一種酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其基因和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其制備方法和應(yīng)用。所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。該酶最適pH為3.5、熱穩(wěn)定性好(最適溫度70℃，在60、70℃中處理1h都能保持80％以上的酶活)，容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點(diǎn)都意味著新發(fā)明的外切多聚半乳糖醛酸酶在飼料、食品行業(yè)中，將會(huì)比以前報(bào)道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種酸性外切多聚半乳糖酵酸酶及其基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種酸性外切多聚半乳糖醒酸酶及其基因和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠是一類(lèi)帶負(fù)電的高分子多糖，廣泛存在于高等植物，特別是水果和蔬菜的組 織中，是果蔬植物細(xì)胞中膠層的主要成分。果膠由不同醋化度的D-半乳糖醒酸Wa-1，4糖巧 鍵連接而成的多糖鏈，常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等組成的側(cè)鏈，分子量介于 2540~36040之間。果膠類(lèi)物質(zhì)分為4類(lèi)：原果膠（91'〇1:〇96(31:;[]1)、果膠（96(31:;[]1)、果膠酸 (pectic acid,pectate)和果膠醋酸(pectinic acid,pectinate)。果膠酶是分解果膠質(zhì)的 多種酶的總稱，它能將高分子果膠多糖降解為小分子或單體還原糖形式，能夠有效降解果 膠，因此果膠酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用化ucie Parenicova et al.,FEBS Letters(2000) 467:333-336)。按作用機(jī)制果膠酶可W分為原果膠酶、解聚酶和果膠醋酶。解聚酶又可分為 果膠水解酶和果膠裂解酶。其中水解酶通過(guò)水解作用切割D-半乳糖酸的a-l，4糖巧鍵生成 寡聚半乳糖醒酸，而裂解酶則通過(guò)反式消去作用切斷0-1，4糖巧鍵生成0-4，5不飽和半乳糖 醒酸，果膠醋酶水解果膠中的甲醋，生成果膠酸(Nilay Demir et al. Journal of Food 化gineering(2001)47:275-280)。
[0003] 多聚半乳糖醒酸鏈可通過(guò)裂解酶和水解酶兩種方式進(jìn)行解聚。多聚半乳糖醒酸酶 (PolygalacUironase，End〇-/EC 3.2.1.15，Ex〇-/EC 3.2.1.67)作用于多聚半乳糖醒酸鏈 的a-l，4-d-糖巧鍵，發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生單個(gè)或寡聚的半乳糖醒酸。多聚半乳糖醒酸酶的研 究和應(yīng)用最為廣泛（Sharma et al.,Reviews in Environmental Science and Bio/ Technology 2013,12:45-60。
[0004] 多聚半乳糖醒酸酶是果膠酶系中研究最為廣泛的酶種，屬于糖巧水解酶第28家 族，特異催化水解多聚半乳糖醒酸鏈中0-1,4-糖巧鍵產(chǎn)生單個(gè)或寡聚的半乳糖醒酸，而不 能水解甲醋化或乙酷醋化的多聚半乳糖醒酸。與其他糖巧水解酶一樣，多聚半乳糖醒酸酶 有內(nèi)切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶化C 3.2.1.15)的水解產(chǎn)物 是寡聚半乳糖醒酸，而細(xì)菌和真菌來(lái)源的外切多聚半乳糖醒酸酶化C 3.2.1.67)的水解終 產(chǎn)物有所不同：細(xì)菌外切多聚半乳糖醒酸酶水解終產(chǎn)物為半乳糖醒酸;真菌外切多聚半乳 糖醒酸酶的水解終產(chǎn)物為二聚半乳糖醒酸。
[0005] 不同來(lái)源的多聚半乳糖醒酸酶，酶學(xué)性質(zhì)差異顯著。大多數(shù)外切多聚半乳糖醒酸 酶的最適pH值屬于堿性范圍，外切多聚半乳糖醒酸酶的最適溫度保持在50-60°C的范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一種酸性、耐熱外切多聚半乳糖醒酸酶。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醒酸酶的編碼基因。
[000引本發(fā)明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醒酸酶基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醒酸酶基因的重組菌株。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供一種制備外切多聚半乳糖醒酸酶的方法。
[0011] 本發(fā)明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醒酸酶的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品等行業(yè)中應(yīng)用的新的外切多聚半乳糖醒酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1： 1 M邸SNTLTQA rSLL化GLilV E.GSGI腳郷D MC肥冊(cè)陽(yáng)R PMPPS肥技化 51 TCHfE艦G腑TOD漲肌LQA L哦CN服嫌V V碰攬KTYll的化觀邱成 101 NVDIEILGTI QFTNDTMYWQ AMF1QIYQN ATTFFQLGGE： DVNVYGGGTI 151 DGNGQVWYDL YAQNPLILRP ILMGII化KG GT1G化KL賊 SPQW孤V'M
[0013] 2的，SSD化FDGLD ISGFSTSKNT AKNTDGWDLY RSNNIVIQNS VINNGDDCVS 茲 1 FKP肥TE化V Q化肥服細(xì)G ISVGSLGQYL 組VDIVKNVL VYNISMFNAS 3的，DGARIKVWPG VSSAMS扣LQ GGGGLGSVSN ITYDTMYIEN VDYAIEVTQC 3邑 I YGQS化化CN EYPSNMT1SD I 耶NN抑GTT 沈KYEPLVGS 1VCSSPNVCS 401 DIYATNIDVE SPEGTNEFAC TNVDKS化AI DCV*
[0014] 該酶全長(zhǎng)433個(gè)氨基酸，N端22個(gè)氨基酸為信號(hào)膚序列"MKFSNTLTQA I化LSLGLAV EG"。
[0015] 因此，成熟的外切多聚半乳糖醒酸酶的理論分子量為45. OkDa，其氨基酸序列如 沈Q ID NO.2:
[0016] 1漲I附娜孤A畑P孤P郎PM PP細(xì)桃VKTC HVE.畑G服VD DSK饑LQALH 5;1 QC'娜祕(mì)防巧瓶賺巧n知化腳TFL腳V t)化化GUQF TNDT腳fQAN 101 AF鎖lYQ臟T IFF化G獨(dú)DV NY魄說(shuō)口 DG NGQVWYDLYA 卿PUL 反機(jī)L 1腳齡口化瓶GT說(shuō)既KL照欲QtmFViWSS ;WL抑化0廣你 ST漲腳AK 201 肌DGWDLY勝 NNIVIQ殿…NM^DCVSFK P殿把工LVQN L取腑甜GIS:
[0017] 251 y啟L彌孔斌化I:VK膊L?Y mSM願(yuàn)A漲G ARI軟WP餅S SAM站化Q雜 301 G孤照的了 YDTM拍ENVITYAIEV巧:(；孤 QSNLTIXNEY KSNMITS的H 351做師'恥竹SK邸EPLV殺:IV C縱PNVC漲IYAT姐DVE辨 E灼'NEF莊C械 401 VDKSTi.AiDC
[001引該外切多聚半乳糖醒酸酶的最適pH為3.5，在陽(yáng)1.0-pH7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適溫度 70°C，在85°C時(shí)依然具有30%的酶活力，在60處理化酶活能保持80% W上，70°C中處理比酶 活能保持60% W上，在80°C下處理2min，能夠保持60% W上的酶活力，具有良好的熱穩(wěn)定 性。
[0019]本發(fā)明還提供了編碼上述外切多聚半乳糖醒酸酶的基因。該酶的全基因序列如 沈Q ID NO.3所示： 1 ATGAAGTTCT CCMTACCGT TACCGAGGGA MCAGCGTGT TCTCTGTGGG CCTGSGCGTG 61 GAAGGGTCAG GGATCAATAT TCAGAGAGAT GATGCGTGCC ACCCACACCG TCCGTTCAGG 121 CCTATGCCTC CGACTCACCC CCGAGTCAAA ACATGCCATG TTGAGAACCA CGGCMTGGC 181 GTTGATGACT CGAAGAATAT CCTGCAGGCT TTGCACCAAT GCAACAACGG TGGCMGGTT 241 GTCTTCGACG AGG(]TAAGAC GTACACCATT GGAACCGCAT TGGACATGAC TTTCTTGAAG 301 AACGTCGACA TTGAAATCCT CGGCACGATC CAGTTCACCA ACGACACAAA CTACTGGCAA 361 GCCAATGCCT TCMACAGAT CTACCAGAAC GCGACGACCT TCTTCCA成T CGGAGGCGAG 421 GACGTCAACG TCTACGGAGG CGGCACCATC GACGGCAACG GTCAGGTCTG GTACGACCTG 481 TATGCGCAGA ATCCCCTGAT TCTTCGTCCC ATCTTGATGG GA化CATTGG TCTCMGGGA 日41 GGCACCATTG GACCTCTGAA GCTCCGCTAT TCGCCTCAGT GG則CCACTT CGTTGCCMC , 1 目01 TCGTCGGATG TGCTCTTCGA CGGCCTCGAT ATCTCGGGTT TCAGCACGAG CAAGMCACC
[0020] 661 GCTAAGAACA CTGATGGATG GGATTTGTAT CGCTCCAACA ACATTGTCAT CCAGMCTCT 721 GTG/VTCAATA ACGGTGATGA TTGCGTCTCC TTCMGCCCA ACTCCACCGA GATCCTCGTC 781 CAGAACCTCC ACTGCAATGG CTCGCACGGC ATCTCTGTCG GTTCTCTTGG 洗&[1化說(shuō)1節(jié) 841 GGAGAAGTTG ACATCGTGAA GAACGTTCTC GTCTACAATA TCTCCATGTT CAATGCTTCG 901 GATGGTGCCC GTATTAAGGT GTGGCCTGGT GTGTCCTCGG CTATGTCCAT CGACTTGCAG 961 GGTGGCGGTG GTCTGGGCAG CGTGTCCAAC ATCACCTACG ACACCATGTA CATCGAGAAT 1021 GTCGACTATG CCATCGAGGT GACTCAGTGC TACGGACAGA GCAACCTGAC TCTTTGCAAC 1081 GAGTACCCTA GCMCATGAC CATCTCCGAT ATCCACTTCA ATAACTTCCA CGGCACGACC 1141 TCTAAGAAGT ACGAGCCTCT TGTTGGAAGC ATCGTCTGCT CGAGCCCTAA TGTCTGCTCC 1201 GATATCTACG CCACAAACAT CGACGTCGAG AGCCCCGAGG GCACAAATGA ATTCGCTTGC 1261 ACAAATGTCG ATAAGAGCAC TTTGGCCATC GACTGCGTAT AG
[0021] 其中，信號(hào)版的堿基序列為：
[0022] "ATGAAGTTCT CCAATACCCT TACCCAGGCA ATCAGCCTGT TGTCTCTGGG CCTCGCCGTG GAAGGG，，
[0023] 因此，成熟基因的編碼序列為
[0024] 沈Q ID NO .4所示： 1 TCAGGGATCA ATATTCAGAG AGATGATGCG TGCCACCCAC ACCGTCCGTT CAGGCCTATG 61 CCTCCGAGTC ACCCCCGAGT CAAAACATGC CATGTTGAGA ACGACGGCAA TGGCGTTGAT 121 GACTCGAAGA ATATCCTGCA GGCTTTGCAC CAATGCAACA ACGGTGGCAA GGTTGTCTTC 181 GACGAGGGTA AGACGTACAC CATTGGAACC GCATTGGACA TGACTTT燈T GAAGMCGTC 241 GACATTGAAA TCCTCGGCAC GATCCAGTTC ACCAACGACA CAAACTACTG GCAAGCCAAT 301 GCCTTCAAAC AGATCTACCA GAACGCGACG ACCTTCTTCC AGCTCGGAGG CGAGGACGTC 3目 1 AACGTCTACG GAGGCGGCAC CATCGACGGC AACGGTCAGG TCTGGTACGA €(：了6化'防(擊 421 CAGAATCCCC TGATTCTTCG TCCCATCTTG ATGGGAATCA TTGGTCTCAA GGGAGGCACC 481 ATTGGACCTC TGAAGCTCCG CTATTCGCCT CAGTGGTACC ACTTCGTTGC CAACTCGTCG 日41 GATGTGCTCT TCGACGGCCT CGATATCTCG GGTTTCAGCA CGAGCAAGM aCCGCTAAG
[0025] 601 AACACTGATG GATGGGATTT GTATCGCTCC AACAACATTG TCATCCAGAA CTCTGTGATC 661 AATAACGGTG ATGATTGCGT CTCCTTCAAG CCCMCTCCA CCGAGATCCT CGTCCAGAAC 721 CTCCACTGCA ATGGCTCGCA CGGCATCTCT GTCGGTTCTC TTGGCCAGTA CCTGGGAGAA 781 GTTGACATCG TGAAGAACGT TCTCGTCTAC AATATCTCCA TGTTCAATGC TTCGGATGGT 841 GCCCGTATTA AGGTGTGGCC TGGTGTGTCC TCGGCTATGT CCM'CGACTT GCAGGGTGGC 901 GGTGGTCTGG GCAGCGTGTC CAACATCACC TACGACACCA TGTACATCGA GAATGTCGAC 961 TATGCCATCG AGGTGACTCA GTGCTACGGA CAGAGCAACC TGACTCTTTG CAACGAGTAC 1021 CCTAGCAACA TGACCATCTC CGATATCCAC TTGAATAACT TCGACGGCAC GACCTCTAAG 1081 AAGTACGAGC CTCTTGTTGG AAGCATCGTC TGCTCGAGCC CTAATGTCTG CTCCGATATC 1141 TACGCCACAA ACATCGACGT CGAGAGCCCC GAGGGCACAA ATGAATTCGC TTGCACAAAT 12:01 GTCGATMGA GCACTTIGGC CATCGACiGC GTATAG
[0026] 該酶屬于糖基水解酶第28家族，通過(guò)比對(duì)該酶為一種新的外切多聚半乳糖酸酸 酶。
[0027] 本發(fā)明還提供了包含上述外切多聚半乳糖酸酸酶基因的重組載體，優(yōu)選為畢赤酵 母表達(dá)載體。將本發(fā)明的外切多聚半乳糖酸酸酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位 點(diǎn)之間，使其核骨酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí) 施方案，優(yōu)選為將外切多聚半乳糖酸酸酶基因 cDNA插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR巧日Notl限制 性酶切位點(diǎn)之間，使該核骨酸序列位于A0X1啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá) 質(zhì)粒。
[0028] 本發(fā)明還提供了包含上述外切多聚半乳糖酸酸酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組畢 赤酵母菌株。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種制備外切多聚半乳糖酸酸酶酶的方法，包括W下步驟：
[0030] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0031] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組外切多聚半乳糖酸酸酶的表達(dá);^及
[0032] 3)回收并純化所表達(dá)的外切多聚半乳糖酸酸酶。
[0033] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母（Pichia pastoris)細(xì)胞、峰酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞或多型漢遜酵母化ansenulapolymorpha)細(xì)胞，優(yōu)選將 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)GS115,得到重組菌株D
[0034] 本發(fā)明還提供了上述外切多聚半乳糖酸酸酶的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程手段來(lái)產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)外切多聚半乳糖酸酸酶。本發(fā)明從藍(lán)狀菌中得到了一個(gè)新的外切多聚半乳糖酸酸酶基 因，其編碼的外切多聚半乳糖酸酸酶具有W下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：酸性(最適地為3.5)、熱穩(wěn)定性好 (最適溫度70它，在60、7(TC中處理Ih都能保持80%?上的酶活），容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些 優(yōu)點(diǎn)都意味著新發(fā)明的外切多聚半乳糖醒酸酶在飼料、食品行業(yè)中，將會(huì)比w前報(bào)道的外 切多聚半乳糖醒酸酶更有應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了一個(gè)新的外切多聚半乳糖醒酸酶基因， 可作應(yīng)用于飼料、食品等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可W實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn) 性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的外切多聚半乳糖醒酸酶。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1外切多聚半乳糖醒酸酶在畢赤酵母中表達(dá)的SDS-PAGE分析，M.蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)，1純化的重組酶，2脫糖基后的重組酶。
[0036] 圖2本發(fā)明重組外切多聚半乳糖醒酸酶的最適pH值。
[0037] 圖3本發(fā)明外切多聚半乳糖醒酸酶的pH穩(wěn)定性。
[0038] 圖4本發(fā)明外切多聚半乳糖醒酸酶最適反應(yīng)溫度。
[0039] 圖5本發(fā)明外切多聚半乳糖醒酸酶熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 試驗(yàn)材料和試劑
[0041 ] 1、菌株及載體:表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115,表達(dá)質(zhì)粒載體PPIC9為本公司 保存。
[0042] 2、酶類(lèi)及其它生化試劑：內(nèi)切酶購(gòu)自Fermen化S公司，連接酶購(gòu)自Promaga公司，多 聚半乳糖醒酸購(gòu)自Sigma公司。其它都為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得 到)。
[00創(chuàng) 3、培養(yǎng)基：
[0044] (1)LB培養(yǎng)基:0.5%酵母提取物，1%蛋白腺，l%NaCl，pH 7.0
[0045] (2 )Yro培養(yǎng)基:1 %酵母提取物，2 %蛋白腺，2 %葡萄糖
[0046] (3)MD 固體培養(yǎng)基:2% 葡萄糖，1.5% 瓊脂糖，1.34%YNB，0.00004%Biotin
[0047] (4)MM 固體培養(yǎng)基：1.5%瓊脂糖，1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.5%甲醇
[004引 （5)BMGY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，1%甘油（V/V)，1.34%YNB， 0.00004%Biotin
[0049] (6)BMMY 培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，l.：M%YNB，0.00004%Biotin，0.5% 甲醇(V/V)
[0050] 4、本實(shí)施例中未做詳細(xì)具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第=版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。
[0051] 實(shí)施例1外切多聚半乳糖醒酸酶編碼基因的獲得
[0052] 設(shè)計(jì)克隆引 物 F:at 邑 aa 邑 ttctccaatacccttaccca 邑邑 C 和 R: c1:a1:acgcagtcgatggccaaagtgc tc。提取藍(lán)狀菌KWB1總RNA，利用01 i go (?。?日和反轉(zhuǎn)錄酶得到 cDNA的一條鏈，然后設(shè)計(jì)擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框的的引物巧日R，擴(kuò)增該單鏈cDNA，獲得外切多聚半 乳糖醒酸酶的cDNA序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送測(cè)序。W藍(lán)狀菌KWB1總DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：951：5111111;941：3〇36。，621：3〇36。，721：6〇36。，30個(gè)循環(huán)，72°(：1〇111111。 得到一約1.3k bp片段，測(cè)序正確后獲得全長(zhǎng)編碼基因。cDNA長(zhǎng)1302bp，編碼433個(gè)氨基酸和 一個(gè)終止密碼子，N端22個(gè)氨基酸為其信號(hào)膚序列。
[0053] 實(shí)施例2外切多聚半乳糖醒酸酶工程菌株的構(gòu)建
[0054] (1)表達(dá)載體的構(gòu)建及在酵母的表達(dá)
[0055] W測(cè)序正確的外切多聚半乳糖醒酸酶的cDNA為模板，設(shè)計(jì)合成了帶有EcoR I和 Not I限制性酶切位點(diǎn)的引物cdna-sF: actgaattctcagggatcaatattcagagagatgatgcg和 cdnaR:atagcggccgcctatacgcagtcgatggccaaagtgctc，對(duì)外切多聚半乳糖醒酸酶的成熟蛋 白的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)入表達(dá)載體PPIC9,外切 多聚半乳糖醒酸酶成熟蛋白的序列插入到上述表達(dá)載體的信號(hào)膚序列的下游，與信號(hào)膚形 成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行DNA測(cè)序，測(cè)序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Bgl II進(jìn) 行線性化表達(dá)質(zhì)粒載體DNA，電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，30°C培養(yǎng)2-3天，挑取在MD平 板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)實(shí)驗(yàn)，具體操作請(qǐng)參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)。
[0056] W同樣的方式構(gòu)建含外切多聚半乳糖醒酸酶信號(hào)膚序列的cDNA的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn) 化。
[0057] (2)高外切多聚半乳糖醒酸酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選
[005引用滅過(guò)菌的牙簽從長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化子的MD板上挑取單菌落，按照編號(hào)先點(diǎn)到MD平板上， 將MD平板置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天，至菌落長(zhǎng)出。按編號(hào)從MD平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種 于裝有3mL BMGY培養(yǎng)基的離屯、管中，30°C、220巧m搖床培養(yǎng)4她;將搖床培養(yǎng)4她的菌液3， 000 X g離屯、15min，去上清，離屯、管中再加入ImL含有0.5 %甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30 °C、 220巧m誘導(dǎo)培養(yǎng);誘導(dǎo)培養(yǎng)4她后，3，000 X g離屯、5min，取上清用于酶活性檢測(cè)，從中篩選出 高外切多聚半乳糖醒酸酶活性的轉(zhuǎn)化子，具體操作請(qǐng)參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)。
[0059] 實(shí)施例3重組外切多聚半乳糖醒酸酶的制備
[0060] (1)外切多聚半乳糖醒酸酶基因在畢赤酵母中搖瓶水平的大量表達(dá)
[0061 ]篩選出酶活較高的轉(zhuǎn)化子，接種于300mL BMGY液體培養(yǎng)基的1LS角瓶中，30°C， 220rpm搖床振蕩培養(yǎng)4她；5，OOOrpm離屯、5min，輕柔棄上清，再向菌體加入lOOmL含有0.5 % 甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基，30°C，220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)72h。誘導(dǎo)培養(yǎng)期間，間隔24h補(bǔ)加一次甲醇 溶液W補(bǔ)償甲醇的損失，使甲醇濃度保持在0.5 %左右；（3) 12，000 X g離屯、1 Omin，收集上清 發(fā)酵液，檢測(cè)酶活性并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析(圖1)。
[0062] (2)重組外切多聚半乳糖醒酸酶的純化
[0063] 收集搖瓶表達(dá)的重組外切多聚半乳糖醒酸酶上清液，通過(guò)膜包進(jìn)行濃縮，同時(shí)用 低鹽緩沖液置換其中的培養(yǎng)基，然后用超濾管進(jìn)一步的濃縮。濃縮能稀釋到一定倍數(shù)的重 組外切多聚半乳糖醒酸酶，通過(guò)離子交換層析進(jìn)行純化。具體地，取重組外切多聚半乳糖醒 酸酶濃縮液2.0血經(jīng)預(yù)先用20mM化is-HCl(pH7.5)平衡過(guò)的Hi化apQSepharose)(L陰離 子柱，然后用0-lmol/L的化C1進(jìn)行線性梯度洗脫，對(duì)分步收集的洗脫液檢測(cè)酶活性和進(jìn)行 蛋白濃度的測(cè)定。
[0064] 實(shí)施例4重組外切多聚半乳糖醒酸酶部分性質(zhì)分析
[0065] 采用DNS法對(duì)本發(fā)明的外切多聚半乳糖醒酸酶進(jìn)行活性分析。具體方法如下:在抑 3.5，70°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括10化L適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00化底物，反應(yīng)lOrnin，加入 1.5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測(cè)定0D值。外切多聚半乳糖醒酸酶活性單位 定義:在一定條件下，每分鐘分解多聚半乳糖醒酸生成Iwiiol還原糖所需的酶量為1個(gè)活性 單位化)。
[0066] (1)外切多聚半乳糖醒酸酶的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0067] 經(jīng)純化的實(shí)施例3表達(dá)的外切多聚半乳糖醒酸酶在不同的抑下進(jìn)行酶促反應(yīng)W測(cè) 定其最適pH。所用緩沖液為pH 1.0~3.0甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH2.2~8.0的巧樣酸一憐酸 氨二鋼系列緩沖液，pH 8.0~g.OTris-肥緩沖液，PH9.0~12甘氨酸-NaOH系列緩沖液。純化 的外切多聚半乳糖醒酸酶在不同pH的緩沖體系。80°C下測(cè)定的pH適性結(jié)果（圖2)表明：。該 外切多聚半乳糖醒酸酶的最適抑為3.5。
[0068] 將酶液在不同pH值的緩沖液中于37 °C下處理60min，再測(cè)定酶活性W研究酶的pH 穩(wěn)定性。結(jié)果表明（圖3)，分析結(jié)果表明該酶在pH2.0-PH8.0之間穩(wěn)定，具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定 性。
[0069] (2)外切多聚半乳糖醒酸酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性
[0070] 純化的外切多聚半乳糖醒酸酶在pH 3.5條件下，測(cè)定不同溫度(40-90°C)下的酶 活性，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明顯示，最適溫度70°C，在80°C時(shí)依然具有60%的酶活力（圖4)，在60 °C下處理60min，酶活基本不損失，在70°C下處理60min，能夠保持60% W上的酶活力，在80 °C下處理2min，能夠保持60% W上的酶活力，具有良好的熱穩(wěn)定性(圖5)。
[0071] W多聚半乳糖醒酸(O.lmol/L巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液)為底物，所述突變體和 野生型在最適條件下的比活力分別為388U/mg，Vmax=1001U/min/mg,Km=3.8mg/rnL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酸性外切多聚半乳糖醛酸酶，其特征在于，所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的 氨基酸序列如SEQIDN0.1或SEQIDN0.2所示。2. -種酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的酸性外切 多聚半乳糖醛酸酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQIDN0·3或SEQIDN0·4所示。4. 包含權(quán)利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重組表達(dá)載體。5. 包含權(quán)利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重組細(xì)胞。6. -種酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： 1) 以權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； 2) 培養(yǎng)步驟1)獲得的宿主細(xì)胞； 3) 分離純化權(quán)利要求1所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶。7. 權(quán)利要求1所述外切多聚半乳糖醛酸酶的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK106047840SQ201610405968
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月10日
【發(fā)明人】李學(xué)軍, 喬偉, 張金偉, 陳 勝, 夏平宇, 趙邦紅
【申請(qǐng)人】北京盛拓達(dá)生物技術(shù)有限公司