性成分的HIB綜合培養(yǎng)基、一種B型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其制備 方法。
[0007] 本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明的HIB綜合培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中各成分及其終濃度為：
[0009] 酵母浸出粉5~15g/l，
[0010] 葡萄糖 5 ~15g/l，
[0011] MgClz? 6&0 1 ~3g/l，
[0012] P-輔酶A0. 01 ~0. 03g/l，
[0013] 氯化血紅素 0. 005 ~0. 02g/l，
[0014] 胞2冊(cè)〇4 ? 12&0 22 ~32g/l，
[0015] 胞帖〇4 ? 2&0 2 ~5g/l;
[0016] 該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過(guò)敏原性成分。
[0017] 優(yōu)選的，該培養(yǎng)基中各成分及其終濃度為：
[001引酵母浸出粉lOg/1，
[001引葡萄糖lOg/1，
[0020] MgClz? 6&0 2. 03g/l，
[0021] P-輔酶A0. 02g/l，
[0022] 氯化血紅素0.Olg/1，
[0023] 胞2冊(cè)〇4 ? 12&0 28. 65g/l，
[0024] Na&PO* ? 2&0 3. 12g/l;
[0025] 該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過(guò)敏原性成分。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種B型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，它是利用上述的HIB綜合培養(yǎng) 基制備而成的。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述的B型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法，該方法包括W下 步驟：
[0028] 步驟一、菌種接種與培養(yǎng)
[0029] 菌種采用編號(hào)為CCMC58534的b型流感嗜血桿菌，培養(yǎng)基采用HIB綜合培養(yǎng)基， 該培養(yǎng)基中各成分及其終濃度為：酵母浸出粉5~15g/l，葡萄糖5~15g/l，MgClz? 6&0 1 ~3g/l，P-輔酶A0. 01 ~0. 03g/l，氯化血紅素 0. 005 ~0. 02邑/1，胞2冊(cè)〇4 *12&0 22 ~ 32g/l，NaH2P〇4 ? 2&0 2~5g^ ;該培養(yǎng)基不含有血源性成分和大分子過(guò)敏原性成分；
[0030] 步驟二、對(duì)步驟一所獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行殺菌；
[0031] 步驟S、去核酸
[0032] 室溫條件下，將殺菌后的培養(yǎng)液離屯、收集上清液，按照上清液與十六烷基=甲基 漠化錠溶液的體積比為10:1的比例加入十六烷基=甲基漠化錠溶液，使上清液終濃度為 0. 1%，混勻后靜置4小時(shí)W上，離屯、收集沉淀物并于沉淀物中加入Imol/L氯化鋼溶液，將 沉淀物稀釋至40~50mg/ml，補(bǔ)加與沉淀稀釋物等體積的注射用水，再加入乙醇至其終濃 度為25%，于2~8°C靜置4小時(shí)W上離屯、收集上清液；
[003引步驟四、沉淀多糖
[0034] 于收集的上清液中加入乙醇至其終濃度為75%，于2~8°C靜置4小時(shí)W上離屯、 收集沉淀物，用無(wú)水乙醇和丙酬依次洗涂沉淀物并真空干燥，所得固體即為多糖粗制品；
[0035] 步驟五、多糖精制
[0036]將多糖粗制品溶解于1/10飽和醋酸鋼溶液中，使多糖粗制品濃度為4~lOmg/ml， 混勻后加入等體積、抑為7. 0的冷酪溶液，離屯、收集上清液，酪提取法提取兩次并合并上 清液，用Imol/L氯化鋼溶液、膜超濾去除殘留苯酪，再加入乙醇至其終濃度為75%，于2~ 8°C靜置4小時(shí)W上，離屯、收集沉淀物，用無(wú)水乙醇和丙酬依次洗涂沉淀物并真空干燥，所 得固體即為精制多糖；
[0037] 步驟六、多糖的衍生
[003引將精制多糖用0. 85%氯化鋼溶液溶解，精制多糖與0. 85%氯化鋼溶液的比例為：lOmg: 1ml，再加入漠化氯溶液對(duì)精制多糖進(jìn)行活化，精制多糖與漠化氯的比例為：2mg:Img， 反應(yīng)3~10分鐘后調(diào)節(jié)抑至8. 5,向反應(yīng)液中加入等體積、濃度為0. 25mol/L、經(jīng)過(guò)0. 85% 氯化鋼溶液溶解的己二酷阱溶液，反應(yīng)25~35分鐘，于2~8°C攬拌過(guò)夜；反應(yīng)液用0. 85% 氯化鋼溶液、膜超濾去除殘留漠化氯和己二酷阱，濃縮至多糖含量24mg/mlW上，獲得多 糖衍生物；
[00測(cè)步驟屯、載體蛋白
[0040] 載體蛋白采用破傷風(fēng)類毒素，對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液進(jìn)行純化，收集分子量為150kD 的洗脫液，再采用截留分子量為lOkD的超濾膜將純化的破傷風(fēng)類毒素超濾濃縮至24mg/ml W上，除菌過(guò)濾并分裝；
[0041] 步驟八、多糖衍生物與載體蛋白的結(jié)合
[0042] 將多糖衍生物與純化的破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，調(diào)節(jié)pH至5. 5~5. 8,加入經(jīng)過(guò) 0. 85%氯化鋼溶液溶解的碳二亞胺溶液，使終濃度為0. 05mol/l，并且使多糖衍生物和破傷 風(fēng)類毒素的終濃度均為lOmg/ml，維持抑5. 6反應(yīng)4小時(shí)；用截留分子量為10KD的膜包超 濾，獲得多糖蛋白結(jié)合物；
[0043] 步驟九、多糖蛋白結(jié)合物純化
[0044] 對(duì)超濾后的多糖蛋白結(jié)合物進(jìn)行純化，收集洗脫液，除菌過(guò)濾后獲得