本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一株具有降血清膽固醇作用的耐久腸球菌SWUN5857及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膽固醇是機(jī)體生存所必不可少的重要成分，是類脂中的一種重要的化合物，膽固醇以游離和膽固醇酯兩種形式普遍存在于動(dòng)物細(xì)胞和組織中，若膽固醇含量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生一定的危害，機(jī)體對(duì)異物的清除能力會(huì)隨體內(nèi)膽固醇水平的升高而下降，從而會(huì)導(dǎo)致致癌率的升高；血清總膽固醇含量過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，尤其是調(diào)節(jié)鈣離子濃度的低密度脂蛋白的水平過(guò)高就會(huì)增大心臟負(fù)荷，從而提高心腦血管疾病的發(fā)病率。調(diào)節(jié)機(jī)體血清膽固醇水平主要從減少機(jī)體外源攝取膽固醇、抑制膽固醇的內(nèi)源性合成、促進(jìn)機(jī)體膽固醇的代謝等方面進(jìn)行研究，目前，調(diào)節(jié)機(jī)體血清膽固醇水平主要有以下幾種方式：(1)改善生活方式并同時(shí)改變飲食結(jié)構(gòu)，(2)藥物治療，(3)應(yīng)用物理、化學(xué)方法降低或去除食物中的膽固醇低脂品如脫脂乳、脫脂蛋白等，(4)依靠某些具有降膽固醇功能的微生物如益生菌的特殊生理生化活性開發(fā)研制新型微生態(tài)制劑，使其在腸道內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)微生態(tài)系統(tǒng)平衡的同時(shí)也能起到降低。

益生菌在機(jī)體腸道內(nèi)定植后能通過(guò)自身代謝產(chǎn)物以及競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)與其他有害細(xì)菌進(jìn)行相互作用，預(yù)防和調(diào)整腸道內(nèi)的菌群失調(diào)，維持膽固醇等物質(zhì)的正常代謝，從而保護(hù)機(jī)體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的最佳狀態(tài)；同時(shí)，益生菌還可通過(guò)減少機(jī)體外源膽固醇的攝取量和調(diào)整機(jī)體膽固醇代謝功能而達(dá)到降低機(jī)體膽固醇的目的。益生菌在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮降膽固醇作用的同時(shí)，能夠識(shí)別有害菌和有益菌，抑制有害菌生長(zhǎng)，可減少由于廣譜抗菌類藥物殺死有害菌的同時(shí)也將有益菌殺死而導(dǎo)致的腸道內(nèi)菌群數(shù)量比例失衡、免疫力低下及腸道疾病等現(xiàn)象的產(chǎn)生，因此，益生菌類制劑可以避免或彌補(bǔ)抗生素類藥物產(chǎn)生的不足之處。

綜上所述，益生菌制劑在治療機(jī)體膽固醇水平偏高方面打破了傳統(tǒng)的抗生素類藥物治療的局限性，即其在治療此類疾病的同時(shí)還可改善腸道菌群平衡，因此益生菌制劑對(duì)于膽固醇水平偏高的臨床研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值，并且也是一條全新的治療途徑和未來(lái)解決人類心腦血管疾病的一個(gè)新方法，因此，研究開發(fā)具有降膽固醇功能的益生菌制劑具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問(wèn)題，提供了一種具有降血清膽固醇作用的耐久腸球菌SWUN 5857及其應(yīng)用，該菌株具有良好的作為益生菌的能力，耐酸性，耐膽鹽，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能和免疫功能都有良好的作用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了一種具有降血清膽固醇作用的耐久腸球菌SWUN 5857，該菌株已于2016年08月02日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編430072)，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016420。

進(jìn)一步地，耐久腸球菌的菌落特征具體為：菌落表面光滑，呈白色或乳白色的單個(gè)菌落，顯微鏡下呈圓形或橢圓形，無(wú)芽孢，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

進(jìn)一步地，耐久腸球菌的耐受特征為：

耐久腸球菌的菌株耐酸性較強(qiáng)，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率為99±2％；在3％濃度膽鹽下可以緩慢生長(zhǎng)，存活率為78±2％。

本發(fā)明還公開了一種上述的耐久腸球菌SWUN5857在制備具有降血清膽固醇作用的益生菌中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明耐久腸球菌SWUN 5857對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能和免疫功能都有良好的作用。

2)本發(fā)明耐久腸球菌SWUN 5857對(duì)酸和膽鹽都有良好的耐受性，在pH 1.0的情況下耐久腸球菌SWUN 5857的存活率為35％，在膽鹽濃度為0.3％的情況下耐久腸球菌SWUN 5857的存活率為78％。

3)本發(fā)明耐久腸球菌SWUN 5857具有降低血清中膽固醇的效果。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明耐久腸球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，M：DNA Maker DL2000；P：陽(yáng)性對(duì)照；1-5：耐久腸球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；N：陰性對(duì)照；

圖2是本發(fā)明乳酸菌革蘭氏染色結(jié)果(10×100)；

圖3是本發(fā)明耐久腸球菌SWUN5857的生長(zhǎng)曲線。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1菌的分離與鑒定

一、菌的分離：川西北地區(qū)牧民家庭自然發(fā)酵的牦牛酸奶中，吸取酸奶樣品1ml進(jìn)行梯度稀釋，取10^-2、10^-3、10^-4稀釋度，分別吸取200μl涂布于MRS培養(yǎng)基雙層培平板，每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)，置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)48h，待菌落長(zhǎng)出，挑取培養(yǎng)平板上具有溶鈣圈的菌落，不同形態(tài)的菌落挑取5個(gè)，不足5個(gè)者重復(fù)取樣，進(jìn)行平板劃線純化，連續(xù)純化2次。

向潔凈的玻片上滴一點(diǎn)無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌，涂布于無(wú)菌生理鹽水上，待干燥后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢并觀察菌落形態(tài)，挑選菌體呈圓形或橢圓形，無(wú)芽孢，革蘭氏染色呈陽(yáng)性的菌株統(tǒng)一編號(hào)，經(jīng)過(guò)篩選耐酸耐膽鹽等試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)SWUN5857的生物學(xué)特性效果最好(耐酸耐膽鹽結(jié)果見圖3、表2和表3)。

二、鑒定：

一)、PCR鑒定

表1引物序列

采用25μl反應(yīng)體系，DNA模板2μl，上、下游引物各1μl(10pmol)，Taq酶0.1μl(5U/ul)，含Mg+的4×dNTPs(10mmol/L)2.5μl，10×PCR buffer2.5μl，用ddH₂O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，50℃退火60s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min，4℃保存至結(jié)束。以實(shí)驗(yàn)室保存的嗜熱鏈球菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株模板作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌的ddH₂O為陰性對(duì)照檢測(cè)目標(biāo)模板，PCR產(chǎn)物由1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取陽(yáng)性模板的剩余PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

上述PCR擴(kuò)增結(jié)果大小約為1505的片段(PCR擴(kuò)增結(jié)果是1.5kb左右，上述測(cè)序結(jié)果除多余的載體序列得到結(jié)果大小約為1197bp的片段)，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如SEQ ID No.1所示。將序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與GenBank已知的耐久腸球菌(登錄號(hào)為：KM495855)同源性為99％，判斷為耐久腸球菌(Enterococcus durans)。

在四川省獸藥監(jiān)察所用細(xì)菌鑒定儀判讀生化結(jié)果，如圖1所示，結(jié)果顯示這株腸球菌均為耐久腸球菌(Enterococcus durans)。

二)、生化鑒定

將上述分子鑒定為耐久腸球菌的菌株，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平面，37℃培養(yǎng)24h，送到四川省獸藥監(jiān)察所，用無(wú)菌棉簽蘸取適量菌落，懸浮于5ml的生理鹽水中，按順序滴加菌液和試劑后，37℃恒溫培養(yǎng)24h，用細(xì)菌鑒定儀判讀結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)48h后，挑取在雙層MRS平板上具有溶鈣圈，菌落表面光滑，呈白色或乳白色的單個(gè)菌落，顯微鏡下呈圓形或橢圓形，無(wú)芽孢，革蘭氏染色呈陽(yáng)性的分離株判定為乳酸菌球菌屬(如圖2所示)。

基于以上特征，將菌株SWUN5857命名為耐久腸球菌(Enterococcus durans)SWUN5857。該菌株已于2016年8月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編430072)，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016420。

實(shí)施例2耐久腸球菌的生物特性

一、耐久腸球菌的生長(zhǎng)曲線

將充分活化的菌株按照1％的量接入200ml的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h時(shí)快速的無(wú)菌取樣2ml，于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白調(diào)零。每次取樣重復(fù)三次讀數(shù)，求平均值。用Excel軟件建立以MRS液體培養(yǎng)基為背景的耐久腸球菌SWUN5857的生長(zhǎng)曲線，如圖3所示，如圖3所示牦牛酸奶源耐久腸球菌SWUN5857遵循延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的規(guī)律。菌株在前2h處于延滯期，沒(méi)有大的變化，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，大約到11h達(dá)到生長(zhǎng)高峰，進(jìn)入穩(wěn)定期后和衰亡期后，活菌就會(huì)被自身代謝產(chǎn)物所抑制，從該曲線上可以確定該菌體的最佳收獲時(shí)間是11h。

二、耐酸性試驗(yàn)

將SWUN 5857的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，充分混勻后，按2％比例將上述菌液分別加入到pH為1.0、2.0、3.0MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3h后。于600nm處測(cè)OD值，MRS液體培養(yǎng)基為調(diào)零對(duì)照。取三個(gè)重復(fù)求平均值后，計(jì)算存活率即可代表菌株對(duì)酸的耐受性。

表2耐久腸球菌在酸存在下的存活率(％)

從表2可以得到，在pH 1.0的情況下存活率為35％，證明其對(duì)酸有很強(qiáng)的耐受性。

三、耐膽鹽試驗(yàn)

將SWUN 5857菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，充分混勻后，按2％比例將上述菌液分別加入到3％的牛膽酸鹽中，37℃恒溫培養(yǎng)3h后。于600nm處測(cè)OD值，MRS液體培養(yǎng)基為調(diào)零對(duì)照。取三個(gè)重復(fù)求平均值后，計(jì)算存活率即可代表菌株對(duì)酸的耐受性。

表3耐久腸球菌在膽鹽存在下的存活率(％)

從表3可以看出，在膽鹽濃度為0.3％的情況下的存活率為78％，證明其對(duì)膽鹽有較強(qiáng)的耐受性。

實(shí)施例3耐久腸桿菌SWUN5857對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道粘膜免疫的影響

1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理

預(yù)實(shí)驗(yàn)：將35只雌性昆明鼠適應(yīng)性飼喂小鼠三天后，隨機(jī)分為5組，每組7只，在環(huán)境為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房隔籠飼養(yǎng)，自由采食。各組處理如下：

10⁴cfu/ml組：灌服濃度為10⁴cfu/ml的耐久腸球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

10⁵cfu/mL組：灌服濃度為10⁵cfu/ml的耐久腸球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

10⁶cfu/ml組：灌服濃度為10⁶cfu/ml的耐久腸球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

10⁷cfu/ml組：灌服濃度為10⁷cfu/ml的耐久腸球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

對(duì)照組：灌服等濃度的MRS培養(yǎng)基，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

每周各組小鼠分別稱重一次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，分析結(jié)果后，篩選出對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能影響最佳的濃度進(jìn)行正式試驗(yàn)。

正式試驗(yàn)：篩選出最佳濃度后，采用與預(yù)實(shí)驗(yàn)相同的分組方法，將56只雌性昆明鼠隨機(jī)分為2組，每組28只，在環(huán)境為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房隔籠飼養(yǎng)，自由采食。各組處理如下：

10⁵cfu/ml組：灌服濃度為10⁵cfu/ml的耐久腸球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

培養(yǎng)基對(duì)照組：灌服等濃度的MRS培養(yǎng)基，0.5ml/只/d，連續(xù)7d；

各組在最后一次灌胃后間隔12h，對(duì)所有昆明小鼠肌注雞新城疫弱毒雞新城疫La Sota活毒凍干疫苗2頭份/只。在免疫結(jié)束后第7、14、21天每組取出6只小鼠，眼球采血，迅速分成兩份，一份不加抗凝劑，常溫靜置2h，血液凝固后分離獲取血清，用于血清中抗體效價(jià)的測(cè)定；另一份使用肝素抗凝后，用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。處死并解剖小鼠，分離并獲得小鼠的脾臟和胸腺。

1.2小鼠體質(zhì)量的測(cè)定

從開始灌胃起，每隔7d分別對(duì)各組小鼠稱重一次，并記錄結(jié)果。

1.3微量間接血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定抗體水平

分別將每組小鼠眼球采血獲得的0.3ml左右的非抗凝血制備的血清標(biāo)記編號(hào)，放于56℃的水浴鍋中滅活30min，采用β-微量法血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定小鼠血清中新城疫抗體的效價(jià)(王延樹,張芳.血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要領(lǐng)[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2009,(8):75-76.)。

1.3.1血球凝集試驗(yàn)(HA)

凝集試驗(yàn)在96孔V型微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右給各孔加上各加50μl生理鹽水。分別將50μl新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原加入左側(cè)第1孔，混合均勻后吸取50μl至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50μl，并以第12孔為對(duì)照孔，每個(gè)樣設(shè)三個(gè)重復(fù)行。自右向左給各孔加入1％雞紅細(xì)胞懸液50μl，室溫放置于振蕩器上小心振蕩2min，靜置10～20min，等對(duì)照孔的紅細(xì)胞完全沉淀便可進(jìn)行結(jié)果觀察，并判定標(biāo)準(zhǔn)抗原的血凝價(jià)，隨后用生理鹽水配制4個(gè)血凝單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原。

1.3.2血凝抑制試驗(yàn)(HI)

用固定病毒稀釋血清的方法，首先在96孔微量反應(yīng)板上的各行第1孔至第11孔均加50μl生理鹽水；然后每行的第1孔加入需檢測(cè)的小鼠血清50μl，對(duì)應(yīng)編號(hào)標(biāo)記，并吹吸混合均勻，均吸取50μl至第2孔，依此倍比稀釋至第11孔后棄去50μl。將96孔微量反應(yīng)板從右至左全部孔各加50μl的4個(gè)血凝單位的新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原，其中第12列為新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照。在振蕩器上小心震蕩混勻，靜置在室溫中作用15min。向各個(gè)孔均加入1％雞紅細(xì)胞懸液50μl，振蕩混勻，室溫下靜置后觀察結(jié)果。血清的血凝抑制HI抗體效價(jià)為該血清100％抑制凝集的最大稀釋度，用以2為底的負(fù)對(duì)數(shù)(-log2)表示，即Xlog2。

1.4淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

1.4.1 CCK-8測(cè)定條件選取

參考王洪鴿等(王洪鴿.白花蛇舌草多糖和超微粉的免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].西南民族大學(xué)，2013.)的L9(3⁴)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間48h、刀豆蛋白A的濃度5μg/ml、細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/孔，加入CCK-8后培養(yǎng)時(shí)間4h時(shí)為CCK-8的測(cè)定條件。

1.4.2小鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)(陳肅標(biāo)，謝素和，曾慶馀.提高外周血淋巴細(xì)胞梯度離心分離率[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011,12(2)：135-137.)中的方法。

將無(wú)菌操作采得小鼠眼球肝素抗凝血0.5ml，按Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)懸液。將抗凝血與等體積PBS輕輕震蕩混勻，然后輕輕加在等體積的小鼠淋巴細(xì)胞分離液上，置于水平轉(zhuǎn)子的離心機(jī)中離心，2000r/min離心15min。離心結(jié)束后可見位于血漿層下面的一層較薄的白色云霧狀即為PBMC，小心將此層細(xì)胞吸出，然后用5倍體積的PBS洗滌細(xì)胞，2500r/min離心10min，并重復(fù)洗滌3次。最后一次離心后，吸取掉上層PBS，留下PBMC，加入200μl左右的無(wú)菌1640完全培養(yǎng)基(25mmol/L的l-谷氨酰胺、100U/mL的雙抗和0.1mL/mL的胎牛血清)混勻，并吸取少許使用快速細(xì)胞分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后用無(wú)菌1640完全培養(yǎng)基分別將每份細(xì)胞懸液稀釋成約10⁶個(gè)/ml，配制成單細(xì)胞懸液，按組別依次編號(hào)。

將每份小鼠分離得到的的PBMC懸液中取單細(xì)胞懸液100μl以組為單位接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照參照文獻(xiàn)(趙世云,趙新新,蘇華荔,等.豬外周血T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)MTT檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,(12):35-38.)，每份樣品加兩空，分為未刺激組和ConA組，未刺激組加入10μl1640完全培養(yǎng)基，ConA組每孔分別加入10μl濃度為5μg/ml的ConA，另各設(shè)3孔作空白組，各孔只加有110μl1640完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂恒溫培養(yǎng)箱里37℃培養(yǎng)48h。小心拿出培養(yǎng)板，無(wú)菌條件下向各孔加入10μl的CCK-8溶液并小心混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)其在450nm處的吸光度A。按下面的公式計(jì)算對(duì)應(yīng)小鼠樣本的刺激指數(shù)(SI)。

1.5小鼠的臟器指數(shù)的測(cè)定

將各組小鼠眼球采血后處死，稱量并解剖各時(shí)間點(diǎn)的小鼠，獲得小鼠的脾臟和胸腺，立即用濾紙吸干表面的血液和水分，稱重并記錄，按照下面的公式計(jì)算脾臟指數(shù)(mg/g)和胸腺指數(shù)(mg/g)。

1.6腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)(付紹玲.小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法探討[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(4):48-48.)的方法，通過(guò)測(cè)定各小組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的非特異性免疫力。

從免疫后第22d開始連續(xù)3天給各組小鼠腹腔注射6％淀粉肉湯液，最后一次注射后1h后再腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液1ml，輕揉小鼠腹部，使雞紅細(xì)胞分散的同時(shí)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞滲出，半小時(shí)后斷頸處死小鼠。用酒精對(duì)小鼠體表消毒，迅速剖開腹腔，用無(wú)菌棉簽蘸取小鼠腹腔液體，涂布于干凈的玻片上，瑞氏染色鏡檢。

1.7飼喂耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠腸粘膜SIgA的影響

將48只雌鼠分為兩組，每組24只，灌胃和飼養(yǎng)同上，在灌胃7d后的第1、7、14、21d各組隨機(jī)取出6只小鼠，眼球采血獲得血清用于檢測(cè)小鼠的血液生化指標(biāo)。采用張和平等(張和平，張七斤，孟和畢力格，等.L.casei Zhang對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞亞群及血清IgG和腸黏膜SIgA的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2006,34(10):131-132)的方法，采血后立即解剖小鼠空腸和回腸,刮取腸黏膜放于1ml的PBS里，充分?jǐn)嚢瑁?0000rmp離心15min，獲得上清液-20℃保存。采用雙抗夾心ELISA法定量測(cè)定其中的sIgA含量。

1.8飼喂耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠血液生化的影響

每組抽取不同時(shí)期的4個(gè)上述血清，送至成都里來(lái)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，檢測(cè)血液生化指標(biāo)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss19.0軟件對(duì)以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行LSD比較，以P﹤0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，以_χ±s表示。

2.結(jié)果

2.1耐久腸桿菌SWUN5857對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)中給藥結(jié)束后不同時(shí)期各組小鼠體質(zhì)量見表4。

表4飼喂耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(g，X±S，n＝7)

注：**代表與對(duì)照組相比p<0.01,*代表與對(duì)照組相比p<0.05。下同。

從表4可見，給藥結(jié)束后的各時(shí)間段內(nèi)，10⁴cfu/ml組、10⁵cfu/ml組、10⁶cfu/ml組與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)，而10⁷cfu/ml組只有在灌胃結(jié)束后1d與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)，其中飼喂10⁵cfu/ml組對(duì)小鼠的體質(zhì)量的影響最大。結(jié)果表明，耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠體質(zhì)量，不同濃度的耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響存在差異，且從全期綜合來(lái)看10⁵cfu/ml組效果最好。

正式實(shí)驗(yàn)中灌胃結(jié)束后不同時(shí)期各組小鼠體質(zhì)量見表5。

表5飼喂10⁵cfu/ml耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(X±S,n＝10)

由表5可見，灌胃結(jié)束后的各時(shí)間段，10⁵cfu/ml組與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。結(jié)果表明，10⁵cfu/ml耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的體質(zhì)量。

2.2耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠體液免疫的影響

灌胃結(jié)束后不同時(shí)間各組小鼠血清抗ND HI抗體效價(jià)見表6。

表6灌胃耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠血清ND HI抗體效價(jià)的影響(log2,X±S,n＝6)

由表6可知，灌胃結(jié)束后第7、14d，10⁵cfu/ml組與對(duì)照組差異極顯著(p<0.01)。結(jié)果表明，飼喂10⁵cfu/ml耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的體液免疫。

2.3飼喂耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平的影響

灌胃結(jié)束后不同時(shí)間各組見表7。

表7灌胃耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)的影(X±S,n＝6)

由表7可知，灌胃結(jié)束后的第7、14d，10⁵cfu/ml組與對(duì)照組差異極顯著(p<0.01)，且在第14d時(shí)達(dá)到最大；第21d差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明，灌胃10⁵cfu/ml耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠細(xì)胞免疫水平。

2.4飼喂耐久腸球菌SWUN5857不同時(shí)間對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

灌胃結(jié)束后不同時(shí)間各組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)見表8和表9。

表8灌胃耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響(X±S，n＝6)

由表8可知灌胃結(jié)束后的第7天，10⁵cfu/ml組與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟指數(shù)在14天時(shí)達(dá)到最高，結(jié)果表明灌胃10⁵cfu/mL耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠脾臟指數(shù)。

表9灌胃耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響(X±S,n＝6)

由表9可知，在灌胃后的第7、14d實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺指數(shù)高于對(duì)照組，且在灌胃后第14d時(shí)達(dá)到最高，但并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義。

2.5飼喂耐久腸球菌SWUN5857腹腔巨噬細(xì)胞吞噬吞噬能力的影響

灌胃結(jié)束后第22d，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)結(jié)果見表10。

表10飼喂SWUN5857對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(X±S,n＝10)

10⁵cfu/ml組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)與對(duì)照組均差異顯著(p<0.01)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的非特異性免疫水平。

2.6耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠腸粘膜SIgA的影響

雙抗夾心ELISA法測(cè)定各時(shí)間段小鼠腸粘膜SIgA的含量見表11。

表11飼喂SWUN5857不同時(shí)間對(duì)小鼠腸粘膜SIgA的影響(ng/mL,X±S,n＝6)

由表11可知，10⁵cfu/ml組各時(shí)間段小鼠腸粘膜SIgA的含量均高于對(duì)照組，且在灌胃一周結(jié)束后的第1d與對(duì)照組差異極顯著。結(jié)果表明，飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠腸粘膜SIgA的分泌。

2.7耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠血液生化的影響

表12(a)耐久腸球菌SWUN5857不同時(shí)期各組小鼠血液生化指標(biāo)(x±S,n＝4)

表12(b)耐久腸球菌SWUN5857不同時(shí)期各組小鼠血液生化指標(biāo)(x±S,n＝4)

灌胃耐久腸球菌SWUN5857 7 d后兩組小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生化指標(biāo)見表。由表表12(a)和表12(b)可知，ALT、AST、ALP、TB、ALB、GLO、CRE、T、GLU等生化指標(biāo)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠并無(wú)毒副作用。

實(shí)施例4耐久腸球菌SWUN5857降SD大鼠膽固醇試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠、雄性、200±10g；

將28只SD大鼠適應(yīng)性飼喂7天后，隨機(jī)分成4組，每組7只；

1.對(duì)照組：高膽固醇飲食+滅菌生理鹽水(100g/ml，每天)；

2.實(shí)驗(yàn)組：

(1)高膽固醇飲食+耐久腸球菌懸浮于滅菌生理鹽水(2x10⁷CFU/ml、100g/ml，每天)；

(2)高膽固醇飲食+耐久腸球菌懸浮于滅菌生理鹽水(2x10⁸CFU/ml、100g/ml，每天)；

(3)高膽固醇飲食+耐久腸球菌懸浮于滅菌生理鹽水(2x10⁹CFU/ml、100g/ml，每天)；灌胃28天后，禁食12小時(shí)，解剖采集血液樣本。

結(jié)果如下：血液生化指標(biāo)結(jié)果見表13，其結(jié)果顯示飼喂高膽固醇飼料后，SD大鼠膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白與空白組相比都有明顯升高，而實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比膽固醇含量差異顯著(P<0.05)，結(jié)果顯示耐久腸球菌SWUN 5857能顯著降低SD大鼠血清中膽固醇。

表13耐久腸球菌SWUN5857對(duì)大鼠膽固醇等指標(biāo)的影響

注：*代表與對(duì)照組相比p<0.05。

動(dòng)物的體重是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收能力和健康狀況的總體反應(yīng)，本研究證明飼喂各個(gè)濃度的耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著增加小鼠的體重，表明耐久腸球菌有良好的促生長(zhǎng)作用；飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠循環(huán)血液中的抗體水平，延長(zhǎng)高抗體水平的作用時(shí)間，顯著提高了小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力；耐久腸球菌SWUN5857在灌胃結(jié)束后第7d顯著提高了小鼠的脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)也有一定程度的提高，但未達(dá)到顯著水平；飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠腸粘膜SIgA的分泌量，表明了耐久腸球菌SWUN5857對(duì)小鼠的腸黏膜局部免疫具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)的功能，本實(shí)驗(yàn)中灌胃7d后的各時(shí)間點(diǎn)，10⁵cfu/ml組小鼠的血液生化指標(biāo)與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，均在正常值范圍內(nèi)，表明飼喂耐久腸球菌SWUN5857一周對(duì)昆明鼠無(wú)消極影響；SD大鼠實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比膽固醇含量差異顯著(P<0.05)，表明耐久腸球菌SWUN 5857能顯著降低SD大鼠血清中膽固醇，避免了因?yàn)闄C(jī)體膽固醇過(guò)高導(dǎo)致的一些列的疾病。

由上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，耐久腸球菌SWUN5857具有良好的作為益生菌的潛力。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大學(xué)

<120> 一株具有降血清膽固醇作用的耐久腸球菌及其應(yīng)用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> 耐久腸桿菌SWUN5857

<400> 1

gcaggcgggt gctataatgc aagtcgtacg cttctttttc caccggagct tgctccaccg 60

gaaaaagaag agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga 120

taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaatcga aaccgcatgg ttttgatttg 180

aaaggcgctt tcgggtgtcg ctgatggatg gacccgcggt gcattagcta gttggtgagg 240

taacggctca ccaaggccac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattggg 300

actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcg gcaatggacg 360

aaagtctgac cgagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt 420

gttagagaag aacaaggatg agagtaactg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540

ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600

aaccggggag ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660

atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct 720

ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 840

agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960

cttaccacgt cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agcttcttct tcgggggcaa 1020

agtgacaggt ggtgcatgct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatggtgggt taagtcccgc 1080

aacgagcgca acccttattg ttagcttgca tcaattcagc tgggcactct accaggactg 1140

cacggtgaca acccggacgg acggcggggg aatgacggtc gaatcattca tggctct 1197

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctcaga ttgaacgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggttcccc tacggtta 18