專利名稱：具有增強的l-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬微生物以及使用所述微生物生產(chǎn)l-賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬微生物以 及使用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及具有 通過使具有含有重復(fù)賴氨酸殘基的氨基酸序列的內(nèi)源NCgl2534基因失 活的增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬重組微生物，以及使用所述微生 物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸是必需氨基酸，其已經(jīng)被廣泛用于動物飼料添加劑、食品 添加劑、作為藥物的原料等，并且通過棒狀桿菌屬微生物發(fā)酵來生產(chǎn)。
棒狀桿菌屬微生物特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)是被廣泛用于L-氨基酸生產(chǎn)的革蘭氏陽性微生物。使用棒 狀桿菌屬微生物生產(chǎn)L-氨基酸的方法非常重要。因此，已經(jīng)進行了許多 嘗試來改進所述方法。
一種嘗試是通過使用DNA重組技術(shù)斷裂特定基因或者衰減表達(dá)的 特定基因改進產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀桿菌屬微生物。例如，美國專利 US6,872，553公開了一種通過棒狀桿菌屬微生物發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸的方 法，所述方法包括下列步驟a)通過一種突變方法使具有衰減的編碼磷 酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶(PCK)的DNA的棒狀桿菌屬微生物生 長，所述突變方法選自下組該組由在DNA中插入一個或多個堿基對、 在DNA中缺失一個或多個堿基對和通過在DNA中引入無義密碼子的堿基對轉(zhuǎn)換或顛換所組成，或者生長與沒有被衰減的棒狀桿菌屬微生物相
比具有減少的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶(PCK) ; b)在培養(yǎng)基 或細(xì)胞中濃縮所需的L-氨基酸產(chǎn)物；和C)分離L-氨基酸。
另外，已經(jīng)進行了關(guān)于在L-氨基酸生物合成中涉及的各個基因如何 通過擴增基因影響L-氨基酸的產(chǎn)率以發(fā)展棒狀桿菌屬微生物的許多研究 (Eggeling， Amino Acids 6, 261-272 (1994))。而且，可通過從其他細(xì)菌 中引入外源基因來發(fā)展棒狀桿菌屬微生物。例如，日本早期公開專利平 7-121228公開了通過培養(yǎng)棒狀桿菌短桿菌(Corynebacterium genusor Brevibacterium)屬微生物生產(chǎn)L-谷氨酸和L-脯氨酸的方法，所述微生物 在具有涉及檸檬酸合成酶合成的遺傳信息的DNA片段和DNA載體之間 含有重組構(gòu)建體，并通過培養(yǎng)產(chǎn)生L-谷氨酸和L-脯氨酸。
但是，盡管進行了上述試驗，仍然需要生產(chǎn)具有增強的L-賴氨酸產(chǎn) 率的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的發(fā)明人進行了研究以在棒狀桿菌屬微生物中發(fā)展能夠高產(chǎn) 量生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株，所述菌株具有在氨基酸順序中具有重復(fù)的賴氨 酸殘基的目標(biāo)內(nèi)源NCgl2534基因。并且本發(fā)明的發(fā)明人通過使上述目標(biāo) 基因失活嘗試以降低的不必要的賴氨酸的細(xì)胞內(nèi)消耗來增加L-賴氨酸的 產(chǎn)率。
本發(fā)明的目的在于提供具有增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬微 生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供使用上述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。 技術(shù)方案
本發(fā)明的上述目的和其他目的可通過本發(fā)明的下列實施例來實現(xiàn)。 下面詳細(xì)描述本發(fā)明。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了具有L-賴氨酸產(chǎn)率的微生物，更
優(yōu)選通過使其中的NCgl2534基因失活而具有增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒 狀桿菌屬微生物。
在本發(fā)明中，具有L-賴氨酸產(chǎn)率的微生物可選自下組，該組由谷氨 酸棒狀桿菌ATCC 13032,嗜熱棒狀桿菌FERMBP- 1539，谷氨酸棒狀桿 菌KFCC 10881和谷氨酸棒狀桿菌KFCC 11001所組成，但不完全限于 這些。
賴氨酸起細(xì)胞成分或者蛋白質(zhì)合成或調(diào)節(jié)子單元的作用。作為細(xì)胞 組分單元，賴氨酸被用于核酸、氨基酸或脂肪合成。作為蛋白質(zhì)合成單 元，賴氨酸被用作蛋白結(jié)構(gòu)或者作為主要功能基團。特別是，對于蛋白 質(zhì)合成單元來說，被翻譯成蛋白質(zhì)的基因被分成兩組 一組是細(xì)胞生長、 維持和調(diào)節(jié)所必需的基因，另一組是對于上述過程來說非必需的基因。 非必需基因被分成如下類型由于其他基因具有等同功能所述基因不再 需要；從外部被引入的外源基因諸如病毒基因；特定情況下必需但不是 對于所有條件下諸如賴氨酸生產(chǎn)必需的基因；和其功能還沒有得到解釋 的基因。
細(xì)胞大量消耗賴氨酸以構(gòu)成非必需基因的蛋白質(zhì)。因此，如果非必 需基因被剔除，認(rèn)為用于非必需基因的大量賴氨酸消耗被減少，有助于 非必需賴氨酸消耗的減少，并且還有利于在相同條件下賴氨酸的產(chǎn)生。
為了開發(fā)具有提高的L-賴氨酸產(chǎn)率的微生物，本發(fā)明的發(fā)明人從谷 氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的完全分析的序列基因組序列數(shù)據(jù)庫(NCBI GI:19553822)中尋找了比任何其他基因多的在其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序 列中含有賴氨酸殘基、賴氨酸生物合成的中間體的基因。結(jié)果，確定了 重復(fù)的天冬氨酸殘基在具有由SEQ. ID. NO: 3表示的氨基酸序列的 NCgl2534蛋白的C-末端中存在。但是，在賴氨酸產(chǎn)生菌中氨基酸序列 上這些重復(fù)天冬氨酸殘基如何在賴氨酸生物合成中被涉及還沒有得到解釋。
在本發(fā)明中，NCgl2534基因是在棒狀桿菌屬微生物中內(nèi)源存在的基 因，并已知其為編碼其功能未知的假定蛋白的基因?；虻幕钚酝ㄟ^谷 氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的基因組的全序列分析來預(yù)測，并確認(rèn)在其 C-末端具有重復(fù)賴氨酸殘基并優(yōu)選具有由SEQ. ID. NO: 1表示的核苷酸 序列。本發(fā)明的棒狀桿菌屬微生物的內(nèi)源NCgl2534基因優(yōu)選與由SEQ. ID. NO: 1表示的序列具有高度同源性。
在本發(fā)明中，"失活"可通過本領(lǐng)域已知的任何失活方法來誘導(dǎo)。 這里術(shù)語"失活"指的是與野生型菌株相比NCgl2534基因的表達(dá)被降低 到很低的水平，或者產(chǎn)生不表達(dá)的基因以及盡管被表達(dá)但表達(dá)不具有活 性或降低的活性的產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，"失活"可通過選自下組的一種或多種突變方法來誘 導(dǎo)，該組由在NCgl2534基因中插入一個或多個堿基對，在該基因中缺失 一個或多個堿基對，通過在該基因中插入無義密碼子的堿基對轉(zhuǎn)換或顛 換所組成。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，含有失活的內(nèi)源NCgl2534基因的微 生物可通過在抗生素存在下培養(yǎng)使用含有一部分NCgl2534和抗生素標(biāo) 記物的載體轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌屬微生物得到。優(yōu)選地，載體為含有SEQ. ID. NO: 2的NCgl2534基因片段的pCR-2534載體。微生物使用含有一部分 基因序列的載體轉(zhuǎn)化，接著在選擇性標(biāo)記物的存在下培養(yǎng)。然后，在基 因的一部分與微生物的內(nèi)源基因之間發(fā)生同源重組。通過同源重組，微 生物的內(nèi)源基因被重組并且含有標(biāo)記物的重組基因僅僅由選擇標(biāo)記物來 選擇。結(jié)果，其內(nèi)源NCgl2534基因失活的棒狀桿菌屬微生物可被獲得。 但是，產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的棒狀桿菌屬微生物的方法不限于同源重組，本 領(lǐng)域已知的任何方法均可使用。
本發(fā)明的具有提高的L-賴氨酸產(chǎn)率的轉(zhuǎn)化微生物可以是谷氨酸棒
6狀桿菌KFCC 10881 -CO01-0019 (保藏號KCCM 10811P)。
本發(fā)明還提供了使用轉(zhuǎn)化微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。更具體地 說，本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述方法包括下列步驟在培 養(yǎng)物或細(xì)胞中通過棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)來產(chǎn)生L-賴氨酸；并從培養(yǎng) 物中收集L-賴氨酸。
在本發(fā)明的方法中，棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)可通過本領(lǐng)域已知的 任何培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件來進行。
用于棒狀桿菌屬微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基可選自由American Society for Bacteriology在Manual of Methods for General Bacteriology (Washington D.C.,USA, 1981)中描述的那些中選擇。
所述培養(yǎng)基包括各種碳源、氮源和微量元素。碳源以糖或者碳水化 合物為例，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素； 油和脂，諸如豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、 硬脂酸和亞油酸；醇類諸如甘油和乙醇；和有機酸，諸如醋酸。這些化 合物的一種或其混合物可被用作碳源。
氮源以有機氮源和無機氮源為例，所述有機氮源包括諸如蛋白胨、 酵母膏、肉湯、麥芽膏提取物、谷物浸泡液(CSL)和豆類面粉，所述 無機氮源包括諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。 這些化合物的一種或其混合物可被用作氮源。
這里培養(yǎng)基可另外包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和相應(yīng)的含鈉的鹽 作為磷酸源。培養(yǎng)基還可包括金屬鹽諸如硫酸鎂或者硫酸鐵。另外，氨 基酸、微生物和適當(dāng)?shù)那绑w也可被加入。培養(yǎng)基或前體可通過分批型或 者連續(xù)型加入到培養(yǎng)物中。
在培養(yǎng)期間培養(yǎng)物的PH可使用堿性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化 鉀或者氨水來控制，或者使用酸性化合物諸如磷酸或硫酸來控制。在培 養(yǎng)期間氣泡的產(chǎn)生可通過使用消泡劑諸如脂肪酸聚甘油酯來抑制。為了保持培養(yǎng)物的有氧條件，氧氣或者含氧氣體(比如，空氣)可被注入到
培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物的溫度優(yōu)選20-45'C，更優(yōu)選25-40'C.培養(yǎng)可繼續(xù)直到 L-氨基酸的產(chǎn)生達(dá)到所需水平，優(yōu)選的培養(yǎng)時間為10-160小時。
在該方法中，培養(yǎng)以連續(xù)或分批型方法進行，諸如分批、分批供給 和重復(fù)分批供給培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解其培養(yǎng)方法可適當(dāng)選 擇。
L-氨基酸可通過陰離子交換色譜然后進行茚三酮衍生化分離并分析。
除了基因鑒定之外，本發(fā)明的發(fā)明人進一步失活了棒狀桿菌屬微生 物的內(nèi)源基因NCgl2534基因以測定賴氨酸活性。結(jié)果，可以確定賴氨酸 產(chǎn)率得到提高。


參照附圖更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的應(yīng)用，其中 圖l是顯示296 bp的NCgl2534基因被克隆到pCR-2534載體中的 示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的實踐和當(dāng)前的優(yōu)選實施方式如下列實施例中所述來說明。
但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明公開的考慮下，在本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)可進行修改和改進。
在下列實施例中，為了確定在其氨基酸序列中具有重復(fù)賴氨酸殘基 的NCgl2534基因?qū)嚢彼岙a(chǎn)生的影響，谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881的 內(nèi)源基因NCgl2534被失活。并且含有失活的NCgl2534基因的微生物被 培養(yǎng)并且賴氨酸產(chǎn)率被測定。
實施例l:用于失活棒狀桿菌屬微生物的內(nèi)源基因NCgl2534的載 體的構(gòu)建
在該實施例中，296 bp的NCgl2534基因片段(SEQ. ID. NO: 2)(由表示SEQ. ID. NO: 1的第21 -317核苷酸序列)使用谷氨酸棒狀桿菌(ATCC 13032)的染色體DNA作為模板以SEQ. ID. NO: 4和NO: 5表示的寡核苷 酸引物通過PCR進行擴增，以構(gòu)建含有一部分內(nèi)源NCgl2534基因和和 抗生素標(biāo)記物的NCgl2534斷裂載體。PCR按如下方式進行96。C變性 30秒，52t:下退火30秒以及72r下聚合30秒(30個循環(huán))。通過使用 TOPO克隆試劑盒(Invitrogen, USA)將擴增的NCgl2534基因片段被克隆 到大腸桿菌質(zhì)粒pCR.2.1中。結(jié)果，pCR-2534載體被構(gòu)建。圖1是顯 示296 bp的NCgl2534基因被克隆到pCR-2534載體中的示意圖。
實施例2:具有活性谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881內(nèi)源基因 NCgl2534基因的產(chǎn)L-賴氨酸微生物的構(gòu)建
使用在實施例1中構(gòu)建的pCR-2534載體通過根據(jù)在Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545中描述的方法的電脈沖方法轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-賴氨 酸微生物谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881。在培養(yǎng)第2天進行PCR以確認(rèn) 在轉(zhuǎn)化微生物中NCgl2534的斷裂。特別是，使用轉(zhuǎn)化微生物的DNA作 為模板以由SEQ. ID. NO: 6和NO: 7表示的寡核苷酸引物進行PCR。結(jié) 果，大約5020 bp (由SEQ. ID. NO: 1表示的第1- 330核苷酸)的含有 pCR-2534質(zhì)粒的NCgl2534基因片段被擴增。通過PCR，可以確定 NCgl2534基因通過同源重組通過交叉(cross-over)將pCR-2534質(zhì)粒插 入到染色體DNA上的內(nèi)源NCgl2534基因的中間而斷裂。
得到的微生物被命名為"谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881-CO01 -0019"，其于2006年12月7日被保藏在位于361-221, Hongje-l-Dong, Seodaemungu- Gu, Seoul, Korea的國際保藏單位KFCC (Korean Federation of Culture Collection)的 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms),(保藏號KCCM 1081 IP)。
實施例3:使用谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881-CO01-0019生產(chǎn)L-賴氨
酸
9培養(yǎng)在實施例2中制備的轉(zhuǎn)化體谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881 -CO01-0019 (KCCM 10811P)以生產(chǎn)L-賴氨酸。
首先，將谷氨酸棒狀桿菌母菌KFCC 10881和轉(zhuǎn)化體KFCC 10881 -CO01-0019 (KCCM 10811P)接種在含有25ml具有下面列出的成分的種 子培養(yǎng)基的250ml帶有角擋板的燒瓶(corner-baffled flask)中，然后在 200 rpm攪拌下3(TC下培養(yǎng)20小時。將lmL種子培養(yǎng)基接種在含有24ml 具有下面列出的成分的生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml帶有角擋板的燒瓶中，接著 在200 rpm攪拌下30。C下培養(yǎng)120小時。當(dāng)培養(yǎng)完成時，通過HPLC (Waters 2457)測定L-賴氨酸的產(chǎn)量。
結(jié)果，谷氨酸棒狀桿菌母菌KFCC 10881和谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881 -CO01-0019 (KCCM 10811P)在它們的培養(yǎng)基中分別產(chǎn)生45 g/1和 52 g/1以L賴氨酸的鹽酸鹽的形式的L-賴氨酸。
種子培養(yǎng)基(PH7.0):
粗糖20g,蛋白胨10g，酵母膏5g,尿素1.5g, KH2P04 4g, K2HP04 8g， MgS047H20 0.5g,生物素IOO嗎,硫胺HCL 1000嗎，鈣-泛酸2000嗎，煙堿 2000嗎(溶于1升生產(chǎn)用水中)。
生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH 7.0):
粗糖100 g, (NH )4S02 40 g,大豆蛋白2.5g,谷物浸出固體5 g,尿素3 g, KH2P04 lg, MgS047H20 0.5g,生物素100 ^g，硫胺HCL 1000嗎，鈣-泛酸2000嗎，煙堿3000嗎，CaC03 30g (溶于1升生產(chǎn)用水中)
實施例4:從谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881-CO01-0019培養(yǎng)物中收集 L-賴氨酸
在含有糖蜜和粗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881 -CO01-0019。使用HCL將lL得到的賴氨酸培養(yǎng)物的pH調(diào)節(jié)到2.0，然 后Ca離子被轉(zhuǎn)化成CaS04或者CaCl2形式。將培養(yǎng)物向上充滿在由銨離 子再生的陽離子交換樹脂(Diaion SK-L10)上，然后吸附。樹脂層中保留的細(xì)胞通過脫鹽水洗滌除去，接著使用2N氫氧化銨洗脫。結(jié)果，賴氨
酸被高濃度收集。收集的含賴氨酸溶液被濃縮，并使用HCL將溶液的pH 調(diào)節(jié)到5.0，接著在2(TC下冷卻結(jié)晶。結(jié)晶后，將得到的結(jié)晶漿液離心以 給出初級濕產(chǎn)品。母液通過分批濃縮，然后結(jié)晶以得到次級濕產(chǎn)品。將 初級和次級濕產(chǎn)品混合并干燥以得到47.5g干賴氨酸產(chǎn)品(賴氨酸含量； 98.5%)。
工業(yè)實用性
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，L-賴氨酸產(chǎn)率可通過使谷氨酸棒狀桿菌 KFCC 10881 -CO01-0019 (KCCM 10811P)的內(nèi)源基因NCgl2534基因失
活而增加。本發(fā)明的方法有利于高濃度生產(chǎn)L-賴氨酸，導(dǎo)致L賴氨酸產(chǎn) 率增加。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，在前述說明書中公開的構(gòu)思和特定實施 方式可以很用以被用作修改或設(shè)計的基礎(chǔ)以便實現(xiàn)本發(fā)明的相同目的的 實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會理解，這些等同實施方式不偏離在所附 的權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1、一種通過使在其氨基酸序列中具有重復(fù)賴氨酸殘基的基因失活而具有提高的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬微生物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，基因為具有 由SEQ. ID.NO: 1表示的核苷酸序列的內(nèi)源NCgl2534基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，失活可通過 選自下組的一種或多種突變方法來誘導(dǎo)，該組由在NCgl2534基因中插入 一個或多個堿基對，在該基因中缺失一個或多個堿基對，通過在該基因 中插入無義密碼子的堿基對轉(zhuǎn)換或顛換所組成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，失活通過使 用含有一部分內(nèi)源NCgl2534基因與抗生素標(biāo)記物的載體轉(zhuǎn)化棒狀桿菌 屬微生物來誘導(dǎo)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，所述微生物 是通過在抗生素存在下培養(yǎng)選擇的谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881 -CO01-0019 (KCCM 10811P)。
6、 一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述方法包括下列步驟在培養(yǎng)物 或細(xì)胞中通過培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中所述的任何一種微生物來產(chǎn)生L-賴氨 酸；和從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌(Corynebacterium)屬微生物以及使用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及具有通過使具有含有重復(fù)賴氨酸殘基的氨基酸序列的內(nèi)源NCg12534基因失活的增強的L-賴氨酸產(chǎn)率的棒狀桿菌屬重組微生物，以及使用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
文檔編號C12N1/15GK101600796SQ200780048626
公開日2009年12月9日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者具賢敏, 崔宗秀, 張在佑, 文準(zhǔn)玉, 樸英薰, 李善憐, 林相曹, 梁榮烈, 金孝珍 申請人:Cj第一制糖株式會社