一株谷氨酸棒桿菌及其過(guò)量合成磷脂酰絲氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于代謝工程及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株谷氨酸棒桿菌及其過(guò)量 合成磷脂酰絲氨酸的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 磷脂酰絲氨酸(PS)廣泛存在于動(dòng)植物及微生物的生物膜中，是一種重要的磷脂成 分。動(dòng)物組織的磷脂中PS的含量非常低，僅為總磷脂的2%~10%，PS在人體內(nèi)不能由自身 完全合成，主要通過(guò)外界食物攝取，雖然含量低，但卻有著重要的生理功能。PS可幫助腦細(xì) 胞儲(chǔ)存和讀取資料、影響腦內(nèi)化學(xué)信息的傳遞，是維持大腦正常反應(yīng)和健康情緒的重要營(yíng) 養(yǎng)元素。PS在治療阿耳茨海默(氏）病、兒童多動(dòng)癥和抑郁癥上具有很好的效果。
[0003] PS的制備方法比較多，其中主要以提取法和酶轉(zhuǎn)化法為主。提取法主要運(yùn)用有機(jī) 溶劑將動(dòng)植物原料中的PS萃取出來(lái)，但這種方法有很多限制因素。動(dòng)物提取方法主要從牛 腦和內(nèi)臟中提取PS，但因瘋牛病等不安全疾病而被質(zhì)疑;植物中PS含量低，提取量低，并且 很難提取高純度的PS，從而增加了分離純化的成本，造成PS價(jià)格的居高不下。與提取法相 比，生物酶法是利用磷脂酰膽堿為基質(zhì)，加入L-絲氨酸，在磷脂酶D(phospholipase D，PLD) 的作用下，生成磷脂酰絲氨酸(PS)，此方法反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品安全級(jí)別高，但PLD的生產(chǎn)成 本高，不易獲得，成為了生產(chǎn)PS的主要瓶頸。
[0004] PS作為磷脂成分之一存在于微生物體內(nèi)，因此利用遺傳工程手段獲得一株P(guān)S合成 高的工程菌株為PS的制備提供了新的思路，其中大腸桿菌和酵母菌提取磷脂已有報(bào)道，但 大腸桿菌并非食品安全菌株，酵母菌也因其生長(zhǎng)較緩慢限制了其產(chǎn)業(yè)化。谷氨酸棒狀桿菌 (C.glutamicum)作為一種兼性好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，自1957年被分離出來(lái)以后，它便逐漸 成為全世界范圍內(nèi)氨基酸生產(chǎn)的主要菌株。谷氨酸棒狀桿菌是一種食品級(jí)的微生物，并且 基因操作載體系統(tǒng)完善，因其生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐受性強(qiáng)、發(fā)酵條件成熟，是可將PS 產(chǎn)業(yè)化的潛力菌株。
[0005] C.Glutamicum中PS可由前體物質(zhì)L-絲氨酸和⑶P-甘油二酯在磷脂酰絲氨酸合成 酶的作用下生成。運(yùn)用代謝工程原理，對(duì)前體物質(zhì)L-絲氨酸和CDP-甘油二酯代謝途徑中的 關(guān)鍵酶進(jìn)行遺傳修飾或優(yōu)化，改變碳流分布，使更多碳流量進(jìn)入PS合成途徑，有利于目的產(chǎn) 物PS的合成。C. glutamicum中存在L-絲氨酸的分解代謝途徑，Netzer等人[Netzer R, Peters-ffendisch P，Eggeling L，et al.Cometabolism of a nongrowth substrate:L-serine utilization by Corynebacterium glutamicum.Appl Environ Microbiol,2004, 70:7148- 7155 ]證明了絲氨酸脫氨酶(sdaA編碼)能夠催化L-絲氨酸分解為丙酮酸，因此阻 斷該途徑有利于PS前體物質(zhì)L-絲氨酸的積累。有報(bào)道稱谷氨酸棒桿菌3-磷酸甘油酸脫氫酶 (serA編碼)在缺失C末端197個(gè)氨基酸后可以解除來(lái)自L-絲氨酸的反饋抑制作用[Peters-ffendisch P，Netzer R，Eggeling L.et al.3-Phosphoglycerate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum: the C-terminal domain is not essential for activity but is required for inhibition by L-serine[J].Appl Microbiol Biotechnol，2002，60(4):437-441 ]，從而有利于PS前體物質(zhì)L-絲氨酸的合成。同時(shí)，過(guò)表達(dá) CDP-甘油二酯合成酶(cdsA編碼)可提高PS前體物質(zhì)CDP-甘油二酯在代謝途徑中的含量。另 外，磷脂酰絲氨酸合成酶(pssA編碼)可以L-絲氨酸和CDP-甘油二酯為前體物質(zhì)，催化合成 PS，因此提高其表達(dá)量，有利于產(chǎn)物PS的合成。本發(fā)明旨在提供一株過(guò)量合成磷脂酰絲氨酸 谷氨酸棒桿菌及其生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一:是提供一種高產(chǎn)磷脂酰絲 氨酸(PS)的谷氨酸棒桿菌工程菌，用于過(guò)量合成PS。
[0007] 所述工程菌，是將谷氨酸棒桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)L-絲氨酸脫氨酶的sdaA基因進(jìn)行 敲除，并串聯(lián)表達(dá)磷脂酰絲氨酸合成酶的表達(dá)基因 pssA基因、3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變 基因 serAM97基因和⑶P-甘油二酯合成酶的表達(dá)基因 cdsA基因；
[0008] 所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示；
[0009] 所述serAA197基因來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
[0010] 所述cdsA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0011] 優(yōu)選的，所述磷脂酰絲氨酸合成酶的表達(dá)基因?yàn)閜ssAM基因；
[0012]優(yōu)選的，所述⑶P-甘油二酯合成酶的表達(dá)基因?yàn)閏dsAM基因；
[0013]優(yōu)選的，所述工程菌，是將谷氨酸棒桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)L-絲氨酸脫氨酶的sdaA 基因進(jìn)行敲除，并串聯(lián)表達(dá)磷脂酰絲氨酸合成酶的突變基因 pssAM基因、3-磷酸甘油酸脫氫 酶突變基因 serAM97基因和⑶P-甘油二酯合成酶突變基因 cdsAM基因；
[0014] 所述pssAM基因，是將來(lái)源于E.coli K12的pssA基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化所得，可提 高PS在谷氨酸棒桿菌中15%以上的表達(dá)量，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；
[0015] 所述serAA197基因，缺失了谷氨酸棒桿菌中3-磷酸甘油酸脫氫酶C端的197個(gè)氨基 酸，可解除絲氨酸反饋抑制，該基因來(lái)源于谷氨酸棒桿菌ATCC13032;
[0016] 所述cdsAM基因，是cdsA基因的突變基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所 示，其表達(dá)產(chǎn)物A74R的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，是將谷氨酸棒桿菌中原始CDP-甘油 二酯合成酶的第74位氨基酸Ala突變?yōu)锳rg，酶活提高10%以上；
[0017] 所述工程菌株具體為谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)M_l，該菌株 已于2015年12月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京 市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC Νο·11923〇
[0018] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二:是提供技術(shù)方案一所述工程菌 株的制備方法，具體如下：
[0019] (1)谷氨酸棒桿菌sdaA缺失菌株的構(gòu)建；
[0020] (2)擴(kuò)增pssA或pssAM基因序列，連接至pXMJ19,構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-pssA或 pXMJ19-pssAM；
[0021] (3)以谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，擴(kuò)增serAM97基因片段，并連接 至表達(dá)載體口乂]^<11918 8八或口乂]\1<11918 8八]\1上，構(gòu)建出重組質(zhì)?？趤V]\1<11918 8八-86^1197或 pXMJ19-pssAM-serAA197；
[0022] (4)擴(kuò)增cdsA或cdsAM基因片段，分別連接至步驟(3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒上，構(gòu)建出新 的重組質(zhì)粒；
[0023] (5)將步驟(4)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌sdaA缺失菌株感受態(tài)細(xì)胞中； 獲得了一株過(guò)量合成磷脂酰絲氨酸的重組菌株。
[0024]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之三:是提供一種PS制備方法，具體 如下：
[0025] 1)菌株:以技術(shù)方案一所述的工程菌株為生產(chǎn)菌株；
[0026] 2)培養(yǎng)基
[0027]活化斜面或平皿培養(yǎng)基:牛肉膏7~12g/L，酵母粉3~6g/L，蛋白胨7~12g/L，氯化 鈉3~6g/L，玉米楽120~160mL/L，瓊脂條10~40g/L，調(diào)節(jié)pH至7 · 0~7 · 2，121 °C滅菌15min;
[0028] 種子或發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20~40g/L，玉米漿15~45mL/L，豆柏水解液10~30mL/ UK2HPO3 · 3H20 1 ~3g/L，MgS〇4 · 7H20 0.5~2g/L，尿素2~4g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0~7.2，121°C 滅菌15min;
[0029] 3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0030] 將30 °C、150~250rpm下培養(yǎng)10~14小時(shí)的種子培養(yǎng)液以2%接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng) 基，于30°C、150~250rpm條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)4~8h時(shí)加入IPTG終濃度為1.0mmol/L，繼續(xù)培 養(yǎng)22~25h。
[0031] 有益效果：
[0032] 1、本發(fā)明所提供的cdsAM突變基因，將谷氨酸棒桿菌中⑶P-甘油二酯合成酶的第 74位氨基酸Ala突變?yōu)锳rg，酶活提高10 %以上，繼而使PS合成率提高。
[0033] 2、使用本發(fā)明提供的基因工程菌用于發(fā)酵制備PS，可使PS產(chǎn)量達(dá)到0.3378mg/g - 0.4013mg/g菌體，與原始菌株相比提高了 17%以上，特別是菌株M-1用于PS發(fā)酵，產(chǎn)量較出 發(fā)菌株提高39 %。
【附圖說(shuō)明】：
[0034] 圖1本發(fā)明所構(gòu)建菌株中sdaA基因敲除驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0035] 其中，Μ為DNA Marker，l為重組菌株M-l，2為原始菌株ATCC13032;
[0036] 圖2本發(fā)明cdsAM基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖
[0037] 其中，Μ為DNA Marker，1 為cdsAM;
[0038] 圖3本發(fā)明pssAM基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖
[0039] 其中，Μ為DNA Marker，1 為pssAM;
[0040] 圖4本發(fā)明serA"197基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖 [0041 ]其中，Μ為DNA Marker，l 為serAM97;
[0042] 圖5本發(fā)明重組質(zhì)粒pXMJ19-pssAM-serAM97-cdsAM的構(gòu)建圖譜。
【具體實(shí)施方式】：
[0043]本發(fā)明的技術(shù)方案