專利名稱：：流感嗜血桿菌的omp26抗原的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種流感嗜血桿菌的新抗原，包含這種新抗原的疫苗，以及它在治療和診斷中的應用。流感嗜血桿菌是異養(yǎng)好氧的革蘭氏陰性棒桿菌(Krieg和Holt(編著)，細菌分類學伯杰氏手冊，563頁(1984))。它是急性呼吸道感染的病原體，并且在慢性支氣管炎和中耳炎患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。我們現(xiàn)在已從NTHI株鑒定并純化了一個26kDa的外膜蛋白(稱OMP26)，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)當用做免疫原時，OMP26可以針對NTHI的同源和異源株產(chǎn)生保護性的免疫反應，在SDS-PAGE膠電泳中OMP26和P5的分子量相似，但已發(fā)現(xiàn)與P5有明顯的不同。外膜蛋白P5是SDS-PAGE膠中兩個低分子量條帶中的一個，SDS-PAGE膠的這兩個條帶用于流感嗜血桿菌菌株的分型，P5的表現(xiàn)分子量約為25-27kDa。P5蛋白具熱修飾性，在β-巰基乙醇存在時100℃加熱30分鐘后，表現(xiàn)分子量為35kDa。最近，NTHI表達的另外一種蛋白質(zhì)，稱為微絲結(jié)合蛋白，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)與上述P5蛋白有相似的分子量特征，也具有熱修飾性，同時有92％的序列同源性。而OMP26則沒有顯示與定義的P5蛋白或微絲結(jié)合蛋白一樣的序列同源性或熱修飾特性。因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種流感嗜血桿菌的外膜蛋白，該蛋白在SDS-PAGE膠中的分子量為26kDa。該蛋白被稱為OMP26。特別地，發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖1所示，或者一種與其基本同源的氨基酸序列。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖1所示，是從第24位氨基酸開始的，或者一種與其基本同源的氨基酸序列。前23位氨基酸構(gòu)成一個“信號”序列，并認為蛋白質(zhì)去掉這個序列同樣具有活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)是一種免疫原，因此可以針對流感嗜血桿菌的感染產(chǎn)生保護性的免疫反應。本發(fā)明提及的與OMP26“基本同源的”蛋白質(zhì)可能為40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％甚至99％的同源性。蛋白質(zhì)優(yōu)選至少70％的同源性，80％的同源性較好，90％的同源性更好，最好是95％的同源性。專業(yè)人員認為同源性的程度僅僅是一個因素。更重要的是保持蛋白質(zhì)的抗原活性。因此，一個蛋白質(zhì)有相對較低的同源性，例如40％，而仍保持本文所述的抗原活性是有道理的。另外，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列做“保守性”或“半保守性”改變，而不改變蛋白質(zhì)的基本活性，這在本領域是已知的。例如，甘氨酸，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，它們都具有脂肪族的側(cè)鏈基團，可以經(jīng)常互相替換而基本上不引起蛋白質(zhì)生物學活性的改變。同樣的，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸都有芳香基的側(cè)鏈，可以互相替換。這些本文所述保持抗原活性的蛋白質(zhì)都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。OMP26抗原的部分或區(qū)段可能會用來誘導針對流感嗜血桿菌的保護作用。這些抗原的部分或區(qū)段也同樣都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。第二方面，本發(fā)明提供了核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，該序列編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、上文所述的其突變體或真正的抗原性部分或區(qū)段。特別是本發(fā)明提供了編碼OMP26的DNA序列，如圖1所示。專業(yè)人員認為，根據(jù)遺傳密碼的簡并性，可能進行DNA序列保守性的變化而不引起蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變。所以，所有這些DNA序列也同樣都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。適當時，本發(fā)明的核苷酸序列可以構(gòu)成載體的部分，例如質(zhì)粒。如文中所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)刺激針對流感嗜血桿菌的免疫反應，因此第三方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的疫苗制劑，如本文所述該蛋白可選擇地與一種或多種載體和/或佐劑配制在一起。第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明蛋白質(zhì)在制備抵抗流感嗜血桿菌的疫苗中的用途。本發(fā)明的疫苗組合物可免疫主體抵抗流感嗜血桿菌的感染。因此，第五方面，本發(fā)明提供了免疫主體抵抗流感嗜血桿菌感染的方法，包括給予主體本發(fā)明的疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物可用來產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和/或粘膜免疫。第六方面，本發(fā)明提供了呼吸道感染和中耳炎的預防或治療方法，其中包括給予主體本發(fā)明的疫苗組合物的步驟。在其它方面本發(fā)明提供了(a)本發(fā)明的蛋白質(zhì)在流感嗜血桿菌感染的診斷中的應用；和(b)用于流感嗜血桿菌感染的診斷的試劑盒，其中包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明每個方面的優(yōu)選特征對每個其他方面是特別優(yōu)選的，反之亦然?，F(xiàn)在參照下列實施例來描述本發(fā)明，這些實施例不應該解釋為以任何方式限制本發(fā)明。實施例涉及如下附圖圖1顯示編碼OMP26的DNA序列以及源自該DNA序列的氨基酸序列；圖2顯示OMP26以及其它兩種較高分子量蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析；圖3顯示OMP26(a)N-末端前25位氨基酸殘基的序列以及與來自出血敗血性巴斯德氏菌(P.multocida)和假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)的蛋白質(zhì)的比較；圖4顯示用活細菌攻擊后4小時在支氣管洗出液中發(fā)現(xiàn)的NTHI-I細菌；圖5顯示在OMP26免疫的鼠血清中OMP26-特異的IgG亞類抗體；圖6顯示免疫斑點法檢測血清中OMP26-特異性抗體的結(jié)果；和圖7顯示從OMP26免疫鼠和未免疫鼠的MLN中分離的抗原特異性淋巴細胞增殖的結(jié)果。在下面的實施例中，數(shù)據(jù)已表示為平均值+/-均值標準誤。肺的清除率數(shù)據(jù)、吞噬細胞的總數(shù)、細胞分類計數(shù)的數(shù)據(jù)在組間通過方差的單向分析進行了統(tǒng)計學意義的比較，緊接著通過Tuckey′s實驗進行多重比較分析(MacintoshSystat)?？贵w數(shù)據(jù)通過不配對t-檢驗評估了組間的顯著性，淋巴細胞增殖的數(shù)據(jù)通過方差的全因子分析進行評估(MacintoshSystat)。兩個變量間的線性相關(guān)性利用泊松相關(guān)系數(shù)來決定(MacintoshSystat)。實施例1(i)蛋白純化利用制備性電泳從NTHI-I中純化了一種26kDa蛋白質(zhì)(OMP26)。100個瓊脂平板中的細菌過夜培養(yǎng)，刮下收集細菌，經(jīng)4℃10,000g離心10分鐘洗滌兩次。用兩性離子3-14表面活性劑緩沖液抽提外膜組分，乙醇沉淀得到外膜粗制品。將外膜抽提物冷凍干燥，重懸于微量體積的無菌水中，進一步溶解于4倍體積的十二烷基硫酸鈉(SDS)還原緩沖液中(62.5mMTris，(PH6.8)，10％(vol/vol)甘油，2％(wt/vol)SDS，5％(vol/vol)β-巰基乙醇，1.2×10-3％(wt/vol)溴酚蘭)。SDS樣品在37℃孵育至少30分鐘，然后再加樣到電泳柱的堆積膠中。OMP26通過制備性PAGE電泳純化。制備性SDS-PAGE電泳純化OMP26通過Bio-RadModel491PrepCell來完成，利用裝在37mm(內(nèi)徑)柱中的60ml14T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N，N′-亞甲基-雙丙烯酰胺)分離膠和10ml4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS堆積膠。得到的各部分洗脫液通過冷凍干燥濃縮，通過分析性SDS-PAGE分析蛋白含量。在這種條件下分離到的OMP26含有SDS，用磷酸鉀除去樣品中SDS并沉淀。合并含有OMP26的各部分液體并透析，然后確定蛋白濃度。蛋白質(zhì)的分析鑒別通過分析性SDS-PAGE進行，利用10-15％梯度或12.5％勻質(zhì)丙烯酰胺膠電泳，然后銀染。利用PiercemicroBCA實驗決定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGEmini-膠的銀染和E-TOXATE鱟裂解實驗估計LOS的存在。結(jié)果OMP26成功地從三個分子量在26到30kDa的一組蛋白中分開。圖2顯示OMP26以及其它兩個蛋白質(zhì)的位置，銀染表明最終樣品的高純度。蛋白質(zhì)熱修飾性評估通過在β-巰基乙醇存在下100℃加熱蛋白質(zhì)樣品30分鐘來進行，發(fā)現(xiàn)煮沸30分鐘蛋白質(zhì)樣品仍以同樣的分子量遷移(圖2)。為了決定其它的蛋白條帶是否有一個可能為熱修飾性的P5，將這些分子量大小范圍的所有三個蛋白質(zhì)在β-巰基乙醇存在的條件下加熱煮沸30分鐘，沒有蛋白質(zhì)表現(xiàn)熱修飾性(圖2)。蛋白質(zhì)中LOS含量的評估，利用E-TOXATE實驗試劑盒進行，發(fā)現(xiàn)每mg蛋白質(zhì)中不超過0.6μg內(nèi)毒素。(ii)OMP26N-末端測序樣品的準備將SDS-PAGE中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，來準備N-末端氨基酸序列分析的樣品。該蛋白質(zhì)樣品被送到英國CortecsDiagnostic，Techbase1，NewtechSquare，Deeside，Clwyd進行序列分析。氨基酸序列鑒定N-末端的氨基酸序列從轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的蛋白帶獲得，前25多肽的氨基酸序列分析結(jié)果顯示在圖3中。序列分析結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)與HibP5或微絲結(jié)合蛋白無序列同源性。N-末端氨基酸序列卻顯示該蛋白質(zhì)與出血敗血性巴斯德氏菌的21.4kDa蛋白質(zhì)有56％的同源性，與假結(jié)核耶爾森氏菌的19kDa外膜蛋白有44％的序列同源性。(iii)免疫和細菌攻擊無特定病原體的雄性大鼠第一天接受淋巴結(jié)內(nèi)(TPP)免疫，第14天氣管內(nèi)(IT)加強免疫，最后在第21天接受活菌攻擊實驗。實驗動物在尾靜脈處用三氟氯溴甲烷靜脈擴散麻醉法和水合氯醛一起作用進行麻醉。通過腹部正中切口暴露小腸，用27號針注射抗原到漿膜下淋巴結(jié)，免疫用的蛋白質(zhì)(OMP26)樣品經(jīng)乳化制備而成，每ml1∶1比例的弗氏不完全佐劑(IFA)和磷酸鹽緩沖液(PBS)組成的乳化液中含有200或800μg的OMP26蛋白質(zhì)。每只實驗鼠的總接種量為10μg或40μg蛋白質(zhì)。兩對照組如下組成(i)未免疫組和假免疫組(用IFA和PBS混合乳液免疫)混合體，和(ii)陽性對照組以同源的NTHI株死菌免疫。實驗鼠在淋巴結(jié)內(nèi)免疫后第14天接受氣管內(nèi)加強免疫。OMP26免疫鼠接受10μgOMP26的氣管內(nèi)加強免疫。未免疫組接受50μlPBS，死菌免疫組接受50μl死菌加強(細菌計數(shù)1010個/ml)。實驗動物在第一次免疫后21天用活菌攻擊4小時(細菌計數(shù)5×108)。異源株NTHI-II同樣用于細菌攻擊實驗。細菌在37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)基為每毫升瓊脂中加入50ml去纖維蛋白馬血的腦心浸液的瓊脂平板，回收、洗滌、重懸于PBS中至要求的濃度。細菌通過氣管內(nèi)插管進入肺內(nèi)，四小時后對實驗鼠實施安樂死。取血并將等份血清儲藏于-20℃冰箱待做抗體分析。肺組織用2mlPBS清洗五次，集中洗出液(BAL)做細菌計數(shù)。洗肺后，取出肺，勻漿并做細菌計數(shù)。準備Cytospin玻片在肺洗出液中做細胞分類計數(shù)，肺洗出液中的總細胞數(shù)用溴酚蘭染色，血細胞計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果NTHI-I同源株活菌在OMP26免疫鼠后第21天攻擊，顯示了顯著的細菌清除率(P＜0.005)。10μgOMP26免疫和加強的實驗鼠4小時后肺中的細菌數(shù)比未免疫鼠肺中的細菌數(shù)少92％，同樣的，40μgOMP26淋巴結(jié)內(nèi)免疫，10μgOMP26加強的實驗鼠4小時后肺中的細菌數(shù)比對照組鼠肺中的細菌數(shù)少96％，與在死菌免疫組的鼠中發(fā)現(xiàn)的95％的清除率相當(圖4)。OMP26免疫組大鼠同樣接受異源非典型株NTHI-II活菌的攻擊，結(jié)果如表1所示OMP26免疫后不同株的活菌攻擊，在肺中也有顯著的細菌清除(P＜0.005)?；罹艉?小時，免疫組BAL中細菌數(shù)比未免疫組少93％，表明與同源性的細菌攻擊清除率相當。OMP26免疫組與未免疫組相比較，肺勻漿中的細菌數(shù)減少。NTHI-II(異源株)攻擊OMP26免疫鼠，也比未免疫鼠的肺勻漿中的細菌數(shù)顯著減少。肺勻漿中80％清除率，BAL中有93％的清除率，與用NTHI-I(同源株)攻擊相比較，數(shù)值上有些差別，NTHI-I(同源株)攻擊肺勻漿中89％清除率，BAL中有87％的清除率。這次實驗中NTHI-I攻擊的結(jié)果與以前的實驗有所不同，這是因為這次攻擊的活菌接種物含有比通常的接種物較多的細菌。(通常的接種物范圍在0.6-1.4×1010CFU/ml)。OMP26免疫的實驗動物BAL中有更多的吞噬細胞，這些細胞與免疫動物加強細菌清除有關(guān)(表2)。對于同源性和異源性的細菌攻擊，免疫組的細胞反射增進的提高是相同的。但在攻擊后4小時，免疫組和非免疫組的分類細胞計數(shù)并沒有顯著的差異(表2)，兩組中PMN與巨噬細胞的比值是相似的表1OMP26免疫、同源性和異源性非典型株流感嗜血桿菌攻擊后的肺清除率</tables>a數(shù)值(平均值±SEM)為10μgOMP26淋巴結(jié)免疫大鼠后21天，NTHI-I株或NTHI-II株活菌攻擊后4小時BAL或肺勻漿中的數(shù)值。未免疫組包括假免疫和未處理動物的混合體。b接種活菌攻擊的濃度(由系列稀釋的平板決定)為NTHI-I株10.38(Log10)CFU/ml，NTHI-II株10.17(Log10)CFU/ml。cNTHI-I攻擊組為4只大鼠/組未免疫組為4只大鼠/組，OMP26免疫組NTHI-II攻擊為6只大鼠/組。*與未免疫組相比較P＜0.001表2五株非典型流感嗜血桿菌活菌肺攻擊4小時后BAL中的吞噬細胞計數(shù)</tables>n與未免疫組相比較P＜0.001(iv)OMP26特異性的ELISA用純化的OMP26包被Polysorb微量滴定孔，IgG、IgG2a、IgA和IgM的實驗包被濃度為1μg/ml，IgG1、IgG2b、IgG2c和IgE的實驗包被濃度為10μg/ml。在兩步孵育之間用含有0.05％Tween20的PBS洗板五次。滴定孔用稀釋到PBS-0.05％Tween20中的5％脫脂牛乳封閉60分鐘。各孔用稀釋到封閉試劑中的血清(1/25-1/3200)或BAL(1/2-1/16)樣品包被孵育90分鐘，進行分析。使用了偶聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白IgG(1/2000)、IgA(1/1000)和IgM(1/4000)(Fc特異的)；小鼠抗大鼠的IgG1(1/500)、IgG2a(1/1000)、IgG2b(1/500)和IgG2c(1/500)。滴定孔與免疫球蛋白孵育90分鐘，然后將酶標板顯色。結(jié)果在OMP26免疫的大鼠血清和BAL樣品中檢測到特異的OMP26抗體，同樣在四株不同株的流感嗜血桿菌死菌免疫的大鼠血清和BAL樣品中也檢測到特異的OMP26抗體。在OMP26免疫的大鼠血清樣品中檢測到高滴度的OMP26特異的抗體IgG、IgA和IgM，BAL樣品中檢測到IgG和IgA，在較高的40μg免疫劑量組中檢測到最高的抗體水平(表3)。不同株流感嗜血桿菌死菌免疫的大鼠血清樣品中檢測到OMP26特異的抗體IgG、IgA和IgM，BAL樣品中檢測到IgG和IgA(表3)，但在這些組中檢測到的抗體水平比OMP26免疫組的抗體水平明顯要低。OMP26免疫的大鼠血清樣品中同樣進行了IgE的ELISA檢測，但OMP26特異性的IgE未能檢測到(數(shù)據(jù)未列出)。OMP26特異性的IgG亞族檢測顯示僅在40μg實驗鼠中檢測到OMP26特異性的IgG1亞族，而在10μg和40μg的OMP26免疫組中都檢測到顯著的IgG2a和IgG2b亞族抗體水平(圖5)。淋巴結(jié)接種中，OMP26濃度從10μg到40μg增加后，IgG2a和IgG2b亞族的抗體水平明顯增加(P＜0.005)。對IgG2c亞族也同樣進行了檢測，但未檢測到顯著水平的OMP26特異的IgG2c亞族抗體(數(shù)據(jù)未列出)。表3用OMP26或死菌免疫后血清和支氣管肺泡洗出液中OMP26特異性抗體的比較a抗體滴度的計算如材料和方法中所述。b大鼠在0天淋巴結(jié)內(nèi)免疫，14天接受氣管內(nèi)加強，21天用活菌攻擊。血清和BAL樣品如材料和方法中所述制備。c用所示流感嗜血桿菌死菌免疫大鼠接受同源株活菌的攻擊。dn.d.表示在最低的樣品稀釋度中未能檢測到P5特異性的抗體*與未免疫細相比較P＜0.001(v)免疫斑點將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到硝基纖維素膜上(0.2μm孔徑)。OMP26、NTHI-I、NTHI-II以及HI-CD和Hib-II免疫組的大鼠血清10倍稀釋到TTBS-5％(w/v)的脫脂奶粉溶液中，作為第一抗體。500倍稀釋到TTBS-5％(w/v)的脫脂奶粉溶液中的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠的IgG(Fc段特異的)作為第二抗體。結(jié)果利用未免疫組、OMP26免疫組和流感嗜血桿菌(四株)免疫組的大鼠血清中的抗體免疫斑點識別OMP26，顯示出每個免疫組大鼠血清中的抗體均識別OMP26，而未免疫組則不識別(圖6)。這說明NTHI-I株中純化的OMP26和本研究所用的流感嗜血桿菌菌株免疫產(chǎn)生的抗體反應有交叉活性。(vi)抗原特異性的淋巴細胞鑒定從腸系膜淋巴結(jié)(MLN)得到的淋巴細胞以106個細胞/ml的濃度進行培養(yǎng)?？乖?OMP26)以10倍系列稀釋于培養(yǎng)液中并無菌過濾。細胞懸液和抗原均分為三份，加到平底多孔板中達終體積0.2ml/孔。培養(yǎng)4天，在最后8小時通過(3H)標記的胸腺嘧啶核苷摻入來估計淋巴細胞的增殖。通過扣除背景后三份樣品的幾何平均值+/-所有處理組的標準差即所得結(jié)果。結(jié)果來自OMP26免疫組和未免疫組大鼠MLN的淋巴細胞用來估計抗原特異性增殖應答。在體外培養(yǎng)的條件下，來自OMP26免疫組大鼠MLN的淋巴細胞對OMP26有顯著的反應，而來自未免疫組大鼠MLN的淋巴細胞未有顯著性的增殖反應(圖7A)。OMP26免疫鼠的淋巴細胞同樣與四株流感嗜血桿菌的OMP抽提物一起培養(yǎng)，來估計其交叉反應。OMP26免疫鼠的淋巴細胞與NTHI-I株、NTHI-II株和HI-CD株的OMP抽提物有顯著性的增殖，而在Hib-II株的OMP抽提物中則未發(fā)現(xiàn)顯著性的增殖反應(圖7B-E)。實施例2OMP26的克隆和序列測定從NTHI株中提取DNA。設計識別該基因的引物通過標準PCR方法擴增和鑒定了編碼OMP26的基因片段(引物在BiomolecularResourceFacility，JohnCurtinSchoolofMedicalResearch，Canberra，ACT，Australia中合成)。經(jīng)分析認為成功地得到了正確的產(chǎn)物，抽提PCRDNA產(chǎn)物。構(gòu)建了兩個質(zhì)粒，一個DNA產(chǎn)物含有編碼信號肽和成熟OMP26蛋白質(zhì)的片段，第二個含有編碼最終成熟的OMP26多肽的片段(沒有先導信號肽)。用限制性內(nèi)切酶HindIII消化OMP26加信號肽的PCRDNA產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NspBII和HindIII消化成熟的OMP26PCRDNA產(chǎn)物，回收消化的DNA，分別將OMP26加信號肽DNA或成熟的OMP26蛋白質(zhì)DNA連接到質(zhì)粒PQE30或PQE31(GiaganGmbH，Hilden，Gemany)的SmaI和HindIII位點處。然后純化和沉淀質(zhì)粒，利用末端脫氧染色法進行序列測定(在BiomolecularResourceFacility，JohnCurtinSchoolofMedicalResearch，Canberra，ACT，Australia進行)。結(jié)果圖1所示的序列代表了成熟OMP26蛋白質(zhì)加信號肽。信號肽序列包括頭23位氨基酸，NTHI表達在外膜上的最終產(chǎn)物從第24位氨基酸開始。權(quán)利要求1.根據(jù)SDS-PAGE測定分子量為26kDa的一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是流感嗜血桿菌的一種外膜蛋白。2.權(quán)利要求1所要求的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如圖1所示，或者與其基本同源的序列。3.權(quán)利要求1所要求的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如圖1所示，該蛋白質(zhì)從N-末端第24位氨基酸開始，或者與其基本同源的序列。4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所要求的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列至少與圖1所示的氨基酸序列有70％的同源性。5.權(quán)利要求1到權(quán)利要求4任何一項所定義的蛋白質(zhì)的抗原性部分或區(qū)段。6.一種含有權(quán)利要求1到權(quán)利要求4任何一項所定義的蛋白質(zhì)的抗原性部分或區(qū)段的蛋白質(zhì)。7.權(quán)利要求6所要求的蛋白質(zhì)，它是一種融合蛋白。8.編碼權(quán)利要求1到權(quán)利要求7任何一項所定義的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。9.權(quán)利要求8所要求的核苷酸序列，它是一種DNA序列。10.權(quán)利要求9所要求的DNA序列，它如圖1所示。11.一種疫苗制劑，其包含如權(quán)利要求1到權(quán)利要求7任何一項所定義的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可選擇地與一種或多種載體和/或佐劑配制在一起。12.權(quán)利要求1到權(quán)利要求7任何一項所定義的蛋白質(zhì)在制備抗流感嗜血桿菌疫苗中的用途。13.免疫主體抵抗流感嗜血桿菌感染的方法，包括給予主體權(quán)利要求11所定義的疫苗。14.對呼吸道感染和中耳炎的預防或治療方法，包括給予主體權(quán)利要求11所定義的疫苗。15.權(quán)利要求1到權(quán)利要求7任何一項所定義的蛋白質(zhì)在診斷流感嗜血桿菌感染中的應用。16.一種用于診斷流感嗜血桿菌感染的試劑盒，其包含權(quán)利要求1到權(quán)利要求7任何一項所定義的蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供了從流感嗜血桿菌外膜中得到的新抗原蛋白質(zhì),也提供了編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列以及含有該蛋白質(zhì)的疫苗和免疫主體抗流感嗜血桿菌感染的方法。本發(fā)明還包括預防或治療呼吸道感染和中耳炎的方法,以及檢測流感嗜血桿菌的方法和用于這些方法的試劑盒。文檔編號A61P31/04GK1189186SQ96195138公開日1998年7月29日申請日期1996年6月27日優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日發(fā)明者J·基德,A·克里普斯,C·J·史密斯申請人:科泰克斯國際有限公司