本發(fā)明涉及一種芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的工程菌及其構(gòu)建方法，特別涉及一種芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌工程菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，是革蘭氏陽性細(xì)菌的典型代表，具有無治病性，表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定的特點；其細(xì)胞壁的組成簡單，在細(xì)胞壁合成過程中沒有內(nèi)毒素的生成，已經(jīng)被美國、日本、歐盟和中國認(rèn)定為安全無毒的菌株，廣泛應(yīng)用于食品、飼料等行業(yè)。芽孢(內(nèi)生孢子或稱孢子)是芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞受到營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物積累，或溫度變化等外部環(huán)境因子的觸發(fā)而形成的休眠體，芽孢的形成需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。

近年來以芽孢衣殼蛋白為分子載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將外源目的蛋白展示于重組枯草芽孢桿菌芽孢表面，制備具有生物活性的重組芽孢抗體和酶制劑已成為人們研究和關(guān)注的熱點。構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌的芽孢表面展示體系時，利用芽孢衣殼蛋白融合展示海藻糖合酶，將底物麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，不僅能夠避免因誘導(dǎo)劑的使用而造成限制，而且融合酶不需要穿過細(xì)胞膜，將海藻糖合酶直接應(yīng)用于高端海藻糖的生產(chǎn)制備中，避免因細(xì)胞破碎，雜質(zhì)分離造成的成本增加及熱源物質(zhì)對海藻糖的污染,該法是海藻糖生產(chǎn)的有效技術(shù)手段。但是由于芽孢易受萌發(fā)劑刺激而萌發(fā)，使展示芽孢在轉(zhuǎn)化麥芽糖制備海藻糖體系中穩(wěn)定性較差,海藻糖合酶異源表達(dá)后，只能利用一次，不能充分回收利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌工程菌，使枯草芽孢桿菌中編碼芽孢萌發(fā)的皮層溶解酶基因sleB和cwlJ失活后獲得；

所述sleB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；cwlJ基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述編碼芽孢萌發(fā)的皮層溶解酶基因sleB和cwlJ失活為通過基因敲除、基因增補(bǔ)、基因替換或基因突變引起編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB的啟動子、終止子或編碼區(qū)的變化導(dǎo)致編碼芽孢萌發(fā)的皮層溶解酶基因sleB和cwlJ無法表達(dá)。

上述芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

(i)以枯草芽孢桿菌為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到sleB1，cwlJ1片段；

sleB1片段擴(kuò)增的PCR引物序列如下：

sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’； SEQ ID NO.3

sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’； SEQ ID NO.4

cwlJ1片段擴(kuò)增的PCR引物序列如下：

cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’； SEQ ID NO.5

cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’； SEQ ID NO.6

(ii)以質(zhì)粒pPIC9k為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到km^r片段；

所述的km^r片段PCR擴(kuò)增引物序列如下：

km^r-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’； SEQ ID NO.7

km^r-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’； SEQ ID NO.8

(iii)以pPICZαA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到zeo^r片段；

所述的zeo^r片段PCR擴(kuò)增引物序列如下：

zeo^r-up:5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’； SEQ ID NO.9

zeo^r-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’； SEQ ID NO.10

(iv)利用重疊PCR技術(shù)連接sleB1和km^r片段，制得sleB1-km^r片段，步驟如下：

初次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板sleB1 1μl，模板km^r 1μl，用ddH₂O補(bǔ)足25μl；

初次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，5個循環(huán)；

補(bǔ)充PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

向初次擴(kuò)增后的體系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L引物sleB-up 1μl，10μmol/L引物km^r-down 1μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

補(bǔ)充PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存；

(v)利用重疊PCR技術(shù)連接cwlJ1和zeo^r片段，制得cwlJ1-zeo^r片段，步驟如下：

初次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板cwlJ1 1μl，模板zeo^r 1μl，用ddH₂O補(bǔ)足25μl；

初次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，5個循環(huán)；

補(bǔ)充PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

向初次擴(kuò)增后的體系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L引物cwlJ-up 1μl，10μmol/L引物zeo^r-down 1μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

補(bǔ)充PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存；

(vi)將步驟(iv)制得的sleB1-km^r片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得sleB基因缺失菌后，再將步驟(v)制得的cwlJ1-zeo^r基因轉(zhuǎn)化sleB基因缺失菌中獲得sleB，cwlJ基因雙缺失菌株，經(jīng)篩選，制得芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(i)中，sleB1片段擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物sleB-up 2.5μl，10μmol/L引物sleB-down 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

sleB1片段擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(i)中，cwlJ1片段擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物cwlJ-up 2.5μl，10μmol/L引物cwlJ-down 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

cwlJ1片段擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，所述的km^r片段PCR擴(kuò)增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物km^r-up 2.5μl，10μmol/L引物km^r-down 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的km^r片段PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(iii)中，所述的zeo^r片段PCR擴(kuò)增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物zeo^r-up 2.5μl，10μmol/L引物zeo^r-down 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的zeo^r片段PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(vi)中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168?？莶菅挎邨U菌168來源于杭州寶賽生物有限公司。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(vi)中的轉(zhuǎn)化為：將枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞在2500V、25uF的條件下電擊一次，時間常數(shù)＝4.5～5.0ms。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(vi)中的篩選，包括卡那青霉素篩選和博來霉素篩選。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述卡那青霉素篩選步驟如下：

在含有卡那青霉素抗生素的平板上進(jìn)行白斑篩選，挑取白色單一斑點，接種到含有卡那青霉素的液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)末期，對能在含有卡那青霉素抗生素的LB培養(yǎng)基上生長的菌液進(jìn)行PCR驗證，將能夠擴(kuò)增出目的條帶的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，含有目的條帶的，即得；

含有卡那青霉素的液體LB培養(yǎng)基，每升組分如下：

10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg卡那青霉素，定容至1L。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述博來霉素篩選步驟如下：

在含有博來霉素抗生素的平板上進(jìn)行白斑篩選，挑取白色單一斑點，接種到含有博來霉素的液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)末期，對能在含有博來霉素抗生素的LB培養(yǎng)基上生長的菌液進(jìn)行PCR驗證，將能夠擴(kuò)增出目的條帶的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，含有目的條帶的，即得；

含有博來霉素的液體LB培養(yǎng)基，每升組分如下：

10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg博來霉素，定容至1L。

有益效果

1、本發(fā)明首次通過失活芽孢萌發(fā)的皮層溶解酶基因sleB和cwlJ弱化芽孢萌發(fā)的方式提高芽孢表面展示海藻糖合酶的穩(wěn)定性，經(jīng)實際驗證，可有效提高海藻糖合酶的酶活，12h內(nèi)海藻糖合酶酶活可保持95％以上；

2、本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌工程菌表達(dá)體系具有安全、無內(nèi)毒素的特點，在食品與醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域倍受認(rèn)可；

3、本發(fā)明構(gòu)建的芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌工程菌，既不影響菌株本身形成芽孢，同時還弱化了芽孢在麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中的萌發(fā)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的sleB基因敲除轉(zhuǎn)化子的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：泳道M為DNA分子量標(biāo)記(DNA marker)，泳道1-3為轉(zhuǎn)化子條帶，大小為2094bp；

圖2為本發(fā)明的cwlJ基因敲除轉(zhuǎn)化子的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：泳道M為DNA分子量標(biāo)記(DNA marker)，泳道1-3為轉(zhuǎn)化子條帶，大小為1656bp；

圖3為本發(fā)明的麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖的高效液相色譜；

圖中：M為麥芽糖，T為海藻糖糖，A為Bacillus Subtilis 168轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖色譜，B為Bacillus Subtilis 168ΔsleBΔcwlJ工程菌轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖色譜；

圖4為本發(fā)明的芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌海藻糖酶相對酶活；

圖中：芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌的海藻糖合酶的相對酶活在12h內(nèi)可保持95％以上，較枯草芽孢桿菌原始菌有顯著提高。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來源：

枯草芽孢桿菌168、穿梭質(zhì)粒pPIC9k和pPICZαA均購自杭州寶賽生物有限公司；

實施例1：基因敲除片段構(gòu)建

(i)提取Bacillus Subtilis 168DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到同源臂sleB1；

所述的PCR引物序列如下：

sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’；

sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’；

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為592bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(ii)提取Bacillus Subtilis 168 DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到同源臂cwlJ1；

所述的PCR引物序列如下：

cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’；

cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’；

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為451bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(iii)提取穿梭質(zhì)粒pPIC9k的DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到km^r片段；

所述的PCR引物序列如下:

km^r-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’；

km^r-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為1502bp,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(iv)提取穿梭質(zhì)粒pPICZαA的DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到zeo^r片段；

所述的PCR引物序列如下：

zeo^r-up:5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’；

zeo^r-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’；

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為1205bp,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(v)將步驟(i)制得的sleB1片段與步驟(iii)制得的km^r片段進(jìn)行重疊PCR，制得sleB1-km^r片段；

所述的重疊PCR的擴(kuò)增體系為：

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，5個循環(huán)；72℃終延伸10min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為2094bp,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(vi)將步驟(ii)制得的cwlJ1片段與步驟(iv)制得的zeo^r片段進(jìn)行重疊PCR，制得cwlJ1-zeo^r片段；

所述的重疊PCR的擴(kuò)增體系為：

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，5個循環(huán)；72℃終延伸10min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，長度為1656bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

實施例2：制備Bacillus Subtilis 168感受態(tài)

(i)挑取新鮮LB固體培養(yǎng)基表面的Bacillus Subtilis 168單菌落，接種于10mL GM培養(yǎng)基中，37℃、220r/min，過夜培養(yǎng)；

(ii)取1mL上述菌液轉(zhuǎn)接到100mLGM培養(yǎng)基，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.0；

(iii)將菌液轉(zhuǎn)移至100mL離心管，冰浴10min，使菌體停止生長；

(iv)冰浴后4℃、7000r/min、5min離心，收集菌體；

(v)離心后的菌體用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(ETM)洗滌2-3次；

(vi)洗滌結(jié)束后，使用1000μL電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體；

(vii)將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝100μL每管，-80℃保存，備用。

其中，GM培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5M山梨醇；

ETM：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油，余量水；

RM培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇；

實施例3：sleB1-km^r片段電轉(zhuǎn)化Bacillus Subtilis 168及陽性重組子的鑒定

(i)將sleB1-km^r片段用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切；

酶切體系(40μL)如下：

(ii)濃縮純化酶切產(chǎn)物

(1)加入1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積無水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，離心5min得沉淀；

(3)300μL體積百分比濃度為75％的乙醇溶液重懸沉淀；

(4)12000r/min，離心5min，除去乙醇，37℃風(fēng)干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重懸DNA，并置于-20℃保存。

(iii)電轉(zhuǎn)化

首先利用核酸超微量分光光度計測定sleB1-km^r片段濃度，達(dá)到100～400ng/uL濃度后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓2000V，電擊時間5ms，將得到的細(xì)胞經(jīng)液體復(fù)蘇培養(yǎng)基在37℃復(fù)蘇培養(yǎng)4h，取200μL涂布在含濃度25μmol/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)1～2天，篩選具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子；

所述液體復(fù)蘇培養(yǎng)基每升組分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，山梨醇91g，甘露醇69g，蒸餾水1000mL。

(iv)挑取上述陽性重組菌落，接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)完成后，使用上海生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，sleBF和kmR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證；

所述的PCR引物序列如下：

sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’

km^r-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’

其中，下劃線標(biāo)識的為酶切位點

所述的PCR擴(kuò)增體系為20μl：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物。

實施例4cwlJ1-zeo^r片段電轉(zhuǎn)化Bacillus Subtilis 168ΔsleB及陽性重組子的鑒定

(i)按照實施例2中的步驟制備Bacillus Subtilis 168ΔsleB感受態(tài)

(ii)將cwlJ1-zeo^r片段用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切；酶切體系(40μL)如下：

(iii)按照實施例3(ii)中的步驟濃縮純化酶切產(chǎn)物

(iv)電轉(zhuǎn)化

首先利用核酸超微量分光光度計測定cwlJ1-zeo^r片段濃度，達(dá)到100～400ng/uL濃度后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓2000V，電擊時間5ms，將得到的細(xì)胞經(jīng)液體復(fù)蘇培養(yǎng)基在37℃復(fù)蘇培養(yǎng)4h，取200μL涂布在含濃度25μmol/mL卡那霉素和50μmol/mL博來霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)1～2天，篩選具有卡那霉素和博來霉素抗性的轉(zhuǎn)化子；

所述液體復(fù)蘇培養(yǎng)基每升組分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，山梨醇91g，甘露醇69g，蒸餾水1000mL。

(v)挑取上述陽性重組菌落，分別依次接種到含卡那霉素和博來霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)完成后，使用上海生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，cwlJF和zeoR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證；

所述的PCR引物序列如下:

cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’

zeo^r-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’

其中，下劃線標(biāo)識的為酶切位點

所述的PCR擴(kuò)增體系為20μl：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物。

最終制得芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌。

實施例5：芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中的應(yīng)用：

(1)將芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌接種于活化培養(yǎng)基中于37℃下活化培養(yǎng)3～4h，然后按體積百分比為1％的比例接種于裝液量為30～50mL三角瓶，其中抗生素濃度為25mg/mL，培養(yǎng)條件為35～37℃、200～220rpm、10～14h，得到Bacillus Subtilis 168ΔsleBΔcwlJ的菌液；

活化培養(yǎng)基配方如下，單位g/L：

蛋白胨9～11、酵母浸粉5～7、氯化鈉9～11，蒸餾水定容，pH7.0～7.4；121℃滅菌20～30min；

(2)將步驟(1)中得到Bacillus Subtilis 168ΔsleBΔcwlJ的菌液按體積百分比2～4％的接種量接種于80～100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35～37℃、180～220rpm的條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h，得到發(fā)酵液；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位g/L：

葡萄糖5～10、玉米漿10～15、磷酸二氫鉀2～3、硫酸錳0.3～0.5、結(jié)晶硫酸鎂2～3、氯化鈉4～6，蒸餾水定容；115℃滅菌20～30min；

(3)芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中海藻糖合酶酶活檢測

將發(fā)酵液8000r/min離心20min，棄上清，用去離子水洗滌沉淀2次，并用去離子水懸浮，加入溶菌酶使其終濃度為2mg/mL，37℃處理30min破壞營養(yǎng)細(xì)胞，8000r/min離心10min，烘干，稱量干菌體重量，最后用去離子水懸浮得到芽孢懸浮液。取5ml發(fā)酵48h后的重組菌芽孢懸浮液與10ml pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制的終濃度30％的麥芽糖漿混勻后制備成海藻糖合酶的反應(yīng)體系。將此反應(yīng)體系置于50℃恒溫水浴震蕩搖床中反應(yīng)12h，每隔4h取樣，測定海藻糖合酶的酶活。

酶活力單位定義：在酶的最佳酶反應(yīng)條件下(25℃，pH 8.0)，將300g/L麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，每小時產(chǎn)生1μmol海藻糖所需的酶量定義一為個酶活單位(U)。

經(jīng)實驗證明原始菌的相對酶活在4h后酶活就下降到65％，10h后穩(wěn)定在50％，而本專利中構(gòu)建的芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的枯草芽孢桿菌海藻糖合酶的相對酶活在12h內(nèi)可穩(wěn)定在95％以上，與原始菌相比海藻糖合酶酶活有顯著提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 齊魯工業(yè)大學(xué)

<120> 一種芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的工程菌及其構(gòu)建方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 874

<212> DNA

<213> Bacillus Subtilis

<400> 1

atgaagtcca aaggatcgat tatggcatgt ctcatccttt tttctactga aacgatccat 60

tcaaagaggg gcaacagggg atgatgtggt cgagcttcag gcgcgtcttc aatacaacgg 120

atattataac ggaaaaattg acggggttta tggatggggg acgtactggg cagttcgaaa 180

ttttcaggat caattcgggt taaaagaggt tgacggcctt gtaggagcta aaacaaagca 240

aaccttaata tgtaaatcaa aatactatcg tgaatatgtc atggaacagc tcaataaagg 300

gaatacattc acgcattacg gaaaaattcc gctaaagtat cagacgaaac catcaaaagc 360

agcaacacaa aaggcaagac aacaagcaga agcacggcag aaacagcctg cggaaaaaac 420

aacgcagaag cctaaagcga atgcgaataa acagcaaaac aatacaccag caaaagcaag 480

aaaacaggat gcggtagcag cgaacatgcc tggtggattt tccaacaacg atatcaggct 540

gcttgctcaa gcggtttatg gcgaagcccg gggcgagccg tacgaggggc aggttgctat 600

tgcagcagtc attttaaacc gtttgaacag cccgttattt ccaaattcag tagcgggggt 660

tatttttgag ccgcttgcct tcacagcagt agccgacgga caaatttaca tgcagccgaa 720

tgaaacggca cgagaagcag tgctggatgc catcaatggc tgggacccat cagaggaagc 780

actttactac tttaatccgg atacggctac aagtccgtgg atttgggggc gtccgcagat 840

taaaagaatc ggtaaacaca ttttctgtga gtag 874

<210> 2

<211> 429

<212> DNA

<213> Bacillus Subtilis

<400> 2

atggcggtcg tgagagcaac gagtgcggat gtcgatttga tggcaaggct gctcagagcg 60

gaagcggaag gcgaaggcaa gcaggggatg ctgcttgtcg gcaacgttgg aattaatcgg 120

ctgcgggcga attgctcaga ttttaaaggc ctccgcacca tcaggcagat gatttatcag 180

ccacacgcgt ttgaggctgt gactcatgga tatttttatc aaagggcgcg agatagcgag 240

cgtgcccttg cacgccggtc gattaatggt gaaaggcgct ggcctgcaaa atttagttta 300

tggtacttca ggccgcaggg ggactgtcca gcccagtggt ataaccagcc gtttgtggcc 360

agatttaagt cacactgctt ttatcagccg acggcggaga cgtgtgaaaa tgtatataac 420

acattttag 429

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgggatcccg ggggatgatg tggtcgag 28

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

actgactcac tcaaaaataa cccccgctac t 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgggatcccg ttctgaagta atgaaatatg atg 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctatggtgtg tgggaaaagc agtggactta aatct 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgggggttat ttttgagtga gtcagtcata gggag 35

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgggatcccg ggttgaggcc gttgagca 28

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

taagtcacac tgcttttccc acacaccata gcttca 36

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgggatcccg gttggtctcc agcttgcaaa 30