一種突變的多聚半乳糖醛酸酶pg63t108y及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y及其編碼基因和應(yīng)用，具體 地，本發(fā)明涉及利用理性設(shè)計(jì)和分子生物學(xué)技術(shù)而獲得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸 酶突變體，屬于基因工程和遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)果蔬汁生產(chǎn)規(guī)模逐年擴(kuò)大，目前在商品化的果膠酶主要有黑曲霉等真菌來(lái)源 的復(fù)合果膠酶酶系，也有單一的果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酯酶酶種。從質(zhì)量上看，國(guó) 內(nèi)自主研發(fā)的果膠酶還普遍存在酶活力不高，穩(wěn)定性較差的問(wèn)題。相對(duì)而言，進(jìn)口果膠酶如 諾維信、杰能科品牌的產(chǎn)品系列則在酶學(xué)性質(zhì)上更為優(yōu)良和穩(wěn)定。目前國(guó)內(nèi)果蔬汁生產(chǎn)企 業(yè)對(duì)進(jìn)口果膠酶的依賴程度很大，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。而國(guó)內(nèi)果膠酶酶制劑研發(fā)生產(chǎn)也存 在來(lái)源單一，競(jìng)爭(zhēng)力不夠的局面。各生產(chǎn)企業(yè)缺乏自主創(chuàng)新的果膠酶是目前生產(chǎn)中突出的 問(wèn)題，因此研發(fā)具有優(yōu)良性質(zhì)的食品工業(yè)用果膠酶將有力促進(jìn)我國(guó)果蔬汁飲料產(chǎn)業(yè)發(fā)展， 同時(shí)顯著提高國(guó)產(chǎn)果汁產(chǎn)品的質(zhì)量。造成以上局面的一個(gè)主要原因是果蔬汁生產(chǎn)條件對(duì)應(yīng) 用的果膠酶的酸堿性質(zhì)有著特定的要求。很多不同來(lái)源的果膠酶已被報(bào)道發(fā)表，但其性質(zhì) 均不能滿足實(shí)際生產(chǎn)條件的需求。比如，蘋(píng)果汁自然PH值范圍為3. 5-4. 5,這就需要所使用 的酶具有適酸性質(zhì)，在PH2至pH5的范圍內(nèi)都保持較高的活性。同時(shí)，為防止污染和果汁褐 化，果汁榨取溫度一般控制在30-50°C，因此在最適溫度在40°C以及在20-50°C中低溫范 圍內(nèi)能保持高活性的低溫果膠酶才能高效地發(fā)揮作用。在酸性PH環(huán)境和中低溫范圍內(nèi)保 持穩(wěn)定并具有高酶活的果膠酶被認(rèn)為是果蔬汁生產(chǎn)行業(yè)中性質(zhì)優(yōu)良的工業(yè)用酶。
[0003] 果膠酶的來(lái)源廣泛，存在于多種微生物中，如真菌、放線菌和細(xì)菌等。由于真菌中 的黑曲霉屬于公認(rèn)安全級(jí)，市售食品級(jí)的果膠酶仍主要來(lái)源于黑曲霉，其最適PH值一般在 酸性范圍，在實(shí)際生產(chǎn)條件下能表現(xiàn)出穩(wěn)定的活性。雖然目前市場(chǎng)上已存在多種曲霉來(lái)源 的果膠酶復(fù)合酶系或是單獨(dú)應(yīng)用的酶種，但商業(yè)酸性果膠酶的研發(fā)主要還是以大量篩選為 主，針對(duì)果蔬汁用果膠酶適酸性機(jī)制的研究以及對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改良的研究報(bào)道從90年 代至今國(guó)內(nèi)外幾乎都是空白。因此，獲取具有高催化效率的果膠酶是當(dāng)前的研發(fā)趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y的編碼 基因。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y的 基因工程方法。
[0009] 所述突變體氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示（對(duì)多聚半乳糖醛酸酶PG63的108 位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，Thrl08Tyr)。
[0010] MLLSTHSIVLGLLGSTSLALASPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVP AGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGYNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLA HNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNRNGDKGSLGHNTDGFDI⑶SDHITITGATVYNQDDCLA INSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITS QGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPAN TC
[0011] 所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] ATGTTGTTATCGACACACAGTATTGTTCTGGGCTTGCTAGGCTCAACGTCCTTGGCCCTCGCTTCTCCA GCTGCCGAACCGGCTGAAGGGAACAGACTCATCCCTCGTGGATCTGCTTGCACCTATTCAGGAGTCAATGGTGCAGC TGCAGCGATAGCCGGAAAGGCAGGTTGCTCCAGTATTACTCTCAATAACGTTGCAGTGCCTGCCGGGACTACGCTGG ATTTGACTGGTCTGGCCGCGGGTACCAAGGTGATATTTGAGGGAACCACTACTTTCGGCCATAAGCAGTGGGTGGGC CCTCTGATCTCCATCTCTGGGTACAACATCGCAGTTTCTGGGGCTGCCGGTCACGTCATTGATGGCCAAGGTGCCCG CTGGTGGGATGGAAAGGGTTCCAACACCAAGACCAATATCAAACCTAAGTTCTTCCTCGCCCACAATCTCAAGGGAG CCTCCACTATTACGGGGTTGAACATCAAGGATACTCCCGTTCAGGTCTTCAGCATCGATAGCTCGTCGGGTCTGACG ATCAGTGGTGTCACAATTGACAACAGAAATGGTGATAAGGGTTCTCTCGGTCACAACACCGACGGGTTCGATATCGG CGACAGTGATCACATTACCATCACTGGTGCTACAGTTTATAACCAAGACGACTGCCTGGCCATCAATTCTGGGACGA ACATTATTTTCTCCGGCGGTTACTGCTCTGGTGGGCACGGATTGTCTATCGGCTCAGTCGGTGGCCGTTCCAATAAT GTGGTAGACACCGTCCATATCAGCAGCACCCAGGTCGTCAACTCTCAGAATGGTGTCCGTGTCAAAGCTGTCGCTGG CGCCACCGGTAGTATCAAAGGCGTGACTTACCAGGATATTACCCTCTCCGGCATTACGAGCCAGGGAGTCACCATCC GCCAAGACTACACCAATTCTGGCTACACTGGAAACCCCACGACCCAGGTTCCAATCACTGGACTCACCTTGAATAAT GTGCACGGCACGGTCACATCCAGTGGCACCGATATCACCGTCGAGTGTGGAAGTGCTGCCAGTTGTTCAGGCTGGAC TTGGACTAAAGTTGCAGTCAGTGGCGGCAAGGCGGATTTGTGCAAGAATGCACCTGCCAACACTTGCTAA
[0013] 本發(fā)明還是提供一種制備所述多聚半乳糖醛酸酶突變體的方法，其技術(shù)方案如 下：
[0014] 1)采用over-lap PCR的方法擴(kuò)增所述突變體序列片段；
[0015] 2)將上述突變體序列片段克隆到表達(dá)載體pPIC 9r上，重組載體命名 pPIC9r-PG63T108Y ;將本發(fā)明的多聚半乳糖醛酸酶突變體基因插入到表達(dá)載體合適的限制 性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最 優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將多聚半乳糖醛酸酶基因插入到質(zhì)粒pPIC9r上的SnaB I和Not I 限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9r-PG63T108Y。
[0016] 3)將突變體重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株，優(yōu)選所述菌株為大腸 桿菌、酵母菌（畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞等）、芽孢桿菌或乳酸桿菌， 優(yōu)選將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，得到重組菌株GSl 15/PG63T108Y。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種制備所述突變體的方法，包括以下步驟：
[0018] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0019] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組多聚半乳糖醛酸酶表達(dá)；
[0020] 3)回收并純化所表達(dá)的突變酶。
[0021] 本