人抗凝血酶iii的膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床檢驗領(lǐng)域。具體而言，涉及一種利用膠乳增強免疫比濁方法測定 樣本中人抗凝血酶III含量的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗凝血酶（Antithrombin)簡稱AT,血楽源性AT簡稱為pAT。pAT是體內(nèi)重要的天 然抗凝蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物家族成員。其血楽濃度約為100至150iig/ml(2至 3ymol/L)。pAT由肝臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種維生素K依賴的、由432個氨基酸組成 的分子質(zhì)量為58kDa的單鏈糖蛋白，含4個N糖基化寡糖鏈及3個二硫鍵。根據(jù)其135位 的天門冬酰胺是否含糖基可分為含糖基的a異構(gòu)體及無糖基的P異構(gòu)體。由于a異構(gòu) 體135位的糖基可以阻止與肝素的結(jié)合，故其與肝素的親和力小于P異構(gòu)體?，F(xiàn)還通過轉(zhuǎn) 基因綿羊獲得了重組抗凝血酶，簡稱rAT。MasaakiHirose等在中國倉鼠卵巢細(xì)胞上表達(dá)了 rAT，通過成批發(fā)酵使其產(chǎn)量達(dá)到lg/L。純化的rAT具有pAT的特異活性，減少了糖基量，增 強了與肝素的親和力。
[0003] 抗凝血酶III(AT-III)是作為血液中活性凝血因子的最重要的阻礙因子，它控制 著血液的凝固和纖維蛋白的溶解。血液中抗凝血酶III的水平根據(jù)各種疾病、癥狀而變化。 在彌散性血管內(nèi)凝血（DIC)、肝疾患、腎病綜合征等中降低。血液中的抗凝血酶III水平降 低可能會導(dǎo)致肝素治療效果無法呈現(xiàn)。因此，掌握抗凝血酶III的活性作為對于此類疾病 的監(jiān)測、病態(tài)分析、預(yù)后判定以及肝素治療或使用抗凝血酶III濃縮制劑投藥時的指標(biāo)具 有重要意義。
[0004] 抗凝血酶III水平增高：可導(dǎo)致出血。可見于先天性凝血因子缺乏，如血友??；后 天性凝血因子缺乏，如急性肝炎、腎移植、使用抗凝藥物等。
[0005] 抗凝血酶III水平減低：可導(dǎo)致血栓形成。可見于先天性抗凝血酶III缺乏和功能 異常，如肺梗塞、深部靜脈血栓等血栓性疾??；后天性減低，如DIC、慢性肝病、心肌梗塞等。
[0006] 抗凝血酶III的檢測方法較多，傳統(tǒng)的包括免疫火箭電泳法、凝膠空斑法、發(fā)色底 物法等。其中發(fā)色底物方法（參見公開號CN102690862A)是目前最常用的方法。但是該方 法需要特殊儀器，且所需時間較長。由于抗凝血酶III在人體內(nèi)減少時具有重要的臨床意 義，因此開發(fā)出一種高靈敏度的檢測試劑十分有意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一些【具體實施方式】，提供了一種人抗凝血酶III的膠乳增強免疫比 濁法檢測試劑盒，其包含第一試劑和第二試劑，其中：
[0008] 第一試劑包含穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、電解質(zhì)、促凝劑及緩沖液；
[0009] 第二試劑包含穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、電解質(zhì)、包被有抗人抗凝血酶III多 克隆抗體的膠乳顆粒、及緩沖液。
[0010] 在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還可以根據(jù)需要包括校準(zhǔn)品。校準(zhǔn)品用于標(biāo) 準(zhǔn)曲線的繪制。因此，校準(zhǔn)品可以自行配制、也可以使用任何市售校準(zhǔn)品。在一些具體實施 方式中，校準(zhǔn)品包含防腐劑、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、人抗凝血酶III及緩沖液。在一些具體實施方 式中,抗凝血酶III在校準(zhǔn)品中的含量在O至lOOOng/ml之間。在一些【具體實施方式】中，抗 凝血酶III源自人的體液并且純度> 95% ;例如從人體體液中天然提取并純化獲得。
[0011] 在一些【具體實施方式】中，校準(zhǔn)品包含四個濃度水平的抗凝血酶III，其中一個濃度 水平不含抗凝血酶III;其余校準(zhǔn)品中分別添加有不同含量的抗凝血酶III。在一些具體 實施方式中，校準(zhǔn)品包含質(zhì)量百分比〇. 1至1%的穩(wěn)定劑、質(zhì)量百分比〇. 01%至〇. 1%的防 腐劑、質(zhì)量百分比〇. 1至5. 0%的電解質(zhì)、10至lOOmmol/L的pH6. 5至8. 0的緩沖液、已知 濃度的人抗凝血酶III以及人血清基質(zhì)。人血清基質(zhì)可以合法收集自醫(yī)療機構(gòu)的健康人血 清，經(jīng)滅活之后去除肝炎、HIV病毒傳播風(fēng)險；也可以是市售人血清基質(zhì)。
[0012] 在一些實施方案中，抗人抗凝血酶III多克隆抗體源自哺乳動物的IgG抗體，優(yōu)選 羊IgG抗體、或兔IgG抗體。
[0013] 在一些實施方案中，膠乳顆粒的直徑范圍為50至250nm、優(yōu)選100至200nm、更優(yōu) 選150nm。在一些實施方案中，膠乳顆粒在試劑中的濃度為0. 5至5mg/mL。
[0014] 在一些實施方案中，膠乳顆粒為聚苯乙烯膠乳顆粒。膠乳顆粒表面修飾有官能團， 官能團選自羧基、氨基、羥基、酰肼、氯甲基中的一種；優(yōu)選羧基。通過這些官能團，將抗體連 接至膠乳顆粒上。在一些實施方案中，采用化學(xué)交聯(lián)法將抗體包被到膠乳顆粒表面，其中所 用的化學(xué)交聯(lián)劑選自：碳二亞胺（EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)、N-羥基硫代琥珀酰亞 胺（Sulfo-NHS)、酰肼、異氰酸酯中的一種或兩種；交聯(lián)緩沖液是不含氨基的緩沖液，選自 MES、M0PS0、MOPS、HEPES、磷酸鹽緩沖液中的一種；交聯(lián)緩沖液的pH在6. 0至8. 0之間。
[0015] 在一些實施方案中，第一試劑和第二試劑中的電解質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、氯化 鎂、硫酸鎂中的一種或幾種；優(yōu)選氯化鈉。電解質(zhì)在試劑中的濃度在〇. 1至5. 0%之間。
[0016] 在一些實施方案中，穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、酪蛋白、魚皮明膠蛋白、葡萄糖、果 糖、甘露糖、殼聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二鈉中的一種或幾種；穩(wěn)定劑濃度為〇. 1至1%。
[0017] 在一些實施方案中，所述促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖 鈉中的一種，優(yōu)選PEG-6000 ;促凝劑濃度在2至4%之間。
[0018] 在一些實施方案中，表面活性劑選自吐溫、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚、 聚氧乙烯月桂醚中的一種或幾種；優(yōu)選吐溫。表面活性劑濃度在質(zhì)量百分比0. 1至1. 0% 之間。
[0019] 本發(fā)明提供一種人抗凝血酶III的膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒，其包含第一 試劑、第二試劑和校準(zhǔn)品，其中：
[0020] 第一試劑包含：
[0021]
[0022]
[0023] 第二試劑包含：
[0024]
[0025] 包被有抗人抗凝血酶III多克隆抗體的膠乳顆粒，0. 5至5mg/mL，優(yōu)選lmg/mL;其 中抗人抗凝血酶III多克隆抗體優(yōu)選0. 6mg/mL,
[0026] 其中膠乳顆粒為粒徑150nm的羧基修飾聚苯乙烯膠乳；
[0027] 校準(zhǔn)品包含：
[0028]
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，提供了一種人抗凝血酶III的膠乳增強免疫比 濁法檢測試劑盒，其包含第一試劑、第二試劑和校準(zhǔn)品，其中：
[0030] 第一試劑包含：
[0031]
[0032] 第二試劑包含：
[0033]
[0034] 包被有抗人抗凝血酶III多克隆抗體的膠乳顆粒lmg/mL，其中羊抗人抗凝血酶 III多克隆抗體為0? 6mg/mL，
[0035] 其中膠乳顆粒為粒徑150nm的羧基修飾聚苯乙烯膠乳；
[0036] 校準(zhǔn)品包含：
[0037]
[0038] 本發(fā)明試劑盒，采用膠乳增強免疫比濁法定量檢測抗凝血酶III。其原理是：利用 化學(xué)交聯(lián)法將特異性羊抗人抗凝血酶III多克隆抗體包被到膠乳粒子表面，當(dāng)被測樣本中 有抗凝血酶III抗原時發(fā)生抗原抗體免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，保持反 應(yīng)體系中抗體過量時，形成的復(fù)合物可與鄰近的膠乳顆粒連接，最終交織成網(wǎng)狀引起反應(yīng) 體系濁度的顯著變化，此時反應(yīng)體系濁度的變化與被測樣本中抗凝血酶III的量成正比關(guān) 系，測定此濁度在570nm波長處的吸光度，對照校準(zhǔn)曲線即可求出樣本中抗凝血酶III的含 量。
[0039] 本發(fā)明的試劑盒特異性強、靈敏度高、均一穩(wěn)定使用簡便的特點，適合產(chǎn)業(yè)化，便 于臨床推廣。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明試劑盒的靈敏度。
[0041] 圖2為本發(fā)明試劑盒的線性圖。
[0042] ?均值；均值 +2. 6SD; ▲均值-2. 6SD。
[0043] 圖3為本發(fā)明試劑盒與發(fā)色底物方法試劑盒檢測臨床樣本的相關(guān)性比較。
【具體實施方式】
[0044] 以下實施例是對本發(fā)明的說明和進(jìn)一步解釋，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明 的精神和權(quán)利保護范圍內(nèi)所做的任何修改，都落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0045] 實施例1:親和純化法制備羊抗人抗凝血酶III多克隆抗體
[0046] 具體步驟如下所述：
[0047] (1)每個免疫實驗中使用8至10只羊，在免疫開始前，收集動物血清。從這些血清 中純化的IgG抗體作為對照。
[0048] (2)將0?Img高度純化的人抗凝血酶III抗原（來自Fitzgerald)溶解在pH7. 8 的磷酸鹽緩沖液中，用弗氏完全佐劑乳化，注射到羊的肌肉中，每4周重復(fù)注射。在注射起 始后10周，收集血清，并且通過氯化銨沉淀，初步分離來自血清的IgG抗體組分。
[0049] (3)羊抗人抗凝血酶III的多克隆抗體的純化：
[0050] 制備親和純化所用的分離柱：按照產(chǎn)品說明，將IOmg高度純化的人抗凝血酶III 抗原固定在HITRAPNHS-活性HP