本發(fā)明涉及具有提高的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率的微生物及利用它進(jìn)行的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物飼料、人類(lèi)醫(yī)藥品及化妝品產(chǎn)業(yè)中使用L-賴(lài)氨酸，且通過(guò)利用棒狀桿菌屬菌株或埃希氏菌屬菌株進(jìn)行發(fā)酵而生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸。近來(lái)，正在進(jìn)行各種研究以開(kāi)發(fā)高效生產(chǎn)菌株及發(fā)酵工程技術(shù)。
對(duì)生產(chǎn)啤酒和紅酒的酵母進(jìn)行用于調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的氣泡的各種研究的過(guò)程中，在最近的研究中發(fā)現(xiàn)了影響氣泡的產(chǎn)生的基因(AWA1、FPG1、CFG1)(Shimoi H.等，2002，Appl.Environ.Microbiol.68:2018-25；Blasco L.等，Yeast.2011，28:437-51；Blasco L.等，J.Agric.Food Chem.2012，60:10796-07)。其中，推究出了如下事實(shí)：與親本菌株相比，在這些基因遭失活的菌株中所產(chǎn)生的氣泡顯著減少，而與此相反地，在這些基因被過(guò)量表達(dá)的菌株中所產(chǎn)生的氣泡有所增加。
在培養(yǎng)酵母時(shí)，通過(guò)如下的一系列過(guò)程產(chǎn)生氣泡。首先，在發(fā)酵時(shí)所產(chǎn)生的微細(xì)氣泡中摻雜有酵母甘露糖蛋白(mannoprotein)。此時(shí)，氣泡內(nèi)部被疏水性位點(diǎn)占據(jù)，氣泡外部被親水性位點(diǎn)占據(jù)。由于這種結(jié)果而導(dǎo)致培養(yǎng)液的粘性增加，不僅摻雜有多種蛋白質(zhì)，而且還摻雜有細(xì)胞，從而產(chǎn)生氣泡(Swart CW.等，F(xiàn)EMS Yeast Res.2012，12:867-69)。
在利用酵母的啤酒生產(chǎn)中需要產(chǎn)生適量的氣泡，但在用于大量生產(chǎn)氨基酸等有用產(chǎn)物的微生物發(fā)酵中需要抑制氣泡的產(chǎn)生。當(dāng)在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量氣泡時(shí)，由于增加培養(yǎng)液的粘性而降低培養(yǎng)液內(nèi)的傳氧速率(Oxygen Transfer Rate，OTR)，嚴(yán)重時(shí)還有可能誘發(fā)菌體的溶解(lysis)。此外，從產(chǎn)業(yè)層面來(lái)看，用于抑制氣泡產(chǎn)生的過(guò)量消泡劑的使用可能會(huì)成為提高制造成本的負(fù)擔(dān)因素，且有可能帶來(lái)阻礙菌體生長(zhǎng)的負(fù)面影響。
鑒于此，本發(fā)明人以棒狀桿菌屬菌株為對(duì)象，篩選出影響過(guò)量氣泡的產(chǎn)生的基因，并確認(rèn)可通過(guò)從基因?qū)用嬗行У乜刂茪馀莸漠a(chǎn)生而提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，以致于完成本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于提供一種具有提高的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率的棒狀桿菌屬微生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述棒狀桿菌屬微生物來(lái)生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法。
技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)如上所述的目的，本發(fā)明的一方面提供一種選自由序列號(hào)1、7及13的氨基酸序列組成的組中的至少一個(gè)的分泌蛋白失活的棒狀桿菌屬微生物。
本發(fā)明的另一方面提供一種通過(guò)培養(yǎng)上述棒狀桿菌屬微生物而生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明的微生物為由于涉及氣泡產(chǎn)生的分泌蛋白失活而具有提高的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率的菌株。若利用該菌株，能夠減少氣泡的產(chǎn)生，因此在不進(jìn)行工藝設(shè)備的增設(shè)或不投入附加的大量消泡劑的情況下，能夠增加可培養(yǎng)的生產(chǎn)量。此外，從產(chǎn)業(yè)層面來(lái)看，有望實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的簡(jiǎn)便性及制造成本的降低等效果，從而能夠有效地生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸。
具體實(shí)施方式
下面，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
作為一方面，本發(fā)明提供一種選自由序列號(hào)1、7及13的氨基酸序列組成的組中的至少一個(gè)的分泌蛋白失活的棒狀桿菌屬微生物。
當(dāng)用于生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的大量培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量氣泡時(shí)，由于會(huì)增加培養(yǎng)液的粘性而降低培養(yǎng)液內(nèi)的傳氧速率(Oxygen Transfer Rate，OTR)，嚴(yán)重時(shí)還有可能誘發(fā)菌體的溶解(lysis)。即，從抑制氣泡的產(chǎn)生的層面來(lái)看，認(rèn)為使作為氣泡產(chǎn)生的原因的分泌蛋白失活的方式對(duì)賴(lài)氨酸的生產(chǎn)有利。
因此，在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，為了篩選作為賴(lài)氨酸生產(chǎn)中所不必要的氣泡產(chǎn)生的原因的主要分泌蛋白以改善L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公開(kāi)之后，被重新保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，并且授予的登記號(hào)為KCCM11016P；韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0159812號(hào))之后，通過(guò)僅分離發(fā)酵過(guò)程中生成的氣泡而確保了縮氨酸。通過(guò)對(duì)這樣確保的縮氨酸進(jìn)行分析而從中選擇檢測(cè)量相對(duì)最多的三種蛋白質(zhì)，篩選出由編號(hào)為NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912(由NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)針對(duì)谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032所賦予的編號(hào))的基因編碼的縮氨酸。
在本發(fā)明中，由上述NCgl0336基因編碼的縮氨酸為棒狀桿菌屬微生物內(nèi)存在的酯酶。具體而言，上述縮氨酸可包含序列號(hào)1的氨基酸，且只要是作為本發(fā)明中公開(kāi)的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白質(zhì)，對(duì)上述序列號(hào)1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、優(yōu)選為具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，由于微生物的物種或菌株的不同而在呈現(xiàn)上述活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間有可能存在差異，因此并不限于此。只要是作為與上述序列具有同源性的序列而實(shí)質(zhì)上具有與序列號(hào)1的氨基酸序列相同或相應(yīng)的生物學(xué)活性的氨基酸序列，則即使是存在部分序列的缺失、變形、置換或附加的氨基酸序列也屬于本發(fā)明的范圍，這是顯而易見(jiàn)的。
在本發(fā)明中，上述NCgl0336基因具有序列號(hào)2的核苷酸序列，且對(duì)上述序列號(hào)2的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列、優(yōu)選為具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，起因于基因密碼的簡(jiǎn)并性(genetic code degeneracy)，對(duì)相同氨基酸序列進(jìn)行編碼的上述序列的變異體也包含在本發(fā)明中。此外，對(duì)本發(fā)明的NCgl0336進(jìn)行編碼的多核苷酸在嚴(yán)格條件(stringent conditions)下可與序列號(hào)2的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探針(probe)雜交，并且該多核苷酸可以是對(duì)正常發(fā)揮功能的NCgl0336進(jìn)行編碼的變異型。
在本發(fā)明中，由上述NCgl0717基因編碼的縮氨酸為棒狀桿菌屬微生物內(nèi)存在的酯酶。具體而言，上述縮氨酸可包含序列號(hào)7的氨基酸，且只要是作為本發(fā)明中公開(kāi)的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白質(zhì)，對(duì)上述序列號(hào)7的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、優(yōu)選為具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，由于微生物的物種或菌株的不同而在呈現(xiàn)上述活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間有可能存在差異，因此并不限于此。只要是作為與上述序列具有同源性的序列而實(shí)質(zhì)上具有與序列號(hào)7的氨基酸序列相同或相應(yīng)的生物學(xué)活性的氨基酸序列，則即使是存在部分序列的缺失、變形、置換或附加的氨基酸序列也屬于本發(fā)明的范圍，這是顯而易見(jiàn)的。
在本發(fā)明中，上述NCgl0717基因具有序列號(hào)8的核苷酸序列，且對(duì)上述序列號(hào)8的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列，優(yōu)選為具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，起因于基因密碼的簡(jiǎn)并性(genetic code degeneracy)，對(duì)相同氨基酸序列進(jìn)行編碼的上述序列的變異體也包含在本發(fā)明中。此外，對(duì)本發(fā)明的NCgl0717進(jìn)行編碼的多核苷酸在嚴(yán)格條件(stringent conditions)下可與序列號(hào)8的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探針(probe)雜交，并且該多核苷酸可以是對(duì)正常發(fā)揮功能的NCgl0717進(jìn)行編碼的變異型。
在本發(fā)明中，由上述NCgl2912基因編碼的縮氨酸為棒狀桿菌屬微生物內(nèi)存在的酯酶。具體而言，上述縮氨酸可包含序列號(hào)13的氨基酸，且只要是作為本發(fā)明中公開(kāi)的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白質(zhì)，對(duì)上述序列號(hào)13的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、優(yōu)選為具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，由于微生物的物種或菌株的不同而在呈現(xiàn)上述活性的蛋白質(zhì)氨基酸序列之間有可能存在差異，因此并不限于此。只要是作為與上述序列具有同源性的序列而實(shí)質(zhì)上具有與序列號(hào)13的氨基酸序列相同或相應(yīng)的生物學(xué)活性的氨基酸序列，則即使是存在部分序列的缺失、變形、置換或附加的氨基酸序列也屬于本發(fā)明的范圍，這是顯而易見(jiàn)的。
在本發(fā)明中，上述NCgl2912基因具有序列號(hào)14的核苷酸序列，且對(duì)上述序列號(hào)14的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列、優(yōu)選為具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更優(yōu)選為具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特別優(yōu)選為具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。此外，起因于基因密碼的簡(jiǎn)并性(genetic code degeneracy)，對(duì)相同氨基酸序列進(jìn)行編碼的上述序列的變異體也包含在本發(fā)明中。此外，對(duì)本發(fā)明的NCgl2912進(jìn)行編碼的多核苷酸在嚴(yán)格條件(stringent conditions)下可與序列號(hào)14的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探針(probe)雜交，并且該多核苷酸可以是對(duì)正常發(fā)揮功能的NCgl2912進(jìn)行編碼的變異型。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“同源性”是指與指定的氨基酸序列或堿基序列一致的程度，可用百分比來(lái)表示。在本明細(xì)中，具有與指定的氨基酸序列或堿基序列相同或類(lèi)似的活性的其同源性序列用“％同源性”來(lái)表示。關(guān)于上述氨基酸序列的同源性，例如可使用文獻(xiàn)記載的算法BLAST[參照：Karlin及Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))USA，90，5873(1993)]或由Pearson發(fā)表的FASTA[參照：Methods Enzymol.(酶學(xué)方法)，183，63(1990)]來(lái)確定?；谠撍惴˙LAST，還開(kāi)發(fā)出了被稱(chēng)作BLASTN或BLASTX的程序[參照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指能夠進(jìn)行多核苷酸之間的特異性雜交的條件。例如，在文獻(xiàn)(J.Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南),2nd Edition(第二版),Cold Spring Harbor Laboratory press(美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室),Cold Spring Harbor(冷泉港),New York(紐約),1989；F.M.Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)),John Wiley&Sons,Inc.(約翰·威利父子出版公司),New York(紐約))中具體記載了這種嚴(yán)格條件。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“失活”可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任意失活方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，失活是指生成內(nèi)源基因的表達(dá)與野生菌株相比減少至較低水準(zhǔn)或完全不會(huì)表達(dá)的基因以及即使表達(dá)也沒(méi)有其活性或具有減少的活性的基因，且可通過(guò)采用缺失、置換、插入以使基因的整體或部分堿基序列或者該基因的整體或部分表達(dá)調(diào)控序列變異而實(shí)現(xiàn)失活，或者通過(guò)它們的組合而實(shí)現(xiàn)失活。
具體而言，通過(guò)利用重組載體對(duì)棒狀桿菌屬微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化以使內(nèi)源基因缺失或突變，從而可制造上述內(nèi)源基因的活性失活的微生物，其中，上述重組載體包含內(nèi)部丟失上述內(nèi)源基因的開(kāi)放閱讀框的基因片段?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任意方法來(lái)向染色體內(nèi)插入上述基因。
本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源”酶及活性是指微生物或細(xì)胞中本來(lái)存在的天然狀態(tài)的酶及其活性。即，是指該酶及活性變異之前的酶及其活性。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“重組載體”是指含有對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸堿基序列的DNA構(gòu)建體，其中，上述多核苷酸堿基序列被連接至適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列上以能夠發(fā)揮功能，從而在適當(dāng)?shù)乃拗鲀?nèi)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。上述調(diào)控序列包含能夠開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、用于調(diào)節(jié)這種轉(zhuǎn)錄的任意操縱序列、對(duì)適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行編碼的序列、以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄及解讀終止的序列。載體被轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗鲀?nèi)之后，能夠在不受宿主基因組的影響的情況下被復(fù)制或發(fā)揮其功能，并且也可以整合到基因組本身。只要本發(fā)明中所使用的載體能夠在宿主中被復(fù)制就并不特別限定，且可利用本領(lǐng)域眾所周知的任意載體。
在上述重組載體的制備中使用的載體可以是天然狀態(tài)或重組狀態(tài)的質(zhì)粒、粘粒、病毒及噬菌體。例如，作為噬菌體載體或粘粒載體可使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A及Charon21A等，作為質(zhì)粒載體可使用pDZ載體、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及pET系等?？墒褂玫妮d體并不特別限定，可使用公知的表達(dá)載體。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指通過(guò)將包含對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸的載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠使由上述多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)。只要導(dǎo)入的多核苷酸能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，就可被插入并位于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)或位于染色體外。此外，上述多核苷酸包含對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA及RNA。只要上述多核苷酸能夠被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)，則可以以任何形態(tài)被導(dǎo)入。例如，上述多核苷酸可以以具備自行表達(dá)所需要的所有因素的多核苷酸結(jié)構(gòu)體的形態(tài)，即表達(dá)盒(expression cassette)的形態(tài)被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。上述表達(dá)盒通常包含被連接到上述基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“ORF”)上以能夠發(fā)揮功能的啟動(dòng)子(promoter)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合點(diǎn)位以及翻譯終止信號(hào)。上述表達(dá)盒可以是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的表達(dá)載體的形態(tài)。此外，上述多核苷酸也可以以其自身形態(tài)被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)而在宿主細(xì)胞中與表達(dá)所需要的序列連接以能夠發(fā)揮功能。
如果導(dǎo)入上述重組載體的親本菌株為能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的微生物，則可無(wú)限制地使用，具體而言可使用棒狀桿菌屬或短桿菌屬微生物，更具體而言可使用谷氨酸棒狀桿菌微生物。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的微生物”可以是通過(guò)調(diào)控通常公知的基因以使得能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸而獲取的微生物，例如可以是通過(guò)插入選自由涉及L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的、棒狀桿菌屬微生物內(nèi)存在的aspB(對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行編碼的基因)、lysC(對(duì)天冬氨酸激酶進(jìn)行編碼的基因)，asd(對(duì)天冬氨酸鹽半醛脫氫酶進(jìn)行編碼的基因)、dapA(對(duì)二氫吡啶二羧酸合成酶進(jìn)行編碼的基因)、dapB(對(duì)二氫吡啶二羧酸還原酶進(jìn)行編碼的基因)及l(fā)ysA(對(duì)二氨基庚二酸脫羧酶進(jìn)行編碼的基因)組成的組中的基因中的一個(gè)或多個(gè)而獲取的微生物，或者可以是對(duì)導(dǎo)入L-亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷性的變異菌株進(jìn)行N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理而獲取的微生物。
更具體而言，在本發(fā)明中作為棒狀桿菌屬微生物，使用谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公開(kāi)之后，被重新保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，并且授予的登記號(hào)為KCCM11016P；韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0159812號(hào))、谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770P(韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0924065號(hào))、谷氨酸棒狀桿菌L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11347P(上述微生物曾以KFCC10750被公開(kāi)之后，被重新保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，并且授予的登記號(hào)為KCCM11347；韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0073610號(hào))及谷氨酸棒狀桿菌CJ3P菌株(Binder等，Genome Biology(基因組生物學(xué))2012，13:R40)，但并不限于此。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物可以是谷氨酸棒狀桿菌(KCCM11502P、KCCM11481P、KCCM11482P)。
作為另一方面，本發(fā)明還提供一種利用上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法。更具體而言，提供一種生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法，其包括以下步驟：通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的微生物而在培養(yǎng)物或細(xì)胞中生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸；以及從上述培養(yǎng)物中回收L-賴(lài)氨酸。
在本發(fā)明的方法中，棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)可使用本領(lǐng)域眾所周知的任意培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方法。
作為能夠用于培養(yǎng)棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)基，例如可使用在美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)(Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)中公開(kāi)的培養(yǎng)基。
作為培養(yǎng)基中可使用的糖原，包括：諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素等的糖和碳水化物；諸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等的油和脂類(lèi)；諸如軟脂酸、硬脂酸、亞油酸等的脂肪酸；諸如甘油、乙醇等的醇類(lèi)；以及諸如乙酸等的有機(jī)酸類(lèi)。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
作為培養(yǎng)基中可使用的氮源，包含蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉及尿素或者如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨等的無(wú)機(jī)化合物。氮源也可以單獨(dú)或混合使用。
作為培養(yǎng)基中可使用的磷源，包含磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的鈉鹽。此外，培養(yǎng)基應(yīng)包含諸如硫酸鎂或硫酸鐵等的生長(zhǎng)所需要的金屬鹽。最后，在上述物質(zhì)的基礎(chǔ)上可使用如氨基酸及維生素等的必要生長(zhǎng)物質(zhì)。此外，可以在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)那绑w。在培養(yǎng)過(guò)程中，上述原料可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞椒峙蜻B續(xù)被加入到培養(yǎng)物中。
在上述微生物的培養(yǎng)中，可通過(guò)以適當(dāng)方式使用諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等的基礎(chǔ)化合物或諸如磷酸或磺酸等的酸式化合物來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH。此外，可通過(guò)使用諸如聚乙二醇脂肪酸酯等的消泡劑來(lái)抑制氣泡的生成。可通過(guò)向培養(yǎng)物內(nèi)導(dǎo)入氧氣或含氧氣體(例如，空氣)，使培養(yǎng)基保持有氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常為20℃至45℃，優(yōu)選為25℃至45℃。培養(yǎng)時(shí)間可持續(xù)到直至獲得所需的L-氨基酸的生成量為止，但優(yōu)選為10至160小時(shí)。
在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)可通過(guò)諸如分批工藝、注入分批及反復(fù)注入分批工藝等的連續(xù)方式或分批方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域中被廣為人知，從而可使用任意方法。
下面，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)說(shuō)明。但是，這些實(shí)施例用于示例性地說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。
[實(shí)施例]
實(shí)施例1：篩選與培養(yǎng)中的氣泡產(chǎn)生有關(guān)的分泌蛋白
在本實(shí)施例中，以篩選作為氣泡產(chǎn)生原因的分泌蛋白為目的，通過(guò)以下方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
首先，將谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公開(kāi)之后，被重新保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，并且授予的登記號(hào)為KCCM11016P；韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0159812號(hào))菌株在1L發(fā)酵槽中培養(yǎng)之后，僅分離發(fā)酵過(guò)程中生成的氣泡，并將該氣泡轉(zhuǎn)移到15ml試驗(yàn)管中后進(jìn)行濃縮。
為了對(duì)氣泡濃縮樣品中所包含的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，將包含界面活性劑的適量染色劑(loading dye)混合到樣品中，之后使用8％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)，并通過(guò)考馬斯藍(lán)染色法(coomassie blue staining)對(duì)結(jié)束電泳后的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色。然后，切開(kāi)已染色的蛋白條帶(band)的位點(diǎn)且進(jìn)行胰蛋白酶處理以確保縮氨酸，并通過(guò)LC-MS/MS方法來(lái)分析已確保的縮氨酸的氨基酸序列。
通過(guò)由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLAST檢索，使用棒狀桿菌屬微生物中存在的基因來(lái)對(duì)分析完的縮氨酸進(jìn)行鑒定。通過(guò)從已鑒定的縮氨酸中選擇出檢測(cè)量相對(duì)多的三種而最終篩選該蛋白質(zhì)的基因，且篩選出的基因的NCBI編號(hào)為NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912。
實(shí)施例2：制備用于使分泌蛋白NCgl0336基因失活的重組質(zhì)粒
為了在棒狀桿菌染色體中制備能夠使NCgl0336基因失活的重組質(zhì)粒，根據(jù)已上報(bào)至美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因銀行(NIH Genbank)的堿基序列，確保NCgl0336的序列號(hào)1的氨基酸及序列號(hào)2的核苷酸序列。為了制備N(xiāo)Cgl0336的內(nèi)部丟失開(kāi)放閱讀框(open reading frame)的基因片段，以上述序列號(hào)2為基礎(chǔ)分別制備序列號(hào)為3至6的引物。
序列號(hào)3：5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3'
序列號(hào)4：5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3'
序列號(hào)5：5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3'
序列號(hào)6：5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'
以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，并將序列號(hào)3及序列號(hào)4、序列號(hào)5及序列號(hào)6用作引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories(美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室)]。PCR條件為反復(fù)進(jìn)行如下過(guò)程30次：95℃下進(jìn)行變性30秒鐘；50℃下進(jìn)行退火30秒鐘；以及72℃下進(jìn)行聚合反應(yīng)1分鐘。
其結(jié)果，獲得了包含342bp和315bp的NCgl0336基因位點(diǎn)的兩對(duì)DNA片段，即NCgl0336-A及NCgl0336-B。通過(guò)使用Infusion克隆試劑盒(Invitrogen)而將用PCR擴(kuò)增的上述DNA片段接合到pDZ質(zhì)粒(韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0924065號(hào))之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。通過(guò)PCR篩選出被轉(zhuǎn)化為插入有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的菌落之后，利用公知的質(zhì)粒提取法來(lái)獲取質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pDZ-ΔNCgl0336。pDZ-ΔNCgl033中丟失了NCgl0336的基因503bp。
實(shí)施例3：制備用于使分泌蛋白NCgl0717基因失活的重組質(zhì)粒
為了在棒狀桿菌染色體中制備能夠使NCgl0717基因失活的重組質(zhì)粒，根據(jù)已上報(bào)至美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因銀行(NIH Genbank)的堿基序列，確保NCgl0717的序列號(hào)7的氨基酸及序列號(hào)8的核苷酸序列。為了制備N(xiāo)Cgl0717的內(nèi)部丟失開(kāi)放閱讀框(open reading frame)的基因片段，以上述序列號(hào)8為基礎(chǔ)分別制備序列號(hào)為9至12的引物。
序列號(hào)9：5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3'
序列號(hào)10：5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3'
序列號(hào)11：5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3'
序列號(hào)12：5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'
以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，并將序列號(hào)9及序列號(hào)10、序列號(hào)11及序列號(hào)12用作引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為反復(fù)進(jìn)行如下過(guò)程30次：95℃下進(jìn)行變性30秒鐘；50℃下進(jìn)行退火30秒鐘；以及72℃下進(jìn)行聚合反應(yīng)1分鐘。
其結(jié)果，獲得了包含493bp和491bp的NCgl0717基因位點(diǎn)的兩對(duì)DNA片段，即NCgl0717-A及NCgl0717-B。通過(guò)使用Infusion克隆試劑盒(Invitrogen)而將用PCR擴(kuò)增的上述DNA片段接合到pDZ質(zhì)粒之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。通過(guò)PCR篩選出被轉(zhuǎn)化為插入有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的菌落之后，利用公知的質(zhì)粒提取法來(lái)獲取質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pDZ-ΔNCgl0717。pDZ-ΔNCgl0717中丟失了NCgl0717的基因786bp。
實(shí)施例4：制備用于使分泌蛋白NCgl2912基因失活的重組質(zhì)粒
為了在棒狀桿菌染色體中制備能夠使NCgl2912基因失活的重組質(zhì)粒，根據(jù)已上報(bào)至美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因銀行(NIH Genbank)的堿基序列，確保NCgl2912的序列號(hào)13的氨基酸及序列號(hào)14的核苷酸序列。為了制備N(xiāo)Cgl2912的內(nèi)部丟失開(kāi)放閱讀框(open reading frame)的基因片段，以上述序列號(hào)14為基礎(chǔ)分別制備序列號(hào)為15至18的引物。
序列號(hào)15：5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3'
序列號(hào)16：5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3'
序列號(hào)17：5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3'
序列號(hào)18：5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'
以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，并將序列號(hào)15及序列號(hào)16、序列號(hào)17及序列號(hào)18用作引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為反復(fù)進(jìn)行如下過(guò)程30次：95℃下進(jìn)行變性30秒鐘；50℃下進(jìn)行退火30秒鐘；以及72℃下進(jìn)行聚合反應(yīng)1分鐘。
其結(jié)果，獲得了包含444bp和636bp的NCgl2912基因位點(diǎn)的兩對(duì)DNA片段，即NCgl2912-A及NCgl2912-B。通過(guò)使用Infusion克隆試劑盒(Invitrogen)而將用PCR擴(kuò)增的上述DNA片段接合到pDZ質(zhì)粒之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。通過(guò)PCR篩選出被轉(zhuǎn)化為插入有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的菌落之后，利用公知的質(zhì)粒提取法來(lái)獲取質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pDZ-ΔNCgl2912。pDZ-ΔNCgl2912中丟失了NCgl2912的基因128bp。
實(shí)施例5：制備及評(píng)價(jià)源于賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因失活的菌株
利用電脈沖法將由上述實(shí)施例2、3及4制備的三種重組質(zhì)粒(pDZ-ΔNCgl0336、pDZ-ΔNCgl0717及pDZ-ΔNCgl2912)分別轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P中，并利用PCR方法制備目標(biāo)基因通過(guò)同源重組而在染色體中失活的菌株，而且分別命名為KCCM11016P-ΔNCgl0336、KCCM11016P-ΔNCgl0717、KCCM11016P-ΔNCgl2912。
將上述三種菌株和對(duì)照組接種到含有下述25ml種子培養(yǎng)基的250ml角擋板瓶(corner-baffle flask)中，并在30℃下以200rpm振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。然后，將1ml種子培養(yǎng)液接種到含有下述24ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml角擋板瓶中，并在37℃下以200rpm振蕩培養(yǎng)96小時(shí)。上述種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成分別如下所述。
<種子培養(yǎng)基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、(NH4)2SO4 10g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1000μg、泛酸鈣2000μg、煙酰胺2000μg(以1升蒸餾水為基準(zhǔn))
<生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、固體玉米浸出物(cornsteep solid)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺1000μg、泛酸鈣2000μg、煙酰胺3000μg、CaCO3 30g(以1升蒸餾水為基準(zhǔn))
在完成培養(yǎng)之后，通過(guò)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到量筒而測(cè)定已生成的氣泡的高度，并將利用HPLC(高效液相色譜)分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表1中。表1的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表1]
如表1所示，與親本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約6％。與此同時(shí)，可知與親本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因分別失活的菌株中產(chǎn)生的氣泡減少了約6～15％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在棒狀桿菌屬微生物中，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白質(zhì)失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
實(shí)施例6：制備及評(píng)價(jià)源于賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM10770P的分泌蛋白基因失活的菌株
為了在具有強(qiáng)化的賴(lài)氨酸生物合成途徑的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770P(韓國(guó)申請(qǐng)授權(quán)專(zhuān)利第10-0924065號(hào))中，比較分泌蛋白的失活效果是否與上述實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，利用與上述實(shí)施例5相同的方法來(lái)制備三種分泌蛋白失活的菌株，并命名為KCCM10770P-ΔNCgl0336、KCCM10770P-ΔNCgl0717、KCCM10770P-ΔNCgl2912，并一同進(jìn)行了L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率和氣泡產(chǎn)生量的比較。
為了比較上述菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，利用與實(shí)施例6相同的方法與各對(duì)照組一同培養(yǎng)之后，利用與實(shí)施例6相同的方法測(cè)定了完成培養(yǎng)后的氣泡產(chǎn)生量，并將利用HPLC分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表2中。表2的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表2]
如表2所示，與親本菌株KCCM10770P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2085、NCgl2912基因分別失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約4％。與此同時(shí)，可知與親本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2085、NCgl2912基因分別失活的菌株中產(chǎn)生的氣泡減少了約4～18％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在棒狀桿菌谷氨酸棒桿菌KCCM10770P(韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0924065號(hào))中，同樣與上述實(shí)施例6類(lèi)似地，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
實(shí)施例7：制備及評(píng)價(jià)源于L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11347P的分泌蛋白基因失活的菌株
為了在通過(guò)人工突變法制備的谷氨酸棒狀桿菌L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11347P(上述微生物曾以KFCC10750公開(kāi)之后，被重新保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，并且授予的登記號(hào)為KCCM11347P；韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第10-0073610號(hào))中也確認(rèn)分泌蛋白失活的效果，利用與上述實(shí)施例5、6相同的方法來(lái)制備三種分泌蛋白失活的菌株，并命名為KCCM11347P-ΔNCgl0336、KCCM11347P-ΔNCgl0717、KCCM11347P-ΔNCgl2912，并同時(shí)比較了L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率和氣泡產(chǎn)生量。
為了比較上述菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，利用與實(shí)施例5、6相同的方法與各對(duì)照組一同培養(yǎng)之后，利用與實(shí)施例5、6相同的方法測(cè)定了完成培養(yǎng)后的氣泡產(chǎn)生量，并將利用HPLC分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表3中。表3的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表3]
如表3所示，與親本菌株KCCM1137P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約5％。與此同時(shí)，可知與親本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2912基因分別失活的菌株中產(chǎn)生的氣泡減少了約4～15％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在谷氨酸棒狀桿菌KCCM11347P(韓國(guó)授權(quán)專(zhuān)利第94-0001307號(hào))中，同樣與上述實(shí)施例5、6類(lèi)似地，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
實(shí)施例8：制備及評(píng)價(jià)源于L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株CJ3P的分泌蛋白基因失活的菌株
為了在通過(guò)將三種變異[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]導(dǎo)入到野生菌株中而具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率的谷氨酸棒狀桿菌CJ3P(Binder等，Genome Biology 2012,13:R40)中，也如同上述實(shí)施例5、6、7那樣確認(rèn)分泌蛋白失活的效果，利用與上述實(shí)施例5、6、7相同的方法來(lái)制備三種分泌蛋白失活的菌株，并命名為CJ3P-ΔNCgl0336、CJ3P-ΔNCgl0717、CJ3P-ΔNCgl2912，并同時(shí)比較了L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率和氣泡產(chǎn)生量。
為了比較上述菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，利用與實(shí)施例5、6、7相同的方法與各對(duì)照組一同培養(yǎng)之后，利用與實(shí)施例5，6，7相同的方法測(cè)定了完成培養(yǎng)后的氣泡產(chǎn)生量，并將利用HPLC分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表4中。表4的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表4]
如表4所示，與親本菌株CJ3P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約8％。與此同時(shí)，可知與親本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2912基因分別失活的菌株中產(chǎn)生的氣泡減少了約5～17％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在谷氨酸棒桿菌CJ3P中，同樣與上述實(shí)施例5、6、7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似地，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
實(shí)施例9：制備及評(píng)價(jià)源于L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因同時(shí)失活的菌株
為了在L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌KCCM11016P中確認(rèn)分泌蛋白同時(shí)失活后的效果，利用與上述實(shí)施例5、6、7、8相同的方法來(lái)制備分泌蛋白同時(shí)失活的三種菌株，并將使各基因組合失活的菌株命名為KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717、KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912、KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912，并同時(shí)比較了L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率和氣泡產(chǎn)生量。
為了比較上述菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，利用與實(shí)施例5、6、7、8相同的方法與各對(duì)照組一同培養(yǎng)之后，利用與實(shí)施例5、6、7、8相同的方法測(cè)定了完成培養(yǎng)后的氣泡產(chǎn)生量，并將利用HPLC分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表5中。表5的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表5]
如表5所示，與親本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336/NCgl0717、NCgl0336/NCgl2912、NCgl0717/NCgl2912基因分別同時(shí)失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約5％。與此同時(shí)，可知與親本菌株相比，NCgl0336/NCgl0717、NCgl0336/NCgl2912、NCgl0717/NCgl2912基因分別同時(shí)失活的菌株的氣泡產(chǎn)生減少了約10～14％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在谷氨酸棒桿菌屬微生物中，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白同時(shí)失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
實(shí)施例10：制備及評(píng)價(jià)源于L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因均失活的菌株
為了在L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌KCCM11016P中確認(rèn)由分泌蛋白失活引起的綜合效果，利用與上述實(shí)施例5、6、7、8、9相同的方法篩選出三種分泌蛋白均失活的菌株，并命名為KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912，并同時(shí)比較了L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率和氣泡產(chǎn)生量。
為了比較上述菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，利用與實(shí)施例5、6、7、8、9相同的方法與各對(duì)照組一同培養(yǎng)之后，利用與實(shí)施例5、6、7、8、9相同的方法測(cè)定了完成培養(yǎng)后的氣泡產(chǎn)生量，并將利用HPLC分析的L-賴(lài)氨酸濃度示出到下述表6中。表6的結(jié)果為反復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值，并用平均值來(lái)評(píng)價(jià)生產(chǎn)率。
[表6]
如表6所示，可知與親本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因均失活的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)率增加了約7％，并且與親本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因均失活的菌株中所產(chǎn)生的氣泡減少了約17％左右。
因此，能夠確認(rèn)：在谷氨酸棒桿菌微生物中，通過(guò)使賴(lài)氨酸生產(chǎn)所不必要的主要分泌蛋白均失活，能夠有效地控制在培養(yǎng)中所產(chǎn)生的氣泡，由此能夠提高L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率。
從上述結(jié)果能夠確認(rèn)，通過(guò)在L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株中使主要分泌蛋白失活而控制發(fā)酵中所過(guò)量產(chǎn)生的氣泡，從而有效增加菌體生長(zhǎng)且L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率，并將上述菌株KCCM11016P-ΔNCgl0336、KCCM11016P-ΔNCgl0717及KCCM11016P-ΔNCgl2912分別命名為CA01-2281、CA01-2279及CA01-2280，且CA01-2279及CA01-2280于2013年11月22日保藏于韓國(guó)微生物保藏中心(KCCM)，CA01-2281于2013年12月13日保藏于韓國(guó)微生物保藏中心(KCCM)，并且分別被賦予登記號(hào)KCCM11481P(CA01-2279)、KCCM11482P(CA01-2280)及KCCM11502P(CA01-2281)。
[登記號(hào)]
保藏機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：韓國(guó)微生物保藏中心(國(guó)外)
登記號(hào)：KCCM11481P
登記日期：2013年11月22日
保藏機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：韓國(guó)微生物保藏中心(國(guó)外)
登記號(hào)：KCCM11482P
登記日期：2013年11月22日
保藏機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：韓國(guó)微生物保藏中心(國(guó)外)
登記號(hào)：KCCM11502P
登記日期：2013年12月13日
序列表
<110> CJ第一制糖株式會(huì)社
<120> L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)率提高的微生物及用其生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法
<130> PA13-0400
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 365
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 縮氨酸
<222> (1)..(365)
<223> 由NCgl0336基因編碼的酯酶
<400> 1
Met Lys Leu Leu Arg Arg Ile Ala Ala Pro Ala Ile Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Ala Met Ser Thr Ile Val Thr Pro Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Val
20 25 30
Thr Pro Ala Asp Val Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser Thr Ile Ser Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Asp Glu Ala Ser Ala Pro Arg Trp Arg Ala His Val
50 55 60
Asn Ala Ala Asp Glu Arg Val Lys Glu Met Trp Ala Tyr Ser Pro Ser
65 70 75 80
Met Asp Arg Asn Val Pro Leu Val Val Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ala
85 90 95
Gly Pro Arg Pro Val Ile Tyr Leu Leu Asn Gly Gly Asp Gly Gly Glu
100 105 110
Gly Ala Ala Asn Trp Val Met Gln Thr Asp Val Leu Asp Phe Tyr Leu
115 120 125
Glu Lys Asn Val Asn Val Val Ile Pro Met Glu Gly Lys Phe Ser Tyr
130 135 140
Tyr Thr Asp Trp Val Glu Glu Asn Ala Ser Leu Gly Gly Lys Gln Met
145 150 155 160
Trp Glu Thr Phe Leu Val Lys Glu Leu Pro Gly Pro Leu Glu Glu Lys
165 170 175
Leu Asn Thr Asp Gly Gln Arg Ala Ile Ala Gly Met Ser Met Ser Ala
180 185 190
Thr Thr Ser Leu Leu Phe Pro Gln His Phe Pro Gly Phe Tyr Asp Ala
195 200 205
Ala Ala Ser Phe Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Trp
210 215 220
Glu Tyr Leu Lys Leu Thr Leu Asp Arg Gly Asn Ala Thr Pro Glu Gln
225 230 235 240
Met Trp Gly Pro Arg Gly Gly Glu Tyr Asn Ile Tyr Asn Asp Ala Leu
245 250 255
Ile Asn Ser Asp Lys Leu Arg Gly Thr Glu Leu Tyr Val Ser Asn Ala
260 265 270
Ser Gly Leu Ala Gly Glu Trp Glu Ser Val Asp Ser Pro Arg Phe Glu
275 280 285
Gly Leu Asn Gln Gln Val Gln Ser Ile Ala Met Ala Glu Thr Val Val
290 295 300
Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ala Ala Thr Asn Lys Cys Thr His Asp Leu
305 310 315 320
Lys Ala Lys Leu Asp Ser Ala Gly Ile Pro Ala Asp Trp Asn Leu Arg
325 330 335
Pro Thr Gly Thr His Ser Trp Gly Trp Trp Gln Asp Asp Leu Arg Gly
340 345 350
Ser Trp Thr Thr Phe Ala Arg Ala Phe Glu Leu Glu Ala
355 360 365
<210> 2
<211> 1098
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1098)
<223> NCgl0336基因
<400> 2
atgaagcttc ttcgccgcat cgctgcacca gccatcgcgc tgggaattgc gatgtccacc 60
attgtcacgc catccaccgc aggcgctgcc gaagtaaccc cagcagacgt tgctggcgat 120
actgcactat ccaccatctc cgatagtgct cctgcagatg aagcctctgc acctcgctgg 180
cgcgcacacg tcaacgcagc agacgagcgc gtcaaagaaa tgtgggcata ctccccttcc 240
atggaccgca atgtgccact ggtagttata actgccgatg agtccgcagg tcctcgtcct 300
gtgatttacc ttcttaacgg tggcgacggt ggcgaaggtg ccgctaactg ggttatgcag 360
actgacgttc tggatttcta cctagaaaag aacgttaacg ttgttattcc aatggaaggc 420
aagttttcct actacaccga ctgggtagaa gagaatgcgt ccctcggtgg caagcaaatg 480
tgggaaacct tcctggtgaa ggaacttcca ggaccattgg aagaaaagct caacactgac 540
ggtcagcgtg caattgctgg catgtccatg tccgcaacta cttccctact cttcccacaa 600
cacttcccag gcttctacga cgcagcagca tccttctcag gatgcgcagc aacctcaagc 660
ctgctcccat gggaatacct caaactcacc cttgaccgcg gcaacgcaac cccagaacaa 720
atgtggggac cacgtggtgg cgaatacaac atctacaacg acgcactgat caactccgac 780
aaactacgcg gaaccgaact atacgtctcc aacgcatccg gccttgctgg tgaatgggaa 840
tccgtcgaca gcccacgctt cgaaggactc aaccaacaag ttcagtccat cgcaatggca 900
gaaactgtgg taaccggcgg catcatcgaa gctgcaacca acaagtgcac ccacgacctc 960
aaggcaaaac ttgactccgc cggcatccca gccgactgga acctccgccc aaccggcacc 1020
cactcatggg gctggtggca agatgacctc cgcggatctt ggaccacctt cgctcgtgcg 1080
tttgagctag aggcctag 1098
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atcctctaga gtcgacgaag cctctgcacc tcgctg 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tatagttcgg ttccgcgtct ccaacgcatc cggcc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cggaaccgaa ctataccacc gagggacgca ttctc 35
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
atgcctgcag gtcgacgctc aaacgcacga gcgaag 36
<210> 7
<211> 261
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 縮氨酸
<222> (1)..(261)
<223> 由NCgl0717基因編碼的酯酶
<400> 7
Met Lys Thr Glu Thr Arg Arg Ala Leu Val Phe Ile Val Ala Gly Cys
1 5 10 15
Leu Ala Ala Thr Ala Leu Gly Phe Met Val Trp Gln Met Ser Ser Pro
20 25 30
Ser Arg Pro Thr Ser Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr Thr Ser Thr Thr
35 40 45
Gln Thr Gln Ala Arg Tyr Asp Ser Pro Gly Asn Thr Glu Thr Lys Glu
50 55 60
Ala Glu Pro Asp Leu Glu Asn Gln Thr Leu Ala Pro Ile Asn Thr Glu
65 70 75 80
Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Phe Val Arg Pro Asp Asn Gly Arg
85 90 95
Ser Ser Gly Leu Thr Pro Ser Gly Ser Ser Pro Thr Thr Thr Ser Arg
100 105 110
Val Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Ser Ala Ser Pro Thr Gln Ile Thr
115 120 125
Ser Arg Ser Asn Glu Pro Ser Glu Pro Gly Asp Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Thr Gln Pro Ser Ser Pro Asp Arg Pro Thr Glu Pro Thr Asn Pro Val
145 150 155 160
Asp Pro Thr Gly Pro Ser Glu Pro Thr Glu Pro Thr Asp Pro Ile Glu
165 170 175
Thr Thr Asp Pro Ile Glu Thr Thr Asp Pro Val Ala Pro Ser Thr Pro
180 185 190
Pro Thr Ser Asp Asp Ser Thr Ser Thr Pro Gln Pro Asp Glu Ser Asp
195 200 205
Thr Pro Pro Thr Asp Phe Val Glu Glu Pro Thr Ala Pro Leu Asn Pro
210 215 220
Asp Gln Pro Ala Gly Ser Thr Thr Asp Ala Thr Pro Asn Ala Thr Pro
225 230 235 240
Ser Ala Pro Ala Asp Thr Thr Ser Asn Ser Val Ala Asn Ser Val Glu
245 250 255
Pro Thr Ala Thr Ser
260
<210> 8
<211> 786
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(786)
<223> NCgl0717基因
<400> 8
atgaaaacag aaactcgacg agccctcgtc ttcatcgtcg ccggctgttt agccgccacc 60
gccctgggtt ttatggtctg gcagatgtcc agcccaagcc gacccacctc tgatattgcc 120
acgtctacta ctacgtctac cacccaaacc caggctaggt acgattcccc aggtaataca 180
gagaccaaag aggcggaacc tgacctagaa aaccaaactt tggcgcccat caacaccgaa 240
gatccatatc ttccaccgaa tgcttttgtg cgtccagaca atggccgaag ctccggttta 300
accccttctg gcagttctcc aactaccacc tctcgggtga gttctccctc ctcagcagga 360
tcggcaagcc cgactcaaat cacctccagg tcaaacgagc ctagtgaacc tggtgatgag 420
tcaactgctg ctacacaacc gtcgagccca gacaggccaa ccgaacctac aaatccggta 480
gacccaactg gaccttctga acctacggaa cccaccgatc cgattgagac aaccgatccg 540
attgagacaa ccgatccggt agctccgtcc accccgccaa cgagcgatga ttcaacaagc 600
actccccaac cagatgagtc tgatacgcca cctaccgatt tcgtagagga acctactgct 660
cctctcaatc cggatcagcc agccggttca actactgatg cgacgccaaa cgcaacacca 720
agcgcaccag ctgacacaac atccaattct gtagctaact ctgtggaacc aactgccacg 780
agctaa 786
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ccggggatcc tctagagttc gcggataaat ggg 33
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cacgtgaaat tcaggtcgcg tggttcacct ccgaag 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cttcggaggt gaaccacgcg acctgaattt cacgtg 36
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcaggtcgac tctagaggtc ccatgattgt tctg 34
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 縮氨酸
<222> (1)..(107)
<223> 由NCgl2912基因編碼的酯酶
<400> 13
Met Arg Lys Leu Arg Thr Ala Ser Val Ala Leu Leu Thr Ala Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Ala Thr Pro Ala Met Ala Gln Ser Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Ser Ser Gln Val Gly Asp Ala Leu Gly Ala Ser Asp Tyr Glu
35 40 45
Arg Asp Ile Trp Gly Ser Ser Lys Asp Phe Asp Asp Val Thr Pro Phe
50 55 60
Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Thr Leu Ala Ala Thr Ala Val Ala Ile
65 70 75 80
Ser Gly Leu Val Tyr Ala Asn Leu Pro Ala Ile Glu Gln Ala Ala Ala
85 90 95
Gln Ala Gly Ile Lys Leu Glu Ile Pro Arg Tyr
100 105
<210> 14
<211> 324
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒狀桿菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(324)
<223> NCgl2912基因
<400> 14
atgcgtaaac ttcgtactgc ttccgttgca ctgctgaccg caggtgcact tgcactgacc 60
gctactcctg caatggctca gtccaccacc ggttcttctg catcttctca ggttggcgac 120
gcactcggtg ctagcgacta cgagcgcgac atctggggtt cctctaagga cttcgacgat 180
gtaaccccat tcggttccgc ttggtacggc tacaccctgg ccgcaaccgc agttgctatc 240
tccggtcttg tgtacgcaaa ccttcctgca atcgagcagg ctgctgcaca ggccggcatc 300
aagctggaga tcccacgcta ctaa 324
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ccggggatcc tctagagctg caagaagtgc gac 33
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctcgtagtcg ctagcaccta ttacgggagg tc 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gacctcccgt aataggtgct agcgactacg ag 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gcaggtcgac tctagacccg agctatctaa cac 33