一種制備鴨疫里默氏菌前菌影疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽養(yǎng)殖疫病防控領(lǐng)域，涉及一種細(xì)菌疫苗的制備方法，尤其是涉及 一種利用噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因轉(zhuǎn)化制備鴨疫里默氏菌前菌影 疫苗的方法與應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨傳染性衆(zhòng)膜炎，是由鴨疫里默氏菌（/PieffiereJ7a RA)引起的 鴨、鵝、火雞及其它家禽和野禽的一種急性或慢性接觸性傳染病，主要侵害2-7周齡雛鴨， 以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。
[0003] 當(dāng)前，鴨疫里默氏菌感染對養(yǎng)殖業(yè)的危害，除了直接引起動(dòng)物的發(fā)病和死亡外，隱 性感染導(dǎo)致的飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長遲緩而帶來的間接經(jīng)濟(jì)損失也十分嚴(yán)重。鴨疫里默氏 菌雖然對一些抗生素敏感，但機(jī)體內(nèi)難以完全清除；同時(shí)由于抗生素的不合理使用，其耐藥 性日益增強(qiáng)，往往導(dǎo)致禽肉產(chǎn)品的藥物殘留問題日益突出。防控該病的科學(xué)方法，是在強(qiáng)化 飼養(yǎng)管理的基礎(chǔ)上，接種合適的鴨疫里默氏菌疫苗。
[0004] 盡管目前關(guān)于鴨疫里默氏菌的疫苗方面已經(jīng)有了許多研宄報(bào)道，例如，鴨疫里默 氏菌滅活苗、多價(jià)復(fù)合佐劑滅活疫苗以及新型菌影疫苗等。但仍然存在以下幾方面的問題： ①傳統(tǒng)的疫苗制備技術(shù)，通過甲醛等化學(xué)藥物滅活過程中改變抗原結(jié)構(gòu)，而減弱了免疫原 性，致使免疫保護(hù)率降低。②目前所報(bào)道的疫苗，均是通過注射免疫，免疫應(yīng)激大，而且，在 規(guī)模化養(yǎng)殖條件下，免疫操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。③滅活苗只能引起體液免疫，不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生輕微 的細(xì)胞免疫和局部黏膜免疫，不能提供可靠的抵抗感染的黏膜免疫屏障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種利用噬菌體PhiX174的E基 因以及葡萄球菌核酸酶A基因轉(zhuǎn)化鴨疫里默氏菌臨床分離株，制備新型鴨疫里默氏菌前菌 影疫苗及其應(yīng)用的技術(shù)方案。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案對有效防治鴨疫里默氏菌感染，以 及減少家禽養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的使用、減少藥物殘留等具有重要意義。
[0006] 為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案： 選擇本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存的2型鴨疫里默氏菌臨床分離株(編號為LY1)作為基礎(chǔ)菌株。 該菌株經(jīng)過3代接種雛鴨復(fù)壯之后仍無致病性，因而使用安全。冷凍保存的菌株復(fù)蘇后，按 常規(guī)試驗(yàn)方法制備成原生質(zhì)體備用。
[0007] 利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，將噬菌體PhiX174的E基因（簡稱E)與葡萄球菌核酸 酶A基因（簡稱SN)通過編碼柔性連接臂（Gly4Ser) 3的Linker連接，獲得E、SN的串聯(lián)基因 E-SN，進(jìn)一步將其與溫控表達(dá)載體pBV220連接，構(gòu)建溫控表達(dá)載體pBV-E-SN。將pBV-E-SN 按常規(guī)試驗(yàn)方法電轉(zhuǎn)化制備的鴨疫里默氏菌原生質(zhì)體，篩選陽性克隆得到鴨疫里默氏菌重 組工程菌。
[0008] 將得到的鴨疫里默氏菌工程菌常規(guī)方法28°C擴(kuò)菌培養(yǎng)，分離菌體，與凍干保護(hù)劑 等體積混合均勻，潔凈環(huán)境下分裝于IOmL西林瓶，冷凍干燥，即得到鴨疫里默氏菌前菌影 疫苗。
[0009] 凍干保護(hù)劑的配方由以下重量份的組分構(gòu)成：脫脂乳8-12份，蔗糖2-6份，海藻糖 3-10份，抗壞血酸2-6份，丙三醇12-20份，純化水50-70份。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選的，凍干保護(hù)劑由以下重量份的組分構(gòu)成：脫脂乳8-10份，蔗糖2-4 份，海藻糖3-8份，抗壞血酸2-4份，丙三醇12-16份，純化水60-70份。
[0011] 通過飲水免疫，該疫苗在溫度較低的上呼吸道正常繁殖，刺激呼吸道局部黏膜免 疫應(yīng)答（SIgA)，并逐漸被清除；上呼吸道所繁殖的細(xì)菌及進(jìn)入消化道的細(xì)菌部分突破黏膜 屏障進(jìn)入血液，隨即誘導(dǎo)所攜帶的溫控表達(dá)載體產(chǎn)生裂解基因產(chǎn)物。其中，E基因產(chǎn)物在細(xì) 菌細(xì)胞膜形成跨膜孔道，細(xì)菌內(nèi)容物流出而形成菌影，繼續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液 免疫；SN基因產(chǎn)物將細(xì)菌DNA降解成小于IOObp的片段，將細(xì)菌徹底滅活。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的利用溫控雙裂解基因制備鴨疫里默氏菌前菌影疫 苗具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著進(jìn)步： (1)與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，形成菌影之前(在呼吸道繁殖階段）以及進(jìn)入機(jī)體內(nèi)形成菌 影之后，細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)基本完整，抗原性基本不受影響，免疫保護(hù)率高。
[0013] (2)本發(fā)明所提供的鴨疫里默氏菌前菌影疫苗，通過飲水免疫，避免了注射免疫的 應(yīng)激，應(yīng)用方便，適應(yīng)規(guī)?；B(yǎng)殖。
[0014] ( 3)傳統(tǒng)滅活疫苗以及目前所報(bào)道的有關(guān)鴨疫里默氏菌菌影疫苗，通過注射免疫， 只能引起體液免疫反應(yīng)，保護(hù)效果有一定局限性。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，利用鴨體不同 部位的溫度差異，制備的鴨疫里默氏菌前菌影在溫度較低的呼吸道不會誘導(dǎo)裂解基因的表 達(dá)，因而能夠正常繁殖并刺激呼吸道局部的黏膜免疫反應(yīng)；進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的菌苗由于溫度的 升高（41°C - 42°C)，裂解基因隨即開始表達(dá)，從而形成菌影刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞 免疫。由于呼吸道的黏膜免疫反應(yīng)（SIgA)時(shí)相變化，在SIgA升高至足以清除接種的疫苗 菌株之前，會有細(xì)菌持續(xù)進(jìn)入機(jī)體形成菌影激發(fā)體液免疫反應(yīng)，起到類似油佐劑滅活疫苗 的緩釋作用。因而，本發(fā)明所提供的方案既可引起呼吸道和消化道的黏膜免疫反應(yīng)而提供 抵抗細(xì)菌感染的第一道防線，也可以引起體液免疫反應(yīng)而提供持續(xù)的保護(hù)。
[0015] (4)利用溫控誘導(dǎo)表達(dá)的串聯(lián)雙裂解基因，使進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部的絕大部分細(xì)菌形成 菌影失去活性而保留免疫原性，少數(shù)未能及時(shí)形成跨膜孔道的細(xì)菌，其DNA被SN迅速降解 為小片段而失活。另外，選擇的菌株為低致病性臨床分離株，三重保障確保疫苗使用的安全 性。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但是本發(fā)明的 保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 實(shí)施實(shí)例一：鴨疫里默氏菌前菌影的制備 1.1臨床分離株的毒性驗(yàn)證將一株從臨床蛋鴨中分離的鴨疫里默氏菌(編號為LY1) 經(jīng)血清型鑒定為2型的菌株進(jìn)行了毒力驗(yàn)證。該菌株不產(chǎn)生明膠酶，接種雛鴨連續(xù)3代未 表現(xiàn)出致病性，但用同型強(qiáng)毒攻擊能產(chǎn)生90%以上的保護(hù)力，說明該菌株是一株無致病力 或致病力較低又具有良好免疫原性的菌株，可作為疫苗候選株。
[0018] 原生質(zhì)體的制備將LYl菌株活化后，培養(yǎng)至OD6c?為0. 7時(shí)，將菌液置于冰水浴 中30min，取IOmL菌液，4°C條件下5000r/min離心10min，棄上清，用IOmL冰水浴滅菌水洗 滌，再次離心，如此重復(fù)洗滌三次。再用冰水浴高滲緩沖液懸浮，加入預(yù)熱的溶菌酶溶液至 5mg/mL，37°C水浴30min后，再加入預(yù)熱的EDTA溶液至0.0 lm