本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用，尤其是涉及一種產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用
背景技術：
：L-賴氨酸(L-Lysine)，學名為L-2,6-二氨基己酸，分子式為C6H14N2O2.HCL，分子量為182.65。L-賴氨酸是蛋白質的重要組分之一，是人體不能自身合成但又十分需要的八種氨基酸之一，可以提高蛋白質的利用率，從而大大強化食品的營養(yǎng)，起到促進生長發(fā)育、增加食欲、減少疾病、增強體質的作用。L-賴氨酸是世界上第二大氨基酸生產(chǎn)品種，廣泛應用于動物飼料、醫(yī)藥和食品工業(yè)。其中約90％用于飼料工業(yè)，10％用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。用于動物飼料添加劑，L-賴氨酸可幫助機體吸收其他氨基酸，從而提高飼料質量。L-賴氨酸最初是從蛋白質水解物中分離得到的，蛋白質水解法一般以動物血粉為原料，此法最多的特點是工藝流程簡單，但是原料來源很有限，僅適合小規(guī)模生產(chǎn)。此后又出現(xiàn)了化學合成法、水解法、酶法。Gilvarg等于上世紀50年代首先報道了腸桿菌屬的一株代表菌株結腸芽孢桿菌生物合成賴氨酸途經(jīng)。1957年日本開始采用野生菌株發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸，1960年日本的本下祝郎等用紫外線照射谷氨酸棒桿菌得到一株營養(yǎng)缺陷性變異株，從此開始了發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)商品賴氨酸?，F(xiàn)在，工業(yè)上主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸。用于工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的菌株主要是棒狀桿菌和短桿菌等的變異株，棒狀桿菌具有極高的經(jīng)濟價值，其中谷氨酸棒狀桿菌應用最為廣泛。此外，賴氨酸生產(chǎn)還有應用大腸桿菌、黃色短桿菌、釀酒酵母、乳酸發(fā)酵短桿菌、假絲酵母等的報道。谷氨酸棒桿菌是革蘭氏陽性微生物，具有生長速度快、非致病、對自身代謝物弱降解能力的特性，作為傳統(tǒng)工業(yè)微生物，谷氨酸棒桿菌廣泛用于生產(chǎn)L-氨基酸、核苷酸及其他有機酸。但目前L-賴氨酸的菌種的發(fā)酵性能仍較差、產(chǎn)酸率仍較低，仍不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種L-賴氨酸產(chǎn)量高的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌，具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)賴氨酸輸出蛋白和丙酮酸羧化酶活性同時增強。賴氨酸輸出蛋白的活性增強，對L-賴氨酸的積累具有促進作用，可以提高L-賴氨酸的產(chǎn)率。而丙酮酸羧化酶是回補途徑關鍵酶，丙酮酸羧化酶活性增強可為L-賴氨酸合成提供更多前體，進一步提高L-賴氨酸的積累能力。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因和編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因表達同時增強。本領域技術人員可以理解所述賴氨酸輸出蛋白和丙酮酸羧化酶酶活性的增強不限于基因表達的增強。進一步的，基因表達的增強的基因編輯技術包括但不限于編碼基因拷貝數(shù)增加、點突變。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因的拷貝數(shù)增加和編碼丙酮酸羧化酶的pycP458S基因的表達增強。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌MHZ-0913-3，其細胞內(nèi)增加一拷貝編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因和具有一個位點突變的編碼丙酮酸羧化酶的pycP458S基因，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13407。本發(fā)明提供了一種所述谷氨酸棒桿菌的構建方法，包括：步驟A、構建lysE基因的重組載體，轉化谷酸棒桿菌MHZ-0912-1中獲得重組菌株；步驟B、構建pycP458S的重組載體，轉化步驟1獲得的重組菌株即得。優(yōu)選的，pyc基因點突變P458S和插入突變的引入均是通過sacB重組系統(tǒng)完成的。優(yōu)選的，所述載體為pK18mobsacB。即所述lysE基因的重組載體為pK18mobsacB-lysE。所述pycP458S的重組載體為pK18mobsacB-pycP458S。利用本發(fā)明獲得的谷氨酸棒桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，可獲得L-賴氨酸的有效積累，為L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。因此本發(fā)明還提供了所述谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸中的應用。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌為保藏編號為CGMCCNo.13407的谷氨酸棒桿菌MHZ-0913-3進一步的，本發(fā)明還提供了一種L-賴氨酸的生產(chǎn)方法，將保藏編號為CGMCCNo.13407的谷氨酸棒桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。其中，優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖60g/L，(NH4)2SO425g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L組成，pH7.0。優(yōu)選的，所述發(fā)酵條件為33℃，發(fā)酵14-15h。由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌，具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)賴氨酸輸出蛋白和丙酮酸羧化酶活性同時增強。本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌增強了賴氨酸輸出蛋白的活性從而促進L-賴氨酸的積累，增加L-賴氨酸的產(chǎn)量，同時增強丙酮酸羧化酶活性，為L-賴氨酸合成提供更多前體，進一步提高L-賴氨酸的積累能力，使培養(yǎng)基中L-賴氨酸的量增多，進而提高菌株發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸的能力。實驗表明本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌為L-賴氨酸高產(chǎn)菌株，能有效積累L-賴氨酸，提高L-賴氨酸的產(chǎn)量，為L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。生物保藏說明MHZ-0913-3，分類命名：谷氨酸棒桿菌，Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.13407。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為重組質粒pK18mobsacB-lysE的示意圖。圖2為重組質粒pK18mobsacB-pycP458S的示意圖。圖3示MHZ-0912-1及MHZ-0913-1、MHZ-0913-2、MHZ-0913-3發(fā)酵后L-賴氨酸產(chǎn)量統(tǒng)計圖。具體實施方式本發(fā)明公開了一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。為了進一步理解本發(fā)明，下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細闡述，如無特殊說明，本發(fā)明實施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。其中，菌株MHZ-0912-1已在中國CN105734004A中公開。以下實施例中使用的引物序列信息如表1所示。表1引物序列信息引物名稱引物序列(5’-3’)SEQIDNO.lysE-1fcgcggatcctctagtttcccatcaaccatgta1lysE-1rcgagcatcacgtgggtcgagtgtatttgggcgaaggccaccgattc2lysE-2fcccaaatacactcgacccacgtgatgctcgagagctttaacgcgc3lysE-2rgatttcccacgacgccggcatcaacctaacccatcaacatcagtt4lysE-3fgatgggttaggttgatgccggcgtcgtgggaaatctcatcgatcg5lysE-3rtggctgcagttggaagaaaccatgtacgc6pyc-1fgagcatgcgggcaaccacgtcttcatcgaaa7pyc-1rctgaaggaggtgcgagtgatcggcaatga8pyc-2ftcattgccgatcactcgcacctccttcag9pyc-2rctagctagcggggtgtatcccacggtgttgcg10實施例1：重組質粒pK18mobsacB-lysE的構建及在出發(fā)菌株MHZ-0912-1中增加一拷貝lysE以ATCC13032基因組為模板，以lysE-1f/lysE-1r引物對進行PCR擴增，得到上游片段lysE-up+lysE；以ATCC13032基因組為模板，以lysE-2f/lysE-2r引物對進行PCR擴增，得到片段lysE，以ATCC13032基因組為模板，以lysE-3f/lysE-3r引物對進行PCR擴增，得到片段lysE-dn。以lysE-up+lysE，lysE，lysE-dn三片段混合物為模板，以lysE-1f/lysE-3r引物對進行PCR擴增，得到帶有兩拷貝的lysE片段。片段用BamHI、PstI進行雙酶切，載體pK18mobsacB用同樣的酶雙切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進行連接，轉化Trans1T1感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pK18mobsacB-lysE。按照谷氨酸棒桿菌手冊(C.glutamicumHandbook，Charpter23)制備MHZ-0912-1感受態(tài)細胞。重組質粒pK18mobsacB-lysE以電穿孔方法轉化該感受態(tài)細胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI選擇培養(yǎng)基上篩選轉化子，其中兩拷貝的lysE基因片段由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉化子過夜培養(yǎng)于普通BHI液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為33℃，回轉搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過程中，轉化子發(fā)生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固體培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。長出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過PCR擴增目的序列，和核苷酸測序分析，獲得增加一拷貝lysE的菌株，并命名為MHZ-0913-1。實施例2：重組質粒pK18mobsacB-pycP458S的構建及在MHZ-0912-1中引入點突變，增強丙酮酸羧化酶的活性以ATCC13032基因組為模板，以pyc-1f/pyc-1r引物對進行PCR擴增，得到上游片段pyc-up；以ATCC13032基因組為模板，以pyc-2f/pyc-2r引物對進行PCR擴增，得到下游片段pyc-dn。以pyc-up、pyc-dn兩片段混合物為模板，以pyc-1f/pyc-2r引物對進行PCR擴增，得到突變的pycP458S片段。pycP458S片段用SphI、NheI進行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進行連接，轉化Trans1T1感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pK18mobsacB-pycP458S。按照谷氨酸棒桿菌手冊制備MHZ-0912-1感受態(tài)細胞，重組質粒pK18mobsacB-pycP458S以電穿孔方法轉化該感受態(tài)細胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI選擇培養(yǎng)基上篩選轉化子，其中突變的pycP458S片段由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉化子過夜培養(yǎng)于普通BHI液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為33℃，回轉搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過程中，轉化子發(fā)生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固體培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。長出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過PCR擴增目的序列，和核苷酸測序分析，獲得突變的pycP458S片段的菌株，并命名為MHZ-0913-2。實施例3：重組質粒pK18mobsacB-pycP458S的構建及在MHZ-0913-1中引入點突變，增強丙酮酸羧化酶的活性按照實施例2所述的方法構建重組質粒pK18mobsacB-pycP458S：以ATCC13032基因組為模板，以pyc-1f/pyc-1r引物對進行PCR擴增，得到上游片段pyc-up；以ATCC13032基因組為模板，以pyc-2f/pyc-2r引物對進行PCR擴增，得到下游片段pyc-dn。以pyc-up、pyc-dn兩片段混合物為模板，以pyc-1f/pyc-2r引物對進行PCR擴增，得到突變的pycP458S片段。pycP458S片段用SphI、NheI進行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進行連接，轉化Trans1T1感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pK18mobsacB-pycP458S。按照谷氨酸棒桿菌手冊制備MHZ-0913-1感受態(tài)細胞。重組質粒pK18mobsacB-pycP458S以電穿孔方法轉化MHZ-0913-1感受態(tài)細胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI選擇培養(yǎng)基上篩選轉化子，其中突變的pycP458S片段由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉化子過夜培養(yǎng)于普通BHI液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為33℃，回轉搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過程中，轉化子發(fā)生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固體培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。蔗糖培養(yǎng)基上長出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過PCR擴增目的序列，和核苷酸測序分析，獲得帶有突變的pycP458S片段的菌株，并命名為MHZ-0913-3。實施例4：L-賴氨酸基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸分別將MHZ-0912-1菌株以及實施例1至實施例3所述菌株于500ml三角搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時間14-15小時，每組實驗設置三個平行。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO425g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L，NaOH調(diào)pH＝7.0。各菌株發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸結果見表2。表2各菌株發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸結果由表2可知，增加一拷貝lysE的菌株MHZ-0913-1的L-賴氨酸產(chǎn)量和糖酸轉化率與對照組菌株MHZ-0912-1相比有所提高，具有顯著差異。同樣突變pycP458S片段的菌株MHZ-0913-2的L-賴氨酸產(chǎn)量和糖酸轉化率與對照組菌株MHZ-0912-1相比也有所提高，具有顯著差異。同時增加一拷貝lysE基因和突變pycP458S片段的菌株MHZ-0913-3，相比對照組菌株，產(chǎn)量和轉化率有大幅度提高，L-賴氨酸產(chǎn)量提高了7g/L，轉化率提高了11.6％。綜上所述，本發(fā)明所構建的L-賴氨酸基因工程菌MHZ-0913-3(保藏編號為CGMCCNo.13407)能夠實現(xiàn)發(fā)酵過程中L-賴氨酸的有效積累，且具有較高的糖酸轉化率，該菌株具有廣泛的工業(yè)應用前景。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技術開發(fā)有限公司<120>一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用<130>MP1623785<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1cgcggatcctctagtttcccatcaaccatgta32<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>2cgagcatcacgtgggtcgagtgtatttgggcgaaggccaccgattc46<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>3cccaaatacactcgacccacgtgatgctcgagagctttaacgcgc45<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>4gatttcccacgacgccggcatcaacctaacccatcaacatcagtt45<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>5gatgggttaggttgatgccggcgtcgtgggaaatctcatcgatcg45<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>6tggctgcagttggaagaaaccatgtacgc29<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>7gagcatgcgggcaaccacgtcttcatcgaaa31<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8ctgaaggaggtgcgagtgatcggcaatga29<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>9tcattgccgatcactcgcacctccttcag29<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>10ctagctagcggggtgtatcccacggtgttgcg32當前第1頁1 2 3