利用人副流感2型病毒載體的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可作為用于預(yù)防或治療疾病的疫苗使用的RNA病毒載體及滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 副粘病毒科的病毒具有負(fù)單鏈RNA作為基因組，已制作出了能夠利用逆向遺傳學(xué) 方法高度表達(dá)外源基因的載體，認(rèn)為其具有作為基因治療用載體或基因重組疫苗用載體的 優(yōu)異特性。由于病毒的生命周期不包含DNA期（DNA phase)，并且轉(zhuǎn)錄?復(fù)制全部在處于核 外的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，因此，與染色體DNA發(fā)生同源性重組的概率極小，由于對染色體的基因 重組而致癌的風(fēng)險(xiǎn)小。
[0003] 目前為止，本申請的發(fā)明人試圖將人副流感2型病毒（其為負(fù)單鏈RNA病毒，屬于 副粘病毒科副粘病毒亞科聰腺炎病毒（Rubulavirus)屬，下文記作hPIV2)載體化，研宄了 其作為疫苗及基因治療用載體的應(yīng)用。
[0004] 在研宄過程中，構(gòu)建了 F基因（病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)）完全缺失了的、hPIV2 的F基因缺失型載體。該載體具有非傳播性（non-transmissible)或單輪感染性 (single-round-infectious)的特性。此外，還成功獲得了具有高效價(jià)（high titer)的 載體產(chǎn)生能力的穩(wěn)定表達(dá)F基因的包裝細(xì)胞，該細(xì)胞可用于F基因缺失型載體的生產(chǎn)。缺 失F基因的該載體，僅能在表達(dá)有F基因的包裝細(xì)胞中產(chǎn)生將F蛋白質(zhì)保持于病毒被膜 上的感染性載體。另一方面，在不表達(dá)F基因的細(xì)胞?組織中，盡管發(fā)生所謂的自身復(fù)制 (self-replication)，但不能產(chǎn)生感染性的載體，因此，載體不會在受體中無窮盡地增殖， 可以認(rèn)為其安全性較高（專利文獻(xiàn)1)。
[0005] 已報(bào)道了許多使用基因重組RNA活病毒載體或弱毒化RNA重組病毒的疫苗或基 因治療在非臨床試驗(yàn)、臨床研宄、臨床試驗(yàn)等中顯示出有效性的結(jié)果（非專利文獻(xiàn)1~9)。 但是，目前還沒有報(bào)道被美國食品藥品監(jiān)督管理局及歐州藥品廳批準(zhǔn)為藥品的基因重組活 (live) RNA病毒載體制劑。推測其理由為：使用基因重組的活RNA病毒作為載體時(shí)，雖然采 取了利用弱毒化病毒以降低病原性、或利用非傳播型載體等安全層面上的對策，但在感染 細(xì)胞內(nèi)仍大量產(chǎn)生病毒及外源基因產(chǎn)物，因此不能徹底消除對恒常性（homeostasis)的影 響或外源基因的突變等的憂慮。
[0006] 因此，可以說將基因組滅活或分解為組分（component)從而使病毒不進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄?復(fù)制的疫苗的安全性較高。滅活疫苗的制作多采用使用福爾馬林的處理方法。
[0007] 但是，被認(rèn)為安全性較高的滅活疫苗也存在安全性上的問題。20世紀(jì)60年代開發(fā) 出了針對屬于副粘病毒科的RSV的、利用福爾馬林獲得的滅活RSV疫苗，接種該疫苗后，由 于RSV的自然感染，導(dǎo)致嬰幼兒中出現(xiàn)了重癥患者和2名死亡者。之后全力進(jìn)行了對其原因 的闡明。發(fā)現(xiàn)了利用福爾馬林對病毒進(jìn)行滅活處理導(dǎo)致F膜蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 發(fā)現(xiàn)：通過接種該疫苗，產(chǎn)生的是不具有對改性后的F膜蛋白質(zhì)的中和活性的抗體，而由于 經(jīng)過福爾馬林處理而不存在正常結(jié)構(gòu)的F膜蛋白質(zhì)，卻沒有產(chǎn)生對該蛋白質(zhì)具有中和活性 的抗體。并且，認(rèn)為在接種該疫苗后，由于RSV病毒的自然感染，使得機(jī)體反應(yīng)欲要抑制病 毒的增殖時(shí)，將過量產(chǎn)生沒有中和活性的抗體。結(jié)果，在通常的RSV感染中觀察不到的那樣 多數(shù)的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤至肺組織，隨之IL-4、IL-5等細(xì)胞因子升高，也不能誘導(dǎo)局部IgA 抗體、細(xì)胞免疫，從而引起了重癥化。
[0008] 此外，已知福爾馬林滅活RSV使樹突狀細(xì)胞（其為抗原呈遞細(xì)胞）成熟的能力比 活RSV差，故研宄了利用不使用福爾馬林的UV處理、熱處理等進(jìn)行的滅活，但無論采用哪種 處理，將樹突狀細(xì)胞活化的能力均較低，并且還誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，因此未實(shí)現(xiàn)實(shí)用化。同樣地， 對于屬于副粘病毒科的麻瘆病毒的福爾馬林滅活疫苗，也報(bào)道了嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤和異 型麻瘆。
[0009] 另一方面，有報(bào)道稱在動(dòng)物試驗(yàn)中設(shè)法使其能夠誘導(dǎo)Thl型免疫的滅活RSV疫苗 具有能預(yù)防病毒感染的效果，認(rèn)為能誘導(dǎo)Thl的滅活疫苗具有可解決上述問題的可能性。
[0010] 雖然認(rèn)為由病毒載體引起的導(dǎo)入基因在體內(nèi)的表達(dá)較高，但報(bào)道了病毒感染細(xì) 胞?組織中的導(dǎo)入基因的表達(dá)沒有定量性或表達(dá)量低、作為基因治療用載體的實(shí)效性不高 的例子。此外，還報(bào)道了先前存在的抗體對導(dǎo)入的病毒載體的表達(dá)的抑制或伴隨多次的病 毒載體施予而發(fā)生的抗體對該載體的表達(dá)的抑制。在需要基因表達(dá)達(dá)到某一定量以上（即 使僅為暫時(shí)達(dá)到）的基因治療中使用抗體誘導(dǎo)能力高的病毒載體的困難程度從這些報(bào)道 例可見一斑。
[0011] 向病毒載體中導(dǎo)入外源基因并使其表達(dá)時(shí)，由于外源基因產(chǎn)物不具有包裝信號， 因此外源基因產(chǎn)物通常不被包含于載體中，病毒載體在體內(nèi)施予后感染受體細(xì)胞，由此發(fā) 生轉(zhuǎn)錄?復(fù)制，才能產(chǎn)生外源基因產(chǎn)物。因此，病毒載體的感染、轉(zhuǎn)錄?復(fù)制等被中和抗體 等阻礙時(shí)，外源基因的表達(dá)將被抑制或降低。
[0012] 此外，在體內(nèi)，病毒對細(xì)胞?組織的感染效率低，或者病毒即使感染也不發(fā)生轉(zhuǎn)錄 復(fù)制或效率非常差、外源基因幾乎不表達(dá)的情況也很多。認(rèn)為其原因是：在體內(nèi)的感染細(xì)胞 中，病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制被由病毒感染誘導(dǎo)的干擾素等抑制為較低水平，細(xì)胞外基質(zhì)等使得病 毒載體無法到達(dá)靶細(xì)胞，等等。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014] 專利文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn) 1 :W02012/108195
[0016] 非專利文獻(xiàn)
[0017]非專利文獻(xiàn) 1 :Vitology. 377 (2)，225 (2008)
[0018]非專利文獻(xiàn) 2 :Virology. 362 (1)，139 (2007)
[0019]非專利文獻(xiàn) 3 :Vitology. 16(11)，21883(2008)
[0020]非專利文獻(xiàn) 4 :Vaccine. 28, 2771，（2010)
[0021]非專利文獻(xiàn) 5:JVirol. 6521，（2011)
[0022]非專利文獻(xiàn) 6:JVirol. 1089,（2002)
[0023]非專利文獻(xiàn) 7 :Vaccine. 29, 8557,（2011)
[0024]非專利文獻(xiàn) 8:JVirol. 584,（2009)
[0025]非專利文獻(xiàn) 9:VetImmunolImmunopathol. 146 (1), 92 (2012)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 本發(fā)明的目的在于提供能夠高效地向靶細(xì)胞中導(dǎo)入抗原多肽（包括蛋白質(zhì)和肽） 的病毒載體及滅活載體，其是作為預(yù)防或治療疾病用的疫苗有用的副粘病毒科的病毒載 體。
[0027] 本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使病毒載體的結(jié)構(gòu)基因與抗原蛋白質(zhì)或肽的基因以融 合的方式表達(dá)，能夠高效且定量地將抗原蛋白質(zhì)或肽運(yùn)送至靶細(xì)胞。
[0028] 此外，發(fā)明人成功構(gòu)建了以下4種類型的載體：類型1)，將抗原基因配置于膜蛋白 質(zhì)HN基因的3'末端側(cè)（以下記作編碼鏈），由此以使得抗原處于在載體被膜的外部的形式 使抗原肽表達(dá)；類型2)，將抗原基因配置于F包裝細(xì)胞的F基因的3'末端側(cè)，由此使得抗 原肽在載體被膜的內(nèi)部表達(dá)；類型3)，組合上述1)和2)，由此使得抗原肽在載體被膜的內(nèi) 部和外部兩處均表達(dá)；以及類型4)，將抗原與作為向病毒的包裝信號發(fā)揮作用的膜蛋白質(zhì) 的膜?細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，由此在載體上整合進(jìn)抗原。由此，向多個(gè)抗原的載體中進(jìn)行各種 各樣的導(dǎo)入成為可能。
[0029] 即，本發(fā)明涉及能夠?qū)⒖乖嚯母咝У貍鬟f至靶細(xì)胞中的病毒載體，具體而言提 供如下所述的發(fā)明：
[0030] [1]病毒載體，是在副粘病毒科病毒的基因中整合有編碼抗原多肽的基因的病毒 載體，在所述病毒載體中，所述抗原多肽以與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或它們的一部分融合的融 合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)。
[0031] [2]如[1]所述的病毒載體，其中，融合蛋白質(zhì)是與病毒的HN蛋白質(zhì)、F蛋白質(zhì)及 M蛋白質(zhì)中的一種或兩種以上或它們的一部分融合的融合蛋白質(zhì)。
[0032] [3]如[1]或[2]所述的病毒載體，其特征在于，
[0033] 1)編碼抗原多肽的基因配置于HN基因的3'末端側(cè)，抗原多肽在載體被膜的外部 表達(dá)；
[0034] 2)編碼抗原多肽的基因配置于F基因的3'末端側(cè)，抗原多肽在載體被膜的內(nèi)部表 達(dá)；或
[0035] 3)編碼抗原多肽的基因分別配置于HN基因的3'末端側(cè)及F基因的3'末端側(cè)，抗 原多肽在載體被膜的外部和內(nèi)部兩方表達(dá)。
[0036] [4]如[1]或[2]所述的病毒載體，其特征在于，使抗原多肽與作為病毒包裝信號 的F膜蛋白質(zhì)或HN膜蛋白質(zhì)的膜?細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，將抗原多肽保持在載體被膜上。
[0037] [5]如[1]~[4]中任一項(xiàng)所述的病毒載體，其中，病毒為F蛋白質(zhì)缺失型副粘病 毒科病毒。
[0038] [6]如[1]~[5]中任一項(xiàng)所述的病毒載體，其中，病毒為經(jīng)核酸滅活處理的病毒。
[0039] [7]如[6]所述的病毒載體，其中，核酸滅活處理盡量不改變（不實(shí)質(zhì)性地改變） 病毒被膜的結(jié)構(gòu)。
[0040] [8]如[1]~[7]中任一項(xiàng)所述的病毒載體，其中，抗原多肽為流感病毒的M2e蛋 白質(zhì)或其片段。
[0041][9]如[1]~[7]中任一項(xiàng)所述的病毒載體，其中，抗原多肽為選自由下述病毒 的抗原肽、下述細(xì)菌的抗原肽、或RSV的F蛋白質(zhì)、癌抗原gplOO、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/ MARTI、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1 及 PSA 組成的組中的任一種或兩種以上、 或它們的片段，所述病毒選自包括強(qiáng)毒型流感病毒在內(nèi)的流感病毒、副流感3型病毒、 RS病毒、亨德拉病毒（Hendravirus)、SARS病毒、尼帕病毒（Nipahvirus)、拉沙病毒 (Lassavirus)、登革病毒（Denguevirus)、西尼羅病毒（WestNilevirus)、人偏肺病毒 (humanmetapneumovirus)、埃博拉病毒（Ebolavirus)、漢坦病毒（Hantavirus)、艾滋病 病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus)、風(fēng)瘆病毒、輪狀 病毒（Rotavirus)、諾如病毒（Norovirus)、剛果-克里米亞出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagicfevervirus)、皰疼病毒（herpesvirus)、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus) 及乳頭瘤病毒（papillomavirus)，所述細(xì)菌選自A組|3型溶血性鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis)、霍亂弧菌及支原體。
[0042] [10]制造副粘病毒科的病毒載體的方法，所述病毒載體以與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或 它們的一部分融合的融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)抗原多肽，所述方法包括下述各工序：
[0043] 將在病毒基因中整合有編碼融合蛋白質(zhì)的基因的副粘病毒科的病毒與Vero細(xì)胞 共培養(yǎng)；
[0044] 然后從培養(yǎng)上清液中分尚病毒顆粒。
[0045] [11]如[10]所述的方法，其中，融合蛋白質(zhì)為與病毒的HN蛋白質(zhì)、F蛋白質(zhì)及M 蛋白質(zhì)中的一種或兩種以上或它們的一部分融合的融合蛋白質(zhì)。
[0046] [12]如[10]或[11]所述的方法，融合蛋白質(zhì)為選自病毒的HN蛋白質(zhì)或F蛋白質(zhì) 的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中的融合蛋白質(zhì)。
[0047] [13]如[10]~[12]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，抗原多肽如下進(jìn)行表達(dá)，
[0048] 1)以融合于HN蛋白質(zhì)的C末端側(cè)的方式在載體被膜的外部表達(dá)，
[0049] 2)以融合于F蛋白質(zhì)的N或C末端側(cè)或HN蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的方式在載體被膜 的內(nèi)部表達(dá)，或
[0050] 3)以分別融合于HN蛋白質(zhì)的C末端側(cè)及F蛋白質(zhì)的N或C末端側(cè)或HN蛋白質(zhì)的 N末端側(cè)的方式在載體被膜的外部和內(nèi)部兩方表達(dá)。
[0051] [14]如[10]~[12]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，抗原多肽與病毒的HN蛋 白質(zhì)或F蛋白質(zhì)的膜?細(xì)胞內(nèi)區(qū)域融合，抗原多肽被包含于載體被膜上。
[0052] [15]如[10]~[14]中任一項(xiàng)所述的方法，包括下述工序：
[0053] 將缺失