不含明膠的疫苗保護劑組合物及流感減毒活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種不含明膠的液體疫 苗保護劑組合物，以及包含所述液體疫苗保護劑組合物的流感減毒活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒是由流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的急性呼吸道感染疾病。 流感病毒分為甲（A)、乙（B)、丙（C)三個型別，其中甲型流感病毒的抗原性經(jīng)常出現(xiàn)變異， 在歷史上曾多次引起世界性大流行。甲型流感也在豬和禽類中傳播，并引起流感流行，造成 大量動物死亡。而人乙、丙型流感僅在人之間轉(zhuǎn)播。乙型流感病毒對人類致病性較低。丙 型流感病毒主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。據(jù)WHO估計，在爆發(fā)性流行時，流感病 毒可在全世界迅速傳播，影響總?cè)丝诘?0%~20%。即使在非爆發(fā)性流行的年份，流感每 年也造成300萬~500萬例嚴(yán)重病例和25萬~50萬例死亡。
[0003] 迄今為止，接種流感疫苗是防治流感的最有效的手段。疫苗接種不僅可以降低高 危人群的發(fā)病率和死亡率，也可減輕癥狀，降低并發(fā)癥的發(fā)生、降低繼續(xù)傳播的機率。
[0004] 流感減毒活疫苗采用鼻粘膜途徑進行免疫，具有模擬天然感染的優(yōu)點。與滅活疫 苗相比，流感減毒活疫苗除了能誘導(dǎo)體液免疫外，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生局部中和抗體以及細胞免 疫應(yīng)答，并且免疫應(yīng)答持續(xù)時間持久。另外流感減毒活疫苗使用方便，易于進行大規(guī)模免 疫。
[0005] 流感減毒活疫苗一般為凍干粉針劑型。雖然冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)成熟，但還存在一 些缺點：首先，凍干粉針劑在使用過程中需要復(fù)溶，不便于使用并且增加了污染的機會；其 次，生物制品的冷凍干燥工藝復(fù)雜、工藝過程耗時長、流感病毒滴度損失較大；第三，真空冷 凍干燥設(shè)備投資大、能耗高、生產(chǎn)成本高，疫苗生產(chǎn)能力有限，尤其是在流感大爆發(fā)時，疫苗 生產(chǎn)廠商很難在短時間內(nèi)生產(chǎn)出足夠劑量的疫苗。
[0006] 2003年，MedImmune公司的流感減毒活疫苗FluMist獲得了 FDA的批準(zhǔn)。該產(chǎn)品 是一種冷適應(yīng)三價病毒疫苗，為水針劑型。該產(chǎn)品需要在約15°C及以下儲藏、運輸，但由于 藥房或?qū)W校通常都沒有處理冷凍產(chǎn)品的設(shè)備，使得FluMist不能大范圍使用。
[0007] 2005年，MedImmune公司提交了名為"冷藏溫度穩(wěn)定的流感疫苗組合物"的專利 (專利申請?zhí)朠CT/US2005/035614)，提供了一個可使流感疫苗在4~8°C保持穩(wěn)定的、含有 水解明膠組分的液體制劑組合物。然而，該組合物中的明膠或明膠衍生物可直接引起使被 接種者過敏的變態(tài)反應(yīng)和非細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。
[0008] 因此，為克服冷凍干燥技術(shù)成本高和水解明膠組分易引起變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)的 缺點，需要開發(fā)出不含明膠的疫苗液體制劑保護劑以及包含其的流感減毒活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明人經(jīng)過研宄，發(fā)明了一種用作流感減毒活疫苗保護劑的組合物，該組合物中 不含明膠成分，對人體的刺激性小，并且用該組合物制備的流感減毒活疫苗在冷藏條件下 可保持較好的穩(wěn)定性和較長有效期。
[0010] 因此，本發(fā)明提供一種用作流感減毒活疫苗保護劑的組合物，其中包含的組分及 其濃度為：人血清白蛋白I. 0~15. Og/L，優(yōu)選1. 5~12. Og/L，更優(yōu)選2. 5~10.0 g/L ;蔗糖 15. 0 ~95. Og/L，優(yōu)選 40. 0 ~85. Og/L，更優(yōu)選 50. 0 ~75. Og/L ;谷氨酸鈉 0· 5 ~15. Og/ L，優(yōu)選0. 5~12. 0g/L，更優(yōu)選0. 5~10. 0g/L ;其中，所述組合物的pH為5. 0~9. 0,優(yōu)選 為pH 5. 5~8. 5,更優(yōu)選為pH 6. 0~8. 0,最優(yōu)選為pH 6. 0~7. 4。
[0011] 本發(fā)明的組合物中還包括尿素，其濃度為〇~8. 0g/L，優(yōu)選0. 5~6. 0g/L，更優(yōu)選 1. 0~4. 0g/L ;精氨酸，其濃度為0~10. 0g/L，優(yōu)選1. 0~10. 0g/L，更優(yōu)選1. 4~10.0 g/ L ;組氨酸，其濃度為0~2. 0g/L，優(yōu)選為0. 5~I. 5g/L ;山梨醇，其濃度為0~70. 0g/L，優(yōu) 選15. 0~60. 0g/L，更優(yōu)選25. 0~50. 0g/L ;甘氨酸，其濃度為0~20. 0g/L，優(yōu)選3. 0~ 15. 0g/L ;甘露醇，其濃度為0~30. 0g/L，優(yōu)選10. 0~20. 0g/L。
[0012] 此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物用于提高疫苗穩(wěn)定性和安全性的用途以及 用于制備流感減毒活疫苗的用途。
[0013] 此外，本發(fā)明還提供一種流感減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，使用本發(fā)明的 組合物作為保護劑。
【具體實施方式】
[0014] 因此，本發(fā)明提供一種用作流感減毒活疫苗保護劑的組合物，其中包含的組分及 其濃度為：人血清白蛋白1. 〇~15. 0g/L，優(yōu)選1. 5~12. 0g/L，更優(yōu)選2. 5~10. 0g/L ;蔗糖 15. 0 ~95. 0g/L，優(yōu)選 40. 0 ~85. 0g/L，更優(yōu)選 50. 0 ~75. 0g/L ;谷氨酸鈉 0· 5 ~15. Og/ L，優(yōu)選0. 5~12. 0g/L，更優(yōu)選0. 5~10. 0g/L ;其中所述組合物的pH為5. 0~9. 0,優(yōu)選 為pH 5. 5~8. 5,更優(yōu)選為pH 6. 0~8. 0,最優(yōu)選為pH 6. 0~7. 4。
[0015] 本發(fā)明的組合物中還包括尿素，其濃度為0~8. 0g/L，優(yōu)選0. 5~6. 0g/L，更優(yōu)選 1. 0~4. 0g/L ;精氨酸，其濃度為0~10. 0g/L，優(yōu)選1. 0~10. 0g/L，更優(yōu)選1. 4~10.0 g/ L ;組氨酸，其濃度為0~2. 0g/L，優(yōu)選為0. 5~I. 5g/L ;山梨醇，其濃度為0~70. 0g/L，優(yōu) 選15. 0~60. 0g/L，更優(yōu)選25. 0~50. 0g/L ;甘氨酸，其濃度為0~20. 0g/L，優(yōu)選3. 0~ 15. 0g/L ;甘露醇，其濃度為0~30. 0g/L，優(yōu)選10. 0~20. 0g/L。
[0016] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物用于制備流感減毒活疫苗的用途。
[0017] 本發(fā)明還提供一種流感減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，使用本發(fā)明的組合 物作為保護劑。
[0018] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的流感減毒活疫苗的制備方法包括以下步驟：將 本發(fā)明的組合物的各個組分依次溶于pH緩沖液中；將pH調(diào)節(jié)到指定值；過濾除菌；加入病 毒原液，即得流感減毒活疫苗。
[0019] 在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的液體流感減毒活疫苗的pH為 5. 0~9. 0,優(yōu)選為pH 5. 5~8. 5,更優(yōu)選為pH 6. 0~8. 0,最優(yōu)選為pH 6. 0~7. 4。
[0020] 在一個優(yōu)選實施方案中，使用磷酸鹽緩沖液作為pH緩沖液。
[0021] 本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明的組合物和/或根據(jù)本發(fā)明的方法制備的流感減 毒活疫苗。
[0022] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的流感減毒活疫苗為注射劑或鼻噴霧劑。
[0023] 以下通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0024] 實施例1 :
[0025] I. pH 的測定
[0026] pH的測定根據(jù)《中華人民共和國藥典（2010年版）》（三部）附錄V A進行。
[0027] 2.病毒滴度的測定
[0028] 細胞系：
[0029] MDCK細胞：犬腎上皮傳代細胞系（Madin~Daby canine kidney cells)，購自 ATCCo
[0030] 病毒毒株：
[0031] HlNl 型流感病毒毒株：A/17/California/2009/38 (HlNl)，由 WHO 提供；
[0032] H3N2 型流感病毒毒株：A/17/Perth/09/87 (H3N2)，由 WHO 提供；
[0033] B型流感病毒毒株：B/56/Brisbane/60/08,由WHO提供。試劑：
[0034] TPCK-Trypsin (購自 Sigma，貨號：T1426)溶液；
[0035] DMEM細胞培養(yǎng)液（購自Sigma，貨號：D6546);
[0036] 胎牛血清（購自 Hyclone，貨號：SH3OO7O. 〇3);
[0037] L-谷氨酰胺（購自Gibco，貨號：25030)溶液；
[0038] 青鏈霉素（購自Gibco,貨號：15140);
[0039] HEPES (購自吉諾生物，貨號：GNM11344)溶液；
[0040] 一抗：Anti-Influenza A Virus Nucleoprotein antibody，購自 Abeam，貨號： [AA5H]ab20343 ；
[0041] Anti-Influenza B Virus Nucleoprotein antibody，購自 Abeam，貨號：[B017] ab20711 ；
[0042] 二抗：Alexa Fluor? 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody，購自 Lifetechnologies，貨號：A-IlOOl ;
[0043] 標(biāo)準(zhǔn)抗體：
[0044] 抗 Al 標(biāo)準(zhǔn)抗體：Influenza Anti-A/California/7/2009 (HlNl)-HA serum，購自 NIBSC，貨號：12/108 ;
[0045] 抗 A3 標(biāo)準(zhǔn)抗體：Influenza Anti-A/Perth/l6/2〇〇9_Like HA Serum，購自 NIBSC， 貨號：11/206 ;
[0046] 抗 B 標(biāo)準(zhǔn)抗體：Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008HA serum，購自 NIBSC，貨 號：11/136。
[0047] 方法：
[0048] (1)樣品處理
[0049] 取供試品3瓶混合在一起，作為待檢樣品。
[0050] 將滅活后的標(biāo)準(zhǔn)抗體分為3組，分別為：
[0051] Gl :抗A3標(biāo)準(zhǔn)抗體1份+抗B標(biāo)準(zhǔn)抗體1份+PBS 3