本發(fā)明涉及一種來源于Aquifex aeolicus菌株的嗜熱酯酶及其功能驗證，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

極端微生物是適合生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、嗜鹽、嗜金屬離子、抗輻射、耐干燥和極端厭氧等多種類型。嗜熱菌(高溫菌，也稱嗜熱微生物)，是一類生活在50℃以上高溫環(huán)境中的微生物。常見的嗜熱微生物的來源有溫泉、火山口、海洋沉積物、廢水廢物、地?zé)嵝酝寥赖取＝?0年來，在水的沸點和沸點以上溫度條件下能生活的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)后，更促進(jìn)了對嗜熱微生物的研究。在發(fā)酵工業(yè)中，可以利用嗜熱菌耐高溫的特性，提高反應(yīng)溫度，增大反應(yīng)速度，減少中溫型雜菌污染的機(jī)會。最適反應(yīng)溫度低于80℃的稱為嗜熱酶，最適反應(yīng)溫度高于80℃的稱為超嗜熱酶，人類發(fā)現(xiàn)的第一個嗜熱酶是應(yīng)用于現(xiàn)代生物技術(shù)的聚合酶—Taq酶。此后，許多嗜熱酶已不斷被從嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)且用于生產(chǎn)，例如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、菊糖酶等。

脂類水解酶(EC 3.1.1.X)主要包括脂肪酶和酯酶。脂肪酶和酯酶的區(qū)別主要有3點：一是作用的底物不同：酯酶是催化含短鏈脂肪酸的酯類水解酶，脂肪酶是催化含長鏈脂肪酸的脂肪(三酰基甘油)水解為甘油和脂肪酸的酶；二是作用底物的物理狀態(tài)不同：酯酶水解水溶性底物，反應(yīng)體系主要處于油水界面。脂肪酶只能在異相系統(tǒng)(即油水界面)或有機(jī)相中作用，水解脂溶性底物；三是界面的激活效應(yīng)：脂肪酶在水-油界面催化活性較高，在單一溶液中催化活性低。所有的脂類水解酶一級結(jié)構(gòu)都相似，包括1)重要區(qū)域His-Gly-X-Ser-Gly和Gly-X-Ser-X-Gly；2)活性部位的Ser被α-螺旋掩蓋，當(dāng)脂肪酶與界面接觸時，α-螺旋打開。3)普遍認(rèn)為其活性位點由3個催化殘基組成：親核殘基(Ser、Cyc、Asp)、催化殘基(Asp、Glu)、His殘基。

近幾年，關(guān)于耐熱酯酶/脂肪酶的研究愈來愈多，許多嗜熱菌株酯酶/脂肪酶已被研究。嗜熱酯酶/脂肪酶微生物來源主要有原核生物、真核生物和古生菌。根據(jù)脂類水解酶氨基酸序列和基礎(chǔ)生化性質(zhì)的不同，Arpigny和Jaeger等人將細(xì)菌脂類水解酶分為8個家族，其中嗜熱酶多屬于第4家族(HSL家族)和第5家族(嗜熱酶家族)。目前，國內(nèi)外已研究的關(guān)于嗜熱酯酶/脂肪酶來源的嗜熱菌株主要有：Fervidobacterium屬，Thermotoga屬，Aureobasidium屬，Pseudomonas屬，Geobacillus屬，Sulfolobus屬等。酯酶作為一種高效的生物催化劑，由于嗜熱酯酶具有高溫反應(yīng)活性和良好的熱穩(wěn)定性，以及對有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，使其極廣泛的應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥工業(yè)、皮革制造、動物飼料、化妝品行業(yè)和污水治理等行業(yè)。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家們逐漸從一些特殊高熱環(huán)境中分離得到超嗜熱微生物，也從而使人們對嗜熱酶的認(rèn)識進(jìn)一步深入。然而，大多數(shù)嗜熱菌生長速度較慢，培養(yǎng)條件嚴(yán)格，因此通過培養(yǎng)野生菌來獲得大量嗜熱酶極其困難。然而，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們開始把在嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)的目的基因在一些常見的易培養(yǎng)宿主中表達(dá)，從而在溫和條件下獲得大量的嗜熱酶。目前，已有一些嗜熱酯酶基因?qū)崿F(xiàn)在大腸桿菌中的成功表達(dá)。但在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中，考慮到酶制劑下游分離處理和安全問題，異源表達(dá)宿主的選擇尤為重要。畢赤酵母和巨大芽孢桿菌都是食品級表達(dá)宿主，且可以胞外分泌重組蛋白。

目前對嗜熱酶的研究還處于初級階段，從超嗜熱微生物中發(fā)現(xiàn)新型嗜熱酶是目前新型酶制劑的主要方法。此外，面對嗜熱酯酶的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)新型嗜熱酯酶并選擇合適的表達(dá)宿主尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的來源于Aquifex aeolicus的嗜熱酯酶。本發(fā)明通過實現(xiàn)了新發(fā)現(xiàn)的酯酶基因的異源表達(dá)，并驗證了基因功能。

本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是定義一種具有嗜熱酯酶活性的新型基因，所述嗜熱酯酶基因的氨基酸序列如1)或2)所示：

1)是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

2)在1)限定的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)氨基酸的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的酯酶的氨基酸序列。

所述嗜熱酯酶基因來源于Aquifex aeolicus(風(fēng)產(chǎn)液菌)菌株。Aquifex aeolicus是一種超嗜熱真細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)于美國國家黃石公園的溫泉中，以H₂/CO₂/O₂及其他無機(jī)物質(zhì)為生長介質(zhì)，最高生長溫度在95℃，屬目前已知的幾種最耐熱細(xì)菌之一。

本發(fā)明要解決的第二個問題是提供一種表達(dá)嗜熱酯酶的基因工程菌或者轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)氨基酸序列如1)或2)所示的基因：

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列；或

2)氨基酸序列是在1)限定的序列基礎(chǔ)上經(jīng)氨基酸的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的酯酶的序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如3)或4)所示：

3)其核苷酸序列是SEQ ID NO.4或者SEQ ID NO:6所示的序列；

4)在3)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的酯酶的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌可以是以畢赤酵母、大腸桿菌或者巨大芽孢桿菌為宿主構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述畢赤酵母可選擇GS115、KM71或SMD1168等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌為畢赤酵母工程菌，先構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)載體，以畢赤酵母為宿主進(jìn)行表達(dá)；所述重組畢赤酵母表達(dá)載體可以是在pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、PAO815或pPICZα等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌是以pPIC9K為載體構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)載體，以畢赤酵母GS115為宿主構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述畢赤酵母工程菌表達(dá)核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌可選擇BL21、Rosctta 2、Origami 2、Rosctta-gami 2或Origami B等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌為大腸桿菌工程菌；先構(gòu)建重組大腸桿菌表達(dá)載體，以大腸桿菌為宿主進(jìn)行表達(dá)；所述重組大腸桿菌表達(dá)載體可以是在pET28T、MBP3、pBR系列、pUC系列或pAT153載體等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌是以MBP3為載體構(gòu)建重組大腸桿菌表達(dá)載體，以BL21或者Origami 2為宿主構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌工程菌表達(dá)的核苷酸序列在SEQ ID NO:6基礎(chǔ)上稍作改造，不含有組氨酸標(biāo)簽(即去除了SEQ ID NO:6上的第678位至第705位的堿基)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述巨大芽孢桿菌可選WH320、MS941、YYBm1等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌為巨大芽孢桿菌工程菌；先構(gòu)建重組巨大芽孢桿菌表達(dá)載體，以巨大芽孢桿菌為宿主進(jìn)行表達(dá)；所述重組巨大芽孢桿菌表達(dá)載體可以是在pHIS1525、pHIS1522、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pSTOP 1622等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌是以pHIS1525為載體構(gòu)建重組巨大芽孢桿菌表達(dá)載體，以巨大芽孢桿菌YYBm1為宿主構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述巨大芽孢桿菌工程菌表達(dá)核苷酸序列為SEQ ID NO:6。本發(fā)明要解決的第三個問題是提供一種表達(dá)嗜熱酯酶的重組載體，所述重組載體含有氨基酸序列如1)或2)所示的基因：

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列；或

2)氨基酸序列是在1)限定的序列基礎(chǔ)上經(jīng)氨基酸的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的酯酶的序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體是以在pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、PAO815或pPICZα等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體是以在pET 28T、MBP3、pBR系列、pUC系列或pAT153載體等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體是以在pHIS1525、pHIS1522、pSTREP1525、pSTREPHIS1525或者pSTOP 1622等的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。

本發(fā)明要解決的第四個問題是提供一種生產(chǎn)嗜熱酯酶的方法，其特征在于，所述方法是利用本發(fā)明的表達(dá)嗜熱酯酶的重組載體、表達(dá)嗜熱酯酶的基因工程菌或者表達(dá)嗜熱酯酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法，是將SEQ ID NO.6的序列連接到pPIC9K得到重組表達(dá)載體pPIC9K-Aaeo2，然后將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子即為重組畢赤酵母工程菌；將得到的陽性重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-Aaeo2在30℃、200rpm條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀＝2.0-6.0，隨后離心將菌體轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中，28℃、200rpm條件下培養(yǎng)并加入終濃度為1.0％的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)30-120h。

本發(fā)明要解決的第五個問題是提供所述表達(dá)嗜熱酯酶的重組載體、表達(dá)嗜熱酯酶的基因工程菌或者表達(dá)嗜熱酯酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是應(yīng)用于食品加工、生物催化、制備藥物、皮革制造、動物飼料、化妝品、污水治理等領(lǐng)域。

本發(fā)明要解決的第六個問題是提供一種水解対硝基苯酚類或者甘油脂類底物的方法，所述方法是表達(dá)氨基酸序列如1)或2)所示的基因，以基因表達(dá)產(chǎn)物為催化劑進(jìn)行水解；其中基因：

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列；或

2)氨基酸序列是在1)限定的序列基礎(chǔ)上經(jīng)氨基酸的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的酯酶的序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述対硝基苯酚類底物為p-NPC₄、p-NPC₅、p-NPC₈、p-NPC₁₂、p-NPC₁₄或者p-NPC₁₆。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甘油脂類底物為三乙酸甘油脂、三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三葵酸甘油酯、三酸肉豆蔻甘油酯、三棕櫚酸甘油酯或者橄欖油。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的嗜熱酯酶，并重組表達(dá)了該嗜熱酯酶。本發(fā)明對純化得到的嗜熱酯酶進(jìn)行了一系列酶學(xué)性質(zhì)研究分析，包括最適作用底物、最適作用pH及pH穩(wěn)定性、最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑對重組酶穩(wěn)定性影響、金屬離子對重組酶穩(wěn)定性影響、表面活性劑對重組酶穩(wěn)定性影響、抑制劑對重組酶穩(wěn)定性影響。結(jié)果表明重組酶Aaeo2最適底物為p-NPC₄，最適作用溫度和pH為90℃和8.0，且具有很好的熱穩(wěn)定性，對金屬離子和有機(jī)溶劑等具有一定的耐受性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1的A.aeolicus嗜熱酯酶Aaeo2的進(jìn)化樹構(gòu)建圖；

圖2是本發(fā)明實施例2的A.aeolicus嗜熱酯酶Aaeo2信號肽預(yù)測結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實施例2利用“同源建?！狈A(yù)測及其軟件分析的A.aeolicus嗜熱酯酶Aaeo2功能結(jié)構(gòu)圖示；

圖4是本發(fā)明實施例3的pPIC9K-Aaeo2雙酶切鑒定圖；

圖5是本發(fā)明實施例3的pPIC9K-Aaeo2重組酶SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；M為蛋白Marker；泳道1為發(fā)酵上清液中重組酶蛋白Aaeo2，泳道2為純化重組酶蛋白Aaeo2；

圖6為純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶Aaeo2底物特異性分析；

圖7為純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶Aaeo2最適作用溫度(圖7A)和溫度穩(wěn)定性(圖7B)分析；

圖8為純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶Aaeo2的Tm值分析；

圖9為純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶Aaeo2最適作用pH(圖9A)和pH穩(wěn)定性(圖9B)分析。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

實施例1：A.aeolicus重組嗜熱酯酶基因的獲得和基因序列分析

根據(jù)酯酶一級結(jié)構(gòu)中保守序列“Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly”和關(guān)鍵酶活性位點“Ser,His,Asp”的特征，從A.aeolicus菌株的基因組選擇兩種假定蛋白序列，在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中對其進(jìn)行Blast分析，得到Aaeo1序列與來源于Nitrosomonas europaea的一種methyl ester esterase(Reference sequence:Q82SL8.2)有27％的相似性。Aaeo2序列與來源于Bos taurus的一種mycophenolic acid acyl-glucuronide esterase(Reference sequence:Q5E9H9.1)有25％的相似性。因此，可以初步猜測這兩種序列可編碼酯酶蛋白。

選擇5種已研究的嗜熱酯酶/脂肪酶，與A.aeolicus兩種嗜熱酯酶進(jìn)行序列比對分析，5種已知酯酶/脂肪酶分別為Sulfolobus solfataricus來源的esterase(GenBank NO.:CCQ48704)、S.acidocaldarius來源的lipolytic enzyme(GenBank NO.:AAC67392)、Archaeoglobusfulgidus來源的carboxylesterase(GenBank NO.:WP_010879825)、F.changbaicum來源的lipase(GenBank NO.:EF138832)和Thermotoga maritima來源的lipase(GenBank NO.:AAD36421)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A.aeolicus兩種假定蛋白具有典型的酯酶保守區(qū)域和關(guān)鍵酶活性位點，除此之外，還有其他相同區(qū)域的存在。Aaeo1的關(guān)鍵酶活性位點為Ser62、Asp163、His190，序列Gly60-Gly64為保守區(qū)域。Aaeo2的關(guān)鍵酶活性位點為Ser82、Asp185、His212，序列Gly80-Gly84為保守區(qū)域。

基于Arpigny和Jaeger等人對細(xì)菌來源酯酶/脂肪酶的分類，將其分為8個家族；使用MEGA5.0，采用neighbor-joining法，設(shè)定bootstrap為1000，構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖1)。由圖1可以看出，Aaeo2序列編碼的重組酶歸為Family VIII家族。

其中，Aaeo1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

Aaeo2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

實施例2利用“同源模建”法獲得A.aeolicus兩種嗜熱酯酶三維預(yù)測結(jié)構(gòu)

來源于A.aeolicus的一種嗜熱酯酶基因Aaeo1長度為621bp，編碼207個氨基酸，分子量大小為23.4kDa，該蛋白的核酸序列和蛋白序列見SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:1。另一種嗜熱酯酶基因Aaeo2長度為678bp，編碼226個氨基酸，分子量大小為26.8kDa，該蛋白的核酸序列和蛋白序列見SEQ ID:4和SEQ ID NO:2。

根據(jù)SignalP預(yù)測，假定蛋白Aaeo2的N端均沒有信號肽存在的可能性(見圖2)。

將A.aeolicus兩種嗜熱酯酶的氨基酸序列分別提交I-TASSER蛋白質(zhì)在線模建服務(wù)器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)進(jìn)行同源建模，隨后利用Pymol軟件對A.aeolicus兩種嗜熱酯酶同源建模結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(見圖3)。由圖3可以看出酶活性位點(紅色標(biāo)記)、負(fù)氧離子洞(藍(lán)色標(biāo)記)和cap結(jié)構(gòu)(白色標(biāo)記)。Aaeo2蛋白同源建模的模板為2wtmA，2wtmA是來源于瘤胃細(xì)菌Butyrivibrio Proteoclasticus的麥麩酯酶。Aaeo2的model(圖3)和模板之間的序列同源相似性為25％，催化三聯(lián)體為Ser82、Asp185、His212，構(gòu)成負(fù)氧離子洞的兩個殘基Leu19和His83。

實施例3A.aeolicus兩種嗜熱酯酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建，重組表達(dá)及其蛋白表達(dá)

一、真核表達(dá)載體的構(gòu)建

A.aeolicus兩種嗜熱酯酶基因根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，在DNA編碼框的C末端引入6xHis標(biāo)簽，并在5’和3’兩側(cè)分別引入AvrII和NotI限制性酶切位點，由生物公司合成優(yōu)化后的序列，即SEQ ID NO:5(Aaeo1)和SEQ ID NO:6(Aaeo2)，并連接在表達(dá)載體pPIC9K上，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-Aaeo1和pPIC9K-Aaeo2。

用AvrII和NotI雙酶切重組表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K-Aaeo2，37℃酶切30min。雙酶切進(jìn)行簡單鑒定，1％瓊脂糖核酸凝膠如圖4所示，陽性pPIC9K-Aaeo2質(zhì)粒雙酶切圖(AvrII和NotI)，M為15000bp Marker。

二、重組載體pPIC9K-Aaeo1和pPIC9K-Aaeo2在畢赤酵母GS115中的表達(dá)。

1)電轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)操作手冊，將測序正確的重組質(zhì)粒pPIC9K-Aaeo2用限制性內(nèi)切酶SacI線性化后，電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板(含G418)上篩選目標(biāo)基因整合到受體菌染色體上的轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子，提取總DNA，以其為模板，以5’AOX和3’AOX為引物進(jìn)行PCR鑒定，以空載體轉(zhuǎn)化菌作對照，驗證目的基因已經(jīng)整合進(jìn)酵母基因組中。

2)重組pPIC9K-Aaeo2載體在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

重組畢赤酵母在25mL BMGY培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中30℃培養(yǎng)至OD為2.0～6.0，離心收集菌體，加入到100mL BMMY培養(yǎng)基后于28℃，200rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每12-24h補(bǔ)加1.0％(v/v)甲醇，定時取樣，測定菌體密度和蛋白濃度，同時進(jìn)行培養(yǎng)液的SDS-PAGE和酶活測定。蛋白濃度采用Bradford法。

3)重組酶的純化及其SDS-PAGE凝膠電泳分析(見圖5)

蛋白質(zhì)純化參考GE Healthcare指南，SDS-PAGE分析按照《分子克隆實驗指南》(第三版)，使用的凝膠分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％，上樣量為5-25μL。蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。在圖5可以看出，land2條帶顯示得到的單一純化蛋白Aaeo2，分子量為25kDa左右。

4)嗜熱酯酶酶活檢測

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)：使用p-NPC4作為底物，pH8.0Tris-HCl緩沖液，在70℃條件下測定酶活性。酶活定義為一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol対硝基苯酚的酶量為一個酶活國際單位。

酶活性測定顯示具有酯酶活性。

實施例4活性位點定點突變進(jìn)一步鑒定A.aeolicus兩種假定嗜熱酯酶

為進(jìn)一步鑒定A.aeolicus兩種假定嗜熱酯酶，設(shè)計引物，通過全質(zhì)粒PCR對關(guān)鍵酶活性位點(Ser-His-Asp)進(jìn)行定點突變，構(gòu)建突變菌株。對于Aaeo1酯酶的酶活性位點(Ser62、Asp163、His190)，依次使用引物g9和g10、g11和g12、g13和g14。Aaeo2酯酶的酶活性位點(Ser82、Asp185、His212)依次使用引物g15和g16、g17和g18、g19和g20。(突變位點用粗體表示)

所述PCR引物(序列如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:18所示)：

g9：5’-CATGACGTAGTTGGTTGGGCTTTGGGAGGTTCTCTTGC-3’

g10：5’-GCAAGAGAACCTCCCAAAGCCCAACCAACTACGTCATG-3’

g11：5’-GATACACGGCGTCTCCAATCGAATTGTTCCCTAT-3’

g12：5’-ATAGGGAACAATTCGATTGGAGACGCCGTGTATC-3’

g13：5’-CTAATTTTATTAGGTGGCGGAAATTTTCCTGTTCGTAACGAAG-3’

g14：5’-CTTCGTTACGAACAGGAAAATTTCCGCCACCTAATAAAATTAG-3’

g15：5’-GAAATCACTTTGTGTGGATCTGCTCATGGTGGATATATTGCTA-3’

g16：5’-TAGCAATATATCCACCATGAGCAGATCCACACAAAGTGATTTC-3’

g17：5’-CCTGTTGAAATTGTTATTATGCATGGTATTAGAAACGACATTGTTCCTATT-3’

g18：5’-AATAGGAACAATGTCGTTTCTAATACCATGCATAATAACAATTTCAACAGG-3’

g19：

5’-GTTAAAAAGTTTTTGAAAGTTGACGATGATAACCAATTGAATGAATCTTTGCAAA-3’

g20：5’-TTTGCAAAGATTCATTCAATTGGTTATCATCGTCAACTTTCAAAAACTTTTTAAC-3’

將突變菌株表達(dá)的重組酶進(jìn)行純化，測定酶活性，發(fā)現(xiàn)酶活性消失，說明這三個位點對重組酶的重要性，也進(jìn)一步證實了這兩個假定蛋白為酯酶。

實施例5：純化的A.aeolicus嗜熱酯酶的底物特異性

分別測定兩種重組嗜熱酯酶對対硝基苯酚類和甘油脂類的底物特異性。

作用于対硝基苯酚類底物的酶活性如實施例3酶活測定。分別選用p-NPC₄、p-NPC₅、p-NPC₈、p-NPC₁₂、p-NPC₁₄、p-NPC₁₆6種底物，測定酶活性，選擇最適底物。

作用于甘油酯類底物的酶活性測定方法參照玉崧成論文(嗜熱脂肪酶分子克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究，吉林大學(xué)，2008)。選用三乙酸甘油脂、三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三葵酸甘油酯、三酸肉豆蔻甘油酯、三棕櫚酸甘油酯和橄欖油為底物，在50mM pH 8.0的磷酸緩沖液的緩沖液體系中，在70℃條件下測定酯酶活力，確定重組酶對三甘油酯類為底物時的最適底物。

結(jié)果如圖6所示，圖6重組酶Aaeo2傾向于水解短鏈底物，對中長鏈底物具有較低的相對酶活性，因此重組酶Aaeo2最適底物為p-NPC₄，Aaeo2對甘油酯類幾乎沒有酶活性。

實施例6：純化的A.aeolicus嗜熱酯酶最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性分析

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)

對純化獲得的重組嗜熱酯酶進(jìn)行了最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性分析。如圖7所示，結(jié)果表明，以p-NPC₄為底物時，重組酶Aaeo2的最適溫度為90℃，在70和80℃放置2h仍保留65％殘余酶活性。在90℃的半衰期2h。

實驗結(jié)果充分表明重組嗜熱酯酶Aaeo1和Aaeo2均具有滿足于工業(yè)生產(chǎn)中的高溫條件。

實施例7：純化的A.aeolicus嗜熱酯酶的T_m值測定

采用圓二色譜的方法，測定純化重組酶的蛋白熱穩(wěn)定性，即T_m值(熔解溫度)，溶解曲線斜率最大的點對應(yīng)的溫度即為T_m值，如圖8所示，可以看出重組酶Aaeo2的熔解曲線顯示在88℃時曲線變化最快，在高于90℃的溫度下曲線逐漸趨于平衡。因此T_m值為88℃，這也充分進(jìn)一步驗證了重組酶Aaeo2的熱穩(wěn)定性實驗。

實施例8：純化的A.aeolicus嗜熱酯酶最適作用pH和pH穩(wěn)定性分析

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)

對純化獲得的重組嗜熱酯酶Aaeo2進(jìn)行了最適作用pH及pH穩(wěn)定性分析.如圖9A所示，在pH8.0時，相對酶活最高，因此最適反應(yīng)pH值為8.0。重組酶Aaeo2的pH穩(wěn)定性如圖9B所示，分別測定重組酶在pH7.0-9.0條件下的穩(wěn)定性，隨著放置時間的增加，相對酶活急劇下降，半衰期依次為54min、50min和46min。

實施例9：各種金屬離子對純化的A.aeolicus嗜熱酯酶穩(wěn)定性的影響

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)。

由表1可以看出，對于重組酶Aaeo2，EDTA可以抑制其酶活性，說明其為金屬離子依賴性酶。對于Aaeo2，低濃度Fe³⁺、Co²⁺、Mn²⁺可以提高酶活性，低濃度Ca²⁺對酶活性影響不大，而高濃度Ca²⁺對重組酶具有輕微的抑制作用。

表1各種金屬離子對純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶穩(wěn)定性的分析

實施例10：各種有機(jī)溶劑對純化的A.aeolicus嗜熱酯酶穩(wěn)定性的影響

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)。

表2各種有機(jī)溶劑對純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶穩(wěn)定性的分析

由表2可以看出，重組酶Aaeo2具有很好的有機(jī)溶劑耐受性，環(huán)己烷可以激活酶活性，而高濃度正己烷、正丁醇和異丁醇對重組酶具有較強(qiáng)的抑制作用。低濃度的有機(jī)溶劑對酶活性影響不大。

實施例11：各種表面活性劑對純化的A.aeolicus嗜熱酯酶穩(wěn)定性的影響

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)。

由表3可以看出，表面活性劑對重組酶Aaeo2有一定的抑制作用，隨著表面活性劑濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，但低濃度對酶活性影響較小。

表3各種表面活性劑對純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶穩(wěn)定性的分析

實施例12：各種抑制劑對純化的A.aeolicus嗜熱酯酶穩(wěn)定性的影響

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)。

由表4可以看出，對于重組酶Aaeo2，PMSF(絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶抑制劑)和DEPC(His殘基修飾物)對重組酶具有較強(qiáng)的抑制作用。而DTT(主要用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原)可以提高酶活性。這表明Ser、His和Asp對酶活性的重要性。

表4各種抑制劑對純化的A.aeolicus重組嗜熱酯酶穩(wěn)定性的分析

實施例13：A.aeolicus嗜熱酯酶大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建，重組表達(dá)及其蛋白表達(dá)

一、大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

1)引物設(shè)計：從優(yōu)化后的基因設(shè)計引物，不包含C末端6xHis標(biāo)簽(序列如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:22所示)

g1:5’-GCTCATATGATGCTGAAGAACCCTTTGT-3’

g2:5’-GCTGGATCCTTAATACCCCTTTAAAATAGCTTT-3’

g3:5’-GCCCATATGATGTACTTCTACGATATTAACAA-3’

g4:5’-GGCGGATCCTTACAACAATTCCTCAATATATTTTTG-3’

2)PCR反應(yīng)，g1和g2以載體pPIC9K-Aaeo1為模板，退化溫度為50℃；g3和g4以載體pPIC9K-Aaeo2為模板，退化溫度為55℃。

反應(yīng)條件：98℃,3min預(yù)變性；變性，98℃,30s，退火，50℃(或55℃),1min，復(fù)性，72℃,45s，第二步到第四步進(jìn)行30個循環(huán)；72℃,10min；10℃保溫。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小為650和700bp左右的DNA片段，利用omega公司提供的凝膠純化試劑盒純化目的DNA片段。

3)NdeI和BamHI雙酶切Aaeo1和Aaeo2的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒MBP3，37℃酶切4h。利用omega公司提供的凝膠膠回收試劑盒回收目的DNA片段和載體

4)連接

取T4DNA ligase 1μl、10x T4DNAligase Buffer 1μl、目的基因+載體(n₁:n₂＝1:3)8μl，混合均勻，在16℃連接16h。

5)轉(zhuǎn)化

取10μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞BL21和Origami 2中，置于冰上30min，42℃熱激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，將轉(zhuǎn)化的菌液涂于LB(Amp)平板上，37℃培養(yǎng)過夜。在平板上分別挑取多個菌落轉(zhuǎn)接到試管，37℃培養(yǎng)8h。

6)提取質(zhì)粒

用omega公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，送至生物公司進(jìn)行測序鑒定。

二、重組表達(dá)載體MBP3-Aaeo1和MBP3-Aaeo2在大腸桿菌BL21和Origami 2中的表達(dá)

1)重組載體在兩種宿主中的誘導(dǎo)表達(dá)

在LB平板(含Amp)上挑取陽性重組菌株轉(zhuǎn)化子接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp)中，在37℃、200rpm過夜培養(yǎng)8h，得到種子液。

將種子液以1％接種量接種于50-100mL LB培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD600為0.6左右時，加入終濃度為0.2mM的IPTG，同時降溫至17℃培養(yǎng)，進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)12h左右即可。

2)重組酶的收集和純化

離心收集菌體，使用BufferA重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎。低溫離心破碎后的菌體溶液，收集上清液進(jìn)行蛋白純化。純化方法參考GE Healthcare指南。第一次蛋白純化得到MBP-Aaeo1和MBP-Aaeo2融合蛋白，通過超濾除去咪唑，加入適當(dāng)已純化的TEV酶進(jìn)行蛋白酶切，16℃酶切16h，進(jìn)行第二次蛋白純化，收集穿透峰，即為純化的重組蛋白Aaeo1和Aaeo2。SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。

分別對宿主胞外組分、周質(zhì)空間組分、細(xì)胞質(zhì)組分、全細(xì)胞組分、細(xì)胞沉淀組分進(jìn)行電泳分析，可見重組蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)組分中。畢赤酵母蛋白表達(dá)量為0.32mg/mL，大腸桿菌蛋白表達(dá)量為1.2mg/mL。與畢赤酵母相比，表達(dá)量提高。

3)酶活測定

大腸桿菌表達(dá)得到融合蛋白(兩個蛋白之間有TEV蛋白酶酶切位點)，使用TEV在16℃放置16h，分別測定TEV酶酶切前后的酶活性，結(jié)果顯示Origami2/MBP3-Aaeo2重組菌株表達(dá)的重組酶，酶切后比酶活力增加。

實施例14：A.aeolicus兩種嗜熱酯酶巨大芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建，重組表達(dá)及其蛋白表達(dá)

一、巨大芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

1)引物設(shè)計：從優(yōu)化后的基因設(shè)計引物(序列如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:26所示)

g5：5’-TAGAGATCTATATGCTGAAGAACCCTTTGTT-3’

g6：5’-TCAGGATCCTTAGTGATGATGATGGTGGT-3’

g7：5’-TAGAGATCTATATGTACTTCTACGACATCAACAA-3’

g8：5’-TGCGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGGTG-3’

2)按照常規(guī)PCR反應(yīng)，g5和g6以載體pPIC9K-Aaeo1為模板，退化溫度為51℃；g7和g8以載體pPIC9K-Aaeo2為模板，退化溫度為57℃。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小為650和700bp左右的DNA片段，利用omega公司提供的凝膠純化試劑盒純化目的DNA片段。

3)BglII和BamHI雙酶切Aaeo1和Aaeo2的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pHIS1525，37℃酶切4h。利用omega公司提供的凝膠膠回收試劑盒回收目的DNA片段和載體。

4)按照常規(guī)方法16℃連接16h。熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中。提取質(zhì)粒，送去生物公司測序鑒定。

二、重組表達(dá)載體pHIS1525-Aaeo1和pHIS1525-Aaeo2在巨大芽孢桿菌YYBm1中的表達(dá)

1)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)化到巨大芽孢桿菌YYBm1原生質(zhì)體細(xì)胞中，原生質(zhì)體的制備和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法參考“Bacillus megaterium Protein Production System”手冊。在含四環(huán)素抗性的LB平板上篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。

2)重組載體pHIS1525-Aaeo1和pHIS1525-Aaeo2在巨大芽孢桿菌YYBm1中的誘導(dǎo)表達(dá)

從抗性平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(含Tet)中，37℃、220rpm振蕩過夜培養(yǎng)，得到種子液。

按照1％接種量，將種子液接種于200mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含Tet)中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)，重組菌培養(yǎng)生長至OD600為0.3-0.4之間，加入0.5％(w/v)(D)-木糖作為誘導(dǎo)劑，仍保持37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)，每30-60min取一次樣品，測定OD600nm和蛋白濃度，直到誘導(dǎo)后6h結(jié)束培養(yǎng)。

3)重組酶的純化和SDS-PAGE分析

離心樣品收集菌體細(xì)胞和樣品上清，9000r/min，離心10min。胞外蛋白直接進(jìn)行蛋白純化，胞內(nèi)蛋白使用裂解緩沖液進(jìn)行裂解獲得。純化方法參考GE Healthcare指南。12％分離膠的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。

4)酶活性測定

嗜熱酯酶酶活測定方法參照王樂樂論文(華根霉脂肪酶的基因克隆、表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，江南大學(xué)，2008)：使用p-NPC4作為底物，pH8.0Tris-HCl緩沖液，在70℃條件下測定酶活性。酶活定義為一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol対硝基苯酚的酶量為一個酶活國際單位。

酶活性測定顯示具有酯酶活性。

這些實例表明，來源于超嗜熱菌Aquifex aeolicus的兩種假定蛋白為酯酶蛋白。隨著分子生物學(xué)，基因工程和酶工程等的迅猛發(fā)展，本發(fā)明首次鑒定并證實了兩種Aquifex aeolicus來源的新型嗜熱酯酶基因，并對酯酶蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的性質(zhì)研究。這些為新型嗜熱酯酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種來源于Aquifex aeolicus菌株的嗜熱酯酶及其功能驗證

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu Lys Asn Pro Leu Phe Ile His Gly Trp Ala Phe Ser Ser Lys

1 5 10 15

Val Phe Asn Asp Phe His Gly Ile Lys Tyr Asp Leu Pro Gly His Gly

20 25 30

Lys Asn Lys Asn Pro Tyr Glu Ser Ile Glu Lys Val Val Glu Glu Ile

35 40 45

Gly Lys Ile Ala Thr Ser Lys His Asp Val Val Gly Trp Ser Leu Gly

50 55 60

Gly Ser Leu Ala Leu Leu Phe Ala Tyr Arg Tyr Pro Glu Lys Val Asn

65 70 75 80

Arg Leu Ile Leu Ile Gly Thr Thr Pro His Phe Lys Gly Ala Trp Ser

85 90 95

Glu Lys Asn Ile Arg Ala Met Lys Leu Leu Ile Lys Lys Lys Gly Ile

100 105 110

Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Phe Glu Asp Phe Phe Asp

115 120 125

Glu Glu Gln Gly Met Arg Phe Leu Glu Asp Tyr Val Asn Leu Asn Leu

130 135 140

Tyr Thr Val Leu Pro Tyr Ile Lys Lys Glu Val Tyr Leu Ile His Gly

145 150 155 160

Val Ser Asp Arg Ile Val Pro Tyr Ser Glu Ala Tyr Lys Leu His Arg

165 170 175

Ala Leu Lys Cys Ser Lys Leu Ile Leu Leu Gly Gly Gly His Phe Pro

180 185 190

Val Arg Asn Glu Glu His Leu Arg Lys Ala Ile Leu Lys Gly Tyr

195 200 205

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Tyr Phe Tyr Asp Ile Asn Asn Glu Lys Arg Leu Trp Leu His Leu

1 5 10 15

His Gly Leu Ala Thr Asn Val Leu Gly Arg Lys Ile Glu Phe Leu Arg

20 25 30

Asn Tyr Phe Lys Glu Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Phe Ala Asn Asp Met

35 40 45

Asp Tyr Glu Lys His Thr Thr Thr Asn Thr Leu Asp Phe Leu Glu Val

50 55 60

Leu Val Arg Gly Phe Ser Gln Lys Phe Glu Glu Ile Thr Leu Cys Gly

65 70 75 80

Ser Ser His Gly Gly Tyr Ile Ala Met Asn Tyr Val Arg Lys Arg Pro

85 90 95

Leu Phe Asn Val Lys Arg Leu Val Leu Leu Ala Pro Ser Tyr Asn Thr

100 105 110

Leu Ser Leu Ile Ile Lys Glu Leu Gly Glu Asp Lys Val Lys Pro Trp

115 120 125

Leu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Thr Ile Leu Glu Glu Asp Arg Glu Val

130 135 140

Thr Phe Ile Lys Asp Trp Ala Lys Asp Ile Ile Gln Asn Asp Tyr Glu

145 150 155 160

Ile Ile Lys Asp Gly Arg Val Asp Phe Pro Glu Glu Pro Pro Val Glu

165 170 175

Ile Val Ile Met His Gly Ile Arg Asp Asp Ile Val Pro Ile His Tyr

180 185 190

Ser Glu Thr Phe Ala Lys Ser Val Lys Val Lys Lys Phe Leu Lys Val

195 200 205

Asp Asp Asp His Gln Leu Asn Glu Ser Leu Gln Lys Tyr Ile Glu Glu

210 215 220

Leu Leu

225

<210> 3

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgctcaaaa atcccctctt tatccacgga tgggcgtttt cctcaaaggt atttaatgac 60

tttcacggta taaagtacga ccttcccggg cacggaaaaa ataaaaatcc ctacgagagt 120

atagaaaaag tagtggaaga aattggaaaa atagccactt caaaacacga cgttgtaggc 180

tggtcccttg gaggaagtct ggcacttctt ttcgcttaca ggtatccaga aaaggtaaac 240

aggttgatcc ttatagggac cactccccac tttaaaggag cgtggagcga aaagaatata 300

agggctatga aactcctgat aaagaagaag gggataaaag ctttcaggga actagcctac 360

gggaaatttg aggacttctt tgacgaggag cagggcatga gatttcttga ggactacgtg 420

aacctgaact tgtacactgt acttccctat ataaagaagg aggtttacct gatacacgga 480

gtttcggaca gaatagttcc gtattcagaa gcttacaaac tgcatagagc tttaaaatgc 540

tctaaattaa tccttctcgg aggaggacac ttccctgtca gaaatgaaga acaccttagg 600

aaggcaattc tcaagggcta ctga 624

<210> 4

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtactttt acgatatcaa caacgagaag agactctggc ttcaccttca cggacttgcg 60

acaaacgtcc tcggaaggaa gatagagttt ttgaggaatt actttaagga aaagaagctt 120

tattcgtttt ttgcgaatga tatggactac gaaaagcaca caactacaaa caccttggat 180

tttttggaag ttctcgtcag aggattttcc cagaagtttg aagaaattac cctttgcggg 240

agttcccacg gcggttacat agcgatgaac tatgtaagga aaaggcctct ctttaatgta 300

aagagactcg tcttactcgc accctcatac aacacactat ccctgataat taaagagctc 360

ggagaagata aggtaaagcc atggcttgag ggaaaggaag aactcaccat acttgaagag 420

gacagggaag tgacctttat aaaggattgg gcaaaggaca taatacagaa cgactacgag 480

attataaaag acggaagggt ggatttcccc gaagagcctc ccgtggaaat agtgataatg 540

cacgggataa gggacgatat agtgccaatc cattattccg agacctttgc aaagagcgta 600

aaggtgaaaa aattcctcaa agtggacgac gaccaccagc taaacgaaag tctgcagaag 660

tatatagaag aactccttta g 681

<210> 5

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgctgaaga accctttgtt catccacggt tgggcatttt catctaaggt tttcaacgac 60

ttccatggta tcaagtacga tttgccagga catggaaaaa acaagaaccc atacgaatct 120

atagagaagg tggtagaaga gatcggtaaa atcgcaacat ctaagcatga cgtagttggt 180

tggagtttgg gaggttctct tgcattgctt tttgcttaca gatacccaga gaaagttaat 240

agactaattc tgataggtac tacccctcat ttcaaaggag cttggtcaga gaagaatatc 300

agagctatga aactgttgat taagaagaaa ggcattaagg ccttcagaga gctggcttat 360

ggtaaatttg aggatttctt tgatgaagaa caagggatga ggtttcttga agactatgtc 420

aatttgaatc tttacacggt gttgccctac attaagaaag aagtctattt gatacacggc 480

gtctccgatc gaattgttcc ctattccgaa gcctacaagc tacacagggc cttgaaatgt 540

tccaaactaa ttttattagg tggcggacat tttcctgttc gtaacgaaga acacttacgt 600

aaagctattt taaaggggta tggatcaagt caccaccatc atcatcacta a 651

<210> 6

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtacttct acgacatcaa caacgagaag agattgtggt tgcacttgca tggtttggct 60

actaatgttt tgggtagaaa aatcgaattt ttgagaaact acttcaagga gaagaagttg 120

tactctttct tcgctaatga catggattac gagaagcata ctactactaa cactttggat 180

ttcttggagg ttttggttag aggattctct cagaaattcg aagaaatcac tttgtgtgga 240

tcttctcatg gtggatatat tgctatgaac tatgttagaa agagaccatt gtttaatgtt 300

aaaagattgg ttttgttggc tccatcttac aatactttgt ctttgatcat caaggagttg 360

ggagaggata aggttaagcc ttggttggaa ggtaaagaag aattgactat tttggaagaa 420

gatagagaag ttacttttat caaggattgg gctaaagata tcattcagaa cgattatgag 480

attattaagg acggaagagt tgactttcca gaagagccac ctgttgaaat tgttattatg 540

catggtatta gagacgacat tgttcctatt cattattctg agacttttgc taaatctgtt 600

aaagttaaaa agtttttgaa agttgacgat gatcaccaat tgaatgaatc tttgcaaaaa 660

tatattgagg aattgttggg ttcttctcac caccatcatc accactaa 708

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgacgtag ttggttgggc tttgggaggt tctcttgc 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaagagaac ctcccaaagc ccaaccaact acgtcatg 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatacacggc gtctccaatc gaattgttcc ctat 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atagggaaca attcgattgg agacgccgtg tatc 34

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctaattttat taggtggcgg aaattttcct gttcgtaacg aag 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttcgttacg aacaggaaaa tttccgccac ctaataaaat tag 43

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaaatcactt tgtgtggatc tgctcatggt ggatatattg cta 43

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tagcaatata tccaccatga gcagatccac acaaagtgat ttc 43

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctgttgaaa ttgttattat gcatggtatt agaaacgaca ttgttcctat t 51

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aataggaaca atgtcgtttc taataccatg cataataaca atttcaacag g 51

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gttaaaaagt ttttgaaagt tgacgatgat aaccaattga atgaatcttt gcaaa 55

<210> 18

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttgcaaaga ttcattcaat tggttatcat cgtcaacttt caaaaacttt ttaac 55

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gctcatatga tgctgaagaa ccctttgt 28

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctggatcct taatacccct ttaaaatagc ttt 33

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcccatatga tgtacttcta cgatattaac aa 32

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggcggatcct tacaacaatt cctcaatata tttttg 36