一種高產(chǎn)l-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L?賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法。該方法將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明提供一種高產(chǎn)L?賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株的構(gòu)建方法，構(gòu)建的該菌株由于內(nèi)源基因NCgl1221失活引起谷氨酸胞外分泌量明顯降低，與野生型相比，該菌株可生產(chǎn)高濃度的L?賴氨酸，并能有效降低發(fā)酵液副產(chǎn)物谷氨酸的含量，作為L(zhǎng)?賴氨酸生產(chǎn)菌株能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)和純化成本。
【專利說明】
一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法，屬于生物技 術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-賴氨酸屬于天冬氨酸家族氨基酸，是人和動(dòng)物體八大必須氨基酸之一。L-賴氨 酸具有多種生理功能，如具備平衡氨基酸組成、調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高機(jī)體對(duì)谷類蛋白質(zhì) 的吸收及利用率和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等，因而被廣泛應(yīng)用于飼料、食品及醫(yī)藥行業(yè)中。由于 市場(chǎng)需求旺盛，L-賴氨酸目前已成為僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種，年產(chǎn)量約350萬 噸。工業(yè)上生產(chǎn)L-賴氨酸的方法主要有三種，即蛋白水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。 其中微生物發(fā)酵法由于具有低成本、高產(chǎn)率、低污染等優(yōu)勢(shì)成為目前L-賴氨酸生產(chǎn)的主流 方法。
[0003] 目前可用于L-賴氨酸生產(chǎn)的微生物主要為細(xì)菌，包括棒狀桿菌、短桿菌、念球菌、 假單胞菌、芽孢桿菌、埃希氏菌等，其中以屬于棒狀桿菌屬的谷氨酸棒狀桿菌目前應(yīng)用最為 廣泛。雖然自然界微生物能夠直接發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸，但產(chǎn)量通常較低，因此需要對(duì)微生物 進(jìn)行改造。如中國(guó)發(fā)明專利CN1539015公開了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在內(nèi)的多 個(gè)可用于賴氨酸產(chǎn)量提高的基因改進(jìn)位點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN10 1600796(申請(qǐng)?zhí)?200780048626 · 8)、CN1974760(申請(qǐng)?zhí)?00610163142 · 5)、CN103243042(申請(qǐng)?zhí)?201310092638.8)分別對(duì)基因從^22534、從^11835、％821090進(jìn)行失活獲得一系列1^-賴氨酸 產(chǎn)率提高的谷氨酸棒狀桿菌工程菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的 構(gòu)建方法。本發(fā)明通過改造菌株谷氨酸棒狀桿菌獲得，具體策略為失活谷氨酸棒狀桿菌內(nèi) 源基因 NCgll221(編碼谷氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）以降低賴氨酸發(fā)酵過程中谷氨酸的胞外分泌， 減少L-賴氨酸發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中副產(chǎn)物谷氨酸的含量，使更多的碳流量流向L-賴氨酸合成方 向，提高L-賴氨酸發(fā)酵底物利用率，便于純化。
[0005] 術(shù)語說明
[0006] 本發(fā)明中，"失活"可以通過本領(lǐng)域已知的任何失活方法來誘導(dǎo)。"失活"產(chǎn)生的效 果是指內(nèi)源基因 NCgll221的表達(dá)被降低到很低的水平，或者產(chǎn)生不表達(dá)基因以及盡管被表 達(dá)但表達(dá)不具有活性或活性降低的產(chǎn)物。
[0007] 本發(fā)明中，"失活"可以通過基因工程手段在內(nèi)源基因 NCgll221中插入一個(gè)或多個(gè) 堿基對(duì)，或者缺失該內(nèi)源基因 NCgl 1221中的一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，或者由基因內(nèi)部序列轉(zhuǎn)換 或顛換獲得。
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0009] -種高產(chǎn)L -賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，是將谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)的NCgll221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgll221基因編碼框的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[00?0] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)來源于 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC 23604。
[0011 ]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述構(gòu)建方法，步驟如下：
[0012] (1)通過PCR擴(kuò)增NCg 11221基因編碼框內(nèi)一段長(zhǎng)度大于400bp的基因片段作為同 源臂序列，NCgll221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0013] ⑵通過PCR擴(kuò)增抗性標(biāo)簽基因片段；
[0014] (3)將步驟（1)制得的同源臂序列與步驟（2)制得的抗性標(biāo)簽基因片段進(jìn)行重疊 PCR進(jìn)行連接，制得融合片段的兩末端均含有相同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并且該酶切位 點(diǎn)不能出現(xiàn)在擬敲除基因和抗性標(biāo)簽基因中；
[0015] (4)制備谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將步驟(3)制得的融合基因經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)化谷 氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即得。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1)中，PCR擴(kuò)增以谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)的基因組DNA為模板，獲得同源臂NCgl，PCR擴(kuò)增引物的核 苷酸序列如下：
[0017] FI:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；
[0018] Rl：AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
[0019] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μ1: 2xHiFi-PCR maslcr 25μ1 FI (ΙΟμηιοΙ/L) 2μ1
[0020] Rl (10uniol/L) 2μ1 模板 2μ1 dd Η20 19μ1；
[0021] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0022] 95 °C 預(yù)變性 5min; 94°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72 。(:延伸 10min，4°C 保存。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增模板為穿梭質(zhì)粒pHTOl(購(gòu)自杭州寶 賽生物科技有限公司）的DNA，獲得氯霉素抗性基因 Cnf;PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：
[0024] F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
[0025] R2：CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
[0026] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μ1: 2xHiFi-PCR maslcr 25μ1 F2 (ΙΟμηιοΙ/L) 2μΙ
[0027] R2 ( 10 μ mol/L) 2μΙ 模板 2μ1 dd Η20 19μΙ ：
[0028] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0029] 95 °C 預(yù)變性 5min; 94°C 變性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，重疊 PCR的第一階段擴(kuò)增體系如下，總體系為 25μ1： 2xHiFri-PCR master 12.5μ1 NCg! 2μ1
[0031] CnV. 2μ1 dd Η2〇 8.5μ1
[0032] 重疊 PCR的第一階段擴(kuò)增程序如下：
[0033] 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin;
[0034] 重疊 PCR的第二階段擴(kuò)增體系為在第一階段擴(kuò)增后的產(chǎn)物基礎(chǔ)上加入如下成分， 總體系為50μ1: 2.xHiFi-PCR master 12.5μ1 FI UOumol/L) 2μ1
[0035] ,. 、 R2 Cl〇iamol/L) :2μ1 dd H20 8 5μΙ
[0036] 重疊 PCR的第二階段擴(kuò)增程序如下：
[0037] 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存。
[0038]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)的具體步驟如下：
[0039] (i)挑取谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)單菌落，在種子培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.7~0.9，置于冰上冷卻，冷卻后離心，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌 菌體3~5次，電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，制得感受態(tài)細(xì)胞；
[0040] (i i)對(duì)步驟(3)制得的融合基因進(jìn)行單酶切，28~32 °C酶切2~5h，高壓電擊轉(zhuǎn)化 至步驟（i)制得的感受態(tài)細(xì)胞中，移入液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，在28~32°C培養(yǎng)3~4h后，篩選，即 得。
[0041 ]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(ii)中單酶切體系如下，總體系為40μ1:
[0042] l〇xK BuiTcr 4μ1 限制性內(nèi)切酶BamHI 4μ!
[0043] ΜΓ以-Cnf (融合基因） 20μ丨 ddH：0 12μ!,
[0044] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，種子培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0045] 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化鈉8~12g、山梨醇85~96g。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，電轉(zhuǎn)緩沖液，每升組分如下：
[0047] 山梨醇85~96g、甘露醇85~96g、甘油95~105mL。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（i)中，高壓電擊轉(zhuǎn)化的條件為：2100V電擊 5ms 〇
[0049]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(ii)中液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0050] 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化鈉8~12g、山梨醇85~96g、甘露醇65~73g。
[0051]上述構(gòu)建方法制得的高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌在生產(chǎn)L-賴氨酸中 的應(yīng)用。
[0052] 構(gòu)建原理
[0053]谷氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)谷氨酸的胞外分泌，但在高產(chǎn)L-賴氨酸菌種中，發(fā)明人 通過研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)則會(huì)造成L-賴氨酸發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中副產(chǎn)物谷氨酸的含量的增 加，導(dǎo)致碳流量流向L-賴氨酸合成方向減少，進(jìn)而影響包括賴氨酸的合成在內(nèi)的細(xì)胞其它 代謝過程。因此，通過構(gòu)建NCgll221基因失活，從而達(dá)到獲得L-賴氨酸高產(chǎn)的重組菌。
[0054] 有益效果
[0055] 本發(fā)明提供一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株的構(gòu)建方法，構(gòu)建的該菌株 由于內(nèi)源基因 NCgll221失活引起谷氨酸胞外分泌量明顯降低，與野生型相比，該菌株可生 產(chǎn)高濃度的L-賴氨酸，并能有效降低發(fā)酵液副產(chǎn)物谷氨酸的含量，作為L(zhǎng)-賴氨酸生產(chǎn)菌株 能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)和純化成本。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0057]實(shí)施例1:基因敲除片段構(gòu)建
[0058] 1) (i)提取谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)23604基因組DNA，以 該基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到同源臂NCg 1;
[0059] 所述的PCR引物序列如下：
[0060] F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；
[0061 ] Rl：AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
[0062]所述的PCR擴(kuò)增體系為：
[0065] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0066] 95 °C 預(yù)變性 5min; 94°C 變性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72 。(:延伸 10min，4°C 保存；
[0067]瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為528bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒 (上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20°C保存，備用；
[0068] (ii)提取穿梭質(zhì)粒pHTOl (購(gòu)自杭州寶賽生物科技有限公司）的DNA，以DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cnf片段；
[0069] 所述的PCR引物序列如下：
[0070] F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
[0071] R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
[0072] 所述的PCR擴(kuò)增體系為：
[0074] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0075] 95 °C 預(yù)變性 5min; 94°C 變性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0076] 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1274bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒 (上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20°C保存，備用；
[0077] (i i i)將步驟（i)制得的NCg 1片段與步驟（i i )制得的Cnf片段進(jìn)行重疊 PCR，制得 NCgl-Cnf 片段；
[0078]所述的重疊 PCR的擴(kuò)增體系為：
[0081 ]所述的重疊 PCR的第一階段擴(kuò)增程序如下：
[0082] 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin;
[0083] 所述的重疊 PCR的第二階段擴(kuò)增程序如下：
[0084] 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0085] 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1777bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒 (上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20°C保存，備用；
[0086] 實(shí)施例2:制備地衣芽孢桿菌感受態(tài)
[0087] (i)挑取谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)23604單菌落，接種于 1 OmL種子培養(yǎng)基中，37 °C、220r/min，過夜培養(yǎng)；
[0088] 種子培養(yǎng)基，組分如下：
[0089]蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g、山梨醇91g。
[0090] (i i )取lmL上述菌液轉(zhuǎn)接到100mL種子培養(yǎng)基中，37 °C、220r/min培養(yǎng)至OD6〇〇 = 0.9；
[0091] (i i i)將菌液轉(zhuǎn)移至100mL離心管，冰浴15-20min，使菌體停止生長(zhǎng)；
[0092] (iv)冰浴后4°C、5000g、5min離心，收集菌體；
[0093] (v)離心后的菌體用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(ETM)洗滌3次；
[0094]電轉(zhuǎn)緩沖液，每升組分如下：
[0095]山梨醇91g、甘露醇91g、甘油100mL。
[0096] (vi)洗滌結(jié)束后，使用lOOOyL電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體；
[0097] (vii)將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝100yL每管，-80°C保存，備用。
[0098] 實(shí)施例3 :NCgl-Cnf片段電轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) 23604
[0099] (i)將NCgl-Cnf片段用限制性內(nèi)切酶BamH I，30°C酶切3h;酶切體系(40yL)如下：
[0101] (ii)濃縮純化酶切產(chǎn)物
[0102] (1)加入1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積無水乙醇，置于-20°c冰箱20min;
[0103] (2)12000r/min，離心 5min 得沉淀；
[0104] (3) 300yL體積百分比為75 %的乙醇重懸沉淀；
[0105] (4)12000r/min，離心5min，除去乙醇，37°C 風(fēng)干 30min，
[0106] (5)加入15~18yL ddH20重懸DNA，并置于-20°C保存。
[0107] (iii)電轉(zhuǎn)化
[0108]首先利用核酸超微量分光光度計(jì)測(cè)定NCgl-Cnf片段濃度，達(dá)到300yg/mL濃度后 2100V電擊5ms，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，得到的細(xì)胞使用復(fù)蘇培養(yǎng)基30°C復(fù)蘇培養(yǎng)lh后，取100yL涂布 在含200yg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)2天，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。
[0109]液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0110]蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g。
[0111] 實(shí)施例4:陽性重組菌的培養(yǎng)及鑒定
[0112] 挑取上述陽性重組菌落，接種到含200yg/mL氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37°C培 養(yǎng)過夜，培養(yǎng)完成后，使用上海生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得 的基因組為模板，F(xiàn)jPR 2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證；
[0113] 所述的PCR引物序列如下：
[0114] Fi：CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT
[0115] R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
[0116] 其中，下劃線標(biāo)識(shí)的為酶切位點(diǎn)
[0117] 所述的PCR擴(kuò)增體系為20μ1:
[0119] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0120] 95 °C 預(yù)變性 5min; 94°C 變性 30sec，57 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0121] 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示，使用引物內(nèi)和辦能夠擴(kuò)增出一條特異性 基因條帶，大小約為1800b，與理論值1777bp接近，表明目的基因已成功整合到谷氨酸棒狀 桿菌基因組上，制得高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌。
[0122] 實(shí)施例4: L-賴氨酸發(fā)酵測(cè)試
[0123] 將制備的高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌接種至100mL LBG培養(yǎng)基（葡萄 糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 30°C下進(jìn)行種子培養(yǎng)20h，其后 按體積百分比2 %接種量接種至100mL發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，玉米漿 30mL，尿素5g/L，（NH4)2S〇4 25g/L，L-亮氨酸0.34g/L，KH2P04 2g/L，MgS〇4.7H2〇 1.5g/L，生 物素 0.0 Olg/L)發(fā)酵培養(yǎng)36h，并通過日立L-8900型高速氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵液中氨 基酸的含量。
[0124] 結(jié)果顯示與原始菌相比，高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌發(fā)酵液中谷氨酸 的含量由3.8g/L降低至儀器未檢出水平，賴氨酸的產(chǎn)量由40.0g/L提升至43.2g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，其特征在于，將谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)的NCgll221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgll221基因編碼框的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC 23604。3. 如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下： (1) 通過PCR擴(kuò)增NCg 11221基因編碼框內(nèi)一段長(zhǎng)度大于400bp的基因片段作為同源臂 序列，NCgll221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； (2) 通過PCR擴(kuò)增抗性標(biāo)簽基因片段； (3) 將步驟（1)制得的同源臂序列與步驟(2)制得的抗性標(biāo)簽基因片段進(jìn)行重疊 PCR進(jìn) 行連接，制得融合片段的兩末端均含有相同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并且該酶切位點(diǎn)不 能出現(xiàn)在擬敲除基因和抗性標(biāo)簽基因中； (4) 制備谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將步驟(3)制得的融合基因經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)化谷氨酸 棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即得。4. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（1)中，PCR擴(kuò)增以谷氨酸棒狀 桿菌(Corynebacterium glutamicum)的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如 下： FI:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT； R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC； PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μ1: 2><HiFi-PCR masier 2:5μ1 FI (iOumol/L) 2μ1 R1 (l〇ymol/L) 2μ1 模板 2μ1 dd H20 19μ1； PCR擴(kuò)增程序如下： 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，54°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延 伸 10min，4°C 保存。5. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增模板為穿梭質(zhì) 粒pHTO 1的DNA; PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下： F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA； R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT； PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μ1: 2><HiFi-PCR masier 25μ1 F2 (ΙΟμιηοΙ/L) 2μ1 R2 ( ΙΟμηιοΙ/L) 2μL 糢板 2μ1 dd Η20 】9μΙ; 所述的PCR擴(kuò)增程序如下： 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 10min，4°C 保存。6. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(3)中，重疊 PCR的第一階段擴(kuò) 增體系如下，總體系為25μ1: 2^HiFi-PCR master 12.5μ1 NCgl 2μ1 CnV 2μΙ dd Η,Ο 8.5μ1 重疊 PCR的第一階段擴(kuò)增程序如下： 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 lOmin； 重疊 PCR的第二階段擴(kuò)增體系為在第一階段擴(kuò)增后的產(chǎn)物基礎(chǔ)上加入如下成分，總體 系為50μ1: 2：<HiFi-PCR master 12.5μ1 FI (10umol/L) 2μ1 R2 ( 10 μ moi/L) 2μ! dd Η2(3 8 5μΙ 重疊 PCR的第二階段擴(kuò)增程序如下： 95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 10min，4°C 保存。7. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(4)的具體步驟如下： (：0挑取谷氨酸棒狀桿菌（(>3巧11663(^61'；[11111〖11^3111；[〇11111)單菌落，在種子培養(yǎng)基中培 養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.7~0.9，置于冰上冷卻，冷卻后離心，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌菌體 3~5次，電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，制得感受態(tài)細(xì)胞； (ii)對(duì)步驟(3)制得的融合基因進(jìn)行單酶切，28~32°C酶切2~5h，高壓電擊轉(zhuǎn)化至步 驟(i)制得的感受態(tài)細(xì)胞中，移入液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，在28~32°C培養(yǎng)3~4h后，篩選，即得。8. 如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（ii)中單酶切體系如下，總體 系為40μ1: 1〇χΚ Buficr 4μ1 限制性內(nèi)切酶BamH I 4μ1 A^VZ-Cm1' 20μ1 ddH.O 12μΙ〇9. 如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（i)中，種子培養(yǎng)基，每升組分 如下： 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化鈉8~12g、山梨醇85~96g; 優(yōu)選的，所述步驟(i)中，電轉(zhuǎn)緩沖液，每升組分如下： 山梨醇85~96g、甘露醇85~96g、甘油95~105mL; 優(yōu)選的，所述步驟(i)中，高壓電擊轉(zhuǎn)化的條件為:2100V電擊5ms; 優(yōu)選的，所述步驟(i i)中液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，每升組分如下： 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化鈉8~12g、山梨醇85~96g、甘露醇65~73g。10.權(quán)利要求1所述構(gòu)建方法制得的高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌在生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P13/08GK105950524SQ201610270794
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】王瑞明, 汪俊卿, 王蕾, 王騰飛, 李桂華, 王建彬, 隋松森
【申請(qǐng)人】齊魯工業(yè)大學(xué), 諸城東曉生物科技有限公司, 山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所