一種產(chǎn)谷氨酸的溫敏型重組谷氨酸棒狀桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別涉及利用基因工程技術(shù)對(duì)谷氨酸棒桿 菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032進(jìn)行分子改造，獲得產(chǎn)谷氨酸的溫敏型重組 菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義。在食品、 醫(yī)藥與工業(yè)方面有廣泛的用途。為了提高谷氨酸產(chǎn)率，谷氨酸生產(chǎn)菌的研究工作中最為突 出的是高產(chǎn)谷氨酸菌的選育工作。從自然界分離得到的谷氨酸生產(chǎn)菌野生株，在生產(chǎn)性能 方面往往不能滿足發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的要求。谷氨酸生產(chǎn)菌株具有較大的自然變異能力，通常 負(fù)變異頻率高于正變異頻率，結(jié)果造成菌種的衰老和菌株活力減退，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn) 行業(yè)普遍存在著產(chǎn)酸率水平低、糖酸轉(zhuǎn)化率低、成本高、能耗高等瓶頸問(wèn)題，因此優(yōu)良生產(chǎn) 菌種的選育，一直是谷氨酸發(fā)酵工業(yè)上的主要研究課題之一。
[0003]目前在我國(guó)谷氨酸工業(yè)生產(chǎn)中，大部分企業(yè)使用的菌株為谷氨酸溫度敏感突變 株，該菌株具有溫度敏感的特性，在菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)提高培養(yǎng)溫度，強(qiáng)制細(xì)胞由正常 細(xì)胞轉(zhuǎn)型為細(xì)胞壁合成缺陷的細(xì)胞，促進(jìn)谷氨酸的分泌，從而達(dá)到大量合成并積累谷氨酸 的目的。該工藝的特點(diǎn)是：（1)具有耐生物素、溫度敏感的特點(diǎn)，要在較高的溫度下才能正常 發(fā)酵產(chǎn)酸(一般為37°C -40°〇。（11)溫度轉(zhuǎn)換是影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵，溫度對(duì)谷氨酸發(fā)酵具有 生產(chǎn)性的影響表明，溫度轉(zhuǎn)換后，必須進(jìn)行適度剩余生長(zhǎng)，完成從谷氨酸非積累型細(xì)胞向積 累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，以保證在富含生物素的培養(yǎng)基中高產(chǎn)谷氨酸。0Π )生產(chǎn)原料易得，不僅可 以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，而且可以利用淀粉質(zhì)原料。 (IV)發(fā)酵工藝趨于簡(jiǎn)單發(fā)酵過(guò)程容易控制、谷氨酸產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸穩(wěn)定以及節(jié)約 能耗，降低成本等。
[0004] 早在20世紀(jì)70年代，日本就有溫度敏感型谷氨酸菌的研究報(bào)道。國(guó)內(nèi)最早的報(bào)道 是1985年上海市工業(yè)微生物所的孫智鳳等對(duì)溫度敏感型變異株Do菌的選育及其作用的報(bào) 道，他們以該菌為出發(fā)菌株，經(jīng)DES和NTG連續(xù)誘變處理，選育得到一株優(yōu)良的溫度敏感型NI 菌，此菌的生物素適應(yīng)范圍更廣（25yg/l - 200yg/l)，同時(shí)要在較高溫度(37°C - 40°C)下才 能正常發(fā)酵產(chǎn)酸。將NI菌用于大米水解糖在6.5m3發(fā)酵罐上生產(chǎn)谷氨酸，平均產(chǎn)酸率達(dá) 5.89%，平均糖酸轉(zhuǎn)化率為47.25%，平均發(fā)酵周期為26.5h。2002年陳寧等報(bào)道稱定向選育 出了具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟鹽抗性的溫度敏感性突變株TMG0106,然后，以該突變株 和產(chǎn)酸率高的天津短桿菌TG961為親株，通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)，成功地選育出了產(chǎn)酸率高 的融合子CN1021，在6m 3發(fā)酵罐上其谷氨酸產(chǎn)量達(dá)14.6 %，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)62.8 %，并且該菌 株系溫度敏感型菌株，可用于谷氨酸強(qiáng)制發(fā)酵。
[0005] 由此可見(jiàn)，對(duì)于溫度敏感型谷氨酸菌株的選育，我國(guó)還處于由傳統(tǒng)的選育技術(shù)(主 要是將野生株谷氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行有目的的定向改造，或采用紫外線等物理誘變因子或亞硝 基胍等化學(xué)誘變因子進(jìn)行常規(guī)的誘變育種）向DNA重組技術(shù)的轉(zhuǎn)變過(guò)程，采用基因工程技術(shù) 進(jìn)行溫敏型谷氨酸菌株的改造還有待進(jìn)一步與深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)谷氨酸的溫敏型重組谷氨酸棒狀桿菌，是通過(guò)改造野 生型谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum ATCC 13032)，敲除其基因組中肽聚糖合成途徑中的兩 個(gè)關(guān)鍵基因 UDP-N-烯醇式乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶基因(murA)和UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶基 因(murB)，獲得溫敏型重組菌，重組菌的谷氨酸產(chǎn)量得到明顯提升。
[0007] 本發(fā)明還提供一種利用重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的方法，具體包括如 下步驟：
[0008] (1)將菌體接種到斜面培養(yǎng)基中活化，32 °C培養(yǎng)24-36h;
[0009] (2)將活化好的菌種接入種子培養(yǎng)基中，32°C，200rpm，培養(yǎng)6-8h;
[0010] (3)將培養(yǎng)好的種子按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，32°C，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)；
[0011] (4)待發(fā)酵培養(yǎng)至菌體0D6Q()= 12-16時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至38 · 5°C，200rpm培養(yǎng)至 總發(fā)酵28-32h。
[0012] 所述斜面培養(yǎng)基的組成：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，牛肉膏l(xiāng)%，NaCl 0.25%， 1%504 0.05%，腿2卩〇4〇.1%，玉米漿2%，瓊脂2%。
[0013]所述種子培養(yǎng)基的組成：葡萄糖30g/L，K2HP〇4 · 3H20 0.2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.8g/ L，MnS〇4 2mg/L，F(xiàn)eS〇4 2mg/L，VB1 0.3mg/L，VH 0.2mg/L，酵母粉 10g/L，蛋白胨
[0014] 5g/L，尿素 0.5g/L，Metlg/L。
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：葡萄糖8g/L，K2HP〇4 · 3H20 0.4g/L，VH 0.35mg/L，VB1
[0016] 0.5mg/L，甜菜堿5g/L，MnS〇4 30mg/L，F(xiàn)eS〇4 30mg/L，MgS〇4 · 7H20 2g/L，酵母粉 15g/L，蛋白胨5g/L。
[0017]本發(fā)明通過(guò)基因重組的方法失活谷氨酸棒桿菌野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032的肽聚糖合成途徑中的兩個(gè)基因 murA和murB，干擾該菌株細(xì)胞壁的正常合成，導(dǎo)致菌 株出現(xiàn)溫度敏感的性狀，有利于增強(qiáng)部分胞內(nèi)代謝產(chǎn)物向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，促進(jìn)如谷氨酸 等代謝物的合成。利用本發(fā)明提供的方法，對(duì)其他谷氨酸棒桿菌進(jìn)行改造，可以使更多菌株 獲得溫度敏感性狀。在實(shí)際應(yīng)用中，提高培養(yǎng)溫度能夠使得溫敏型重組菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā) 生變化，從細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、變大，這些細(xì)胞的細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)，利于胞內(nèi)產(chǎn) 物分泌到培養(yǎng)基中，解除胞內(nèi)的反饋?zhàn)瓒艉鸵种?，從而促進(jìn)目的產(chǎn)物的合成。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖 1:原始菌ATCC 13032和重組菌C.glutamicum ATCC 13032AmurAAmurB的生長(zhǎng) 曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更 為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。下述實(shí)施例中涉及的方法、成分 及用量，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知常規(guī)方法。
[0020] 本發(fā)明的研究基礎(chǔ)，是對(duì)現(xiàn)有的通過(guò)誘變篩選得到的谷氨酸溫度敏感突變株進(jìn)行 全基因組的測(cè)序，通過(guò)比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該菌株缺失了murA和murB這兩個(gè)基因，并且 通過(guò)敲除-回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩個(gè)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了這兩個(gè)基因的存在與否決定了 菌株是否具有溫度敏感特性；
[0021] 對(duì)現(xiàn)有的通過(guò)誘變篩選得到的谷氨酸溫度敏感突變株C.glutamicum CN 1021進(jìn) 行全基因組測(cè)序，通過(guò)比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株缺失了 murA和murB兩個(gè)肽聚糖合成 途徑上的關(guān)鍵基因。
[0022] 通過(guò)PCR的方法，從谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 13032中克隆得到murA和 murB兩個(gè)基因。通過(guò)酶切連接的方法將兩個(gè)基因片段連接至過(guò)表達(dá)載體pXMJ19上，構(gòu)建過(guò) 表達(dá)質(zhì)粒。然后通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化的方法，將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到目的宿主即 C·