本發(fā)明涉及液態(tài)發(fā)酵近紅外光譜在線檢測的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種針對青霉素發(fā)酵過程、以近紅外光譜儀在線采集發(fā)酵液光譜并以多個測量子模型進(jìn)行過程監(jiān)測的系統(tǒng)。

二、

背景技術(shù)：

青霉素是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，是青霉菌生長過程中的代謝產(chǎn)物，青霉素能夠抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成中的黏肽交聯(lián)，使細(xì)菌細(xì)胞壁合成發(fā)生障礙，從而抑制細(xì)菌的生長。青霉素從19世紀(jì)40年代開始被用于臨床，拯救了上億人的生命。1997年，世界范圍內(nèi)青霉素總產(chǎn)量達(dá)到38000噸。青霉素不僅僅可以用于口服和注射，也可以作為制備6-氨基青霉素烷等高附加值抗生素的原料。與青霉素相關(guān)的研發(fā)和生產(chǎn)具有極其重要的意義。到1999年為止，我國的青霉素產(chǎn)量已占世界40％。但由于我國的青霉素生產(chǎn)起步較晚，我國青霉素發(fā)酵的生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)效率與國際先進(jìn)水平仍有著較大的差距。如何提高發(fā)酵產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本成為國內(nèi)發(fā)酵研究人員面臨的共同課題。

青霉素的發(fā)酵過程是一種典型的有氧生化反應(yīng)過程。在發(fā)酵過程中，青霉菌在合適的培養(yǎng)基、pH值、溫度、空氣流量、攪拌等條件下進(jìn)行生長和抗菌素合成。青霉素發(fā)酵過程不僅僅具有一般非線性系統(tǒng)的時變性、大慣性、強耦合、不確定性等特點，而且發(fā)酵過程中的一些重要參數(shù)如生物質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度無法在線測量，導(dǎo)致青霉素發(fā)酵過程的自動控制比一般的非線性系統(tǒng)更為復(fù)雜和困難，先進(jìn)的控制工藝難以實施，發(fā)揮不出菌種的最大潛力，降低了青霉素的生產(chǎn)效率。實現(xiàn)發(fā)酵參數(shù)的實時監(jiān)控對提高我國青霉素發(fā)酵工藝水平起著重要的作用。

青霉素發(fā)酵過程中，重要的理化參數(shù)指標(biāo)一般包括溫度、壓力、pH、溶解氧含量、發(fā)酵液含糖量、含氮量、細(xì)胞濃度、青霉素產(chǎn)物濃度等。對于溫度、壓力、pH、溶解氧含量等信號，現(xiàn)有的傳感器可以實現(xiàn)精密快速的在線檢測。但對于發(fā)酵液含糖量、含氮量、細(xì)胞濃度、青霉素產(chǎn)物濃度等直觀反映發(fā)酵過程的重要參數(shù)指標(biāo)，目前的技術(shù)難以進(jìn)行實時在線檢測。雖然現(xiàn)在各大公司已經(jīng)研發(fā)出折射儀、濁度計等光學(xué)儀器，但由于在發(fā)酵環(huán)境中，發(fā)酵液物質(zhì)成分復(fù)雜，上述儀器難以進(jìn)行有效的檢測，精確度無法得到保證。

另一方面，青霉素發(fā)酵過程采用分批補料方式。在發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液中基質(zhì)濃度降低到一定程度時，需要對發(fā)酵液進(jìn)行多次的補料，增加發(fā)酵液中的碳源、氮源，以促進(jìn)青霉菌的營養(yǎng)生長。當(dāng)發(fā)酵過程進(jìn)入后期產(chǎn)物合成階段時，又需要對發(fā)酵液添加前體。整個發(fā)酵過程較為復(fù)雜，單一的動力學(xué)模型難以進(jìn)行準(zhǔn)確的描述，因而可以將青霉素發(fā)酵過程分為多個子模型，每個子模型對應(yīng)于不同的發(fā)酵階段。針對不同的子模型需要進(jìn)行采用相應(yīng)的檢測方式。而補料和添加前體的時機選擇也依賴于對于整個發(fā)酵過程的監(jiān)控和把握。

針對以上的特點和難點，本發(fā)明采用了近紅外光譜分析技術(shù)作為檢測手段，提出了一種全新的多模型監(jiān)控方法。近紅外光譜分析技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、操作簡單、無浪費、無污染、一次測試可以測定多種成分和指標(biāo)等優(yōu)點。近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以對復(fù)雜有機物的組成成分進(jìn)行精確快速的檢測，具有極大的應(yīng)用潛力。多模型方法可以對青霉素分批補料發(fā)酵過程進(jìn)行更為精確的描述。兩者結(jié)合，可以使得青霉素發(fā)酵過程的監(jiān)控更為全面和準(zhǔn)確，對于先進(jìn)控制工藝的實施，具有重要的意義。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確監(jiān)測青霉素發(fā)酵過程的系統(tǒng)，提供了基于近紅外光譜分析技術(shù)的多模型分析方法，實現(xiàn)對青霉素發(fā)酵過程中的發(fā)酵液生物量、含糖量、含氮量以及青霉素濃度等理化指標(biāo)進(jìn)行實時在線檢測，得到精確的數(shù)值和變化趨勢。

按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，本系統(tǒng)包括針對發(fā)酵過程的系統(tǒng)硬件設(shè)計和軟件算法設(shè)計和編寫兩個部分。硬件系統(tǒng)包括光譜采集系統(tǒng)，PLC控制器，工業(yè)控制計算機，測量狹縫沖洗裝置；軟件部分包含PLC程序控制算法，上位機內(nèi)部光譜采集、存儲程序，用以實現(xiàn)發(fā)酵工況判別的聚類分析算法、以及多模型切換算法，用于生化指標(biāo)檢測的回歸分析算法，以及監(jiān)控數(shù)據(jù)和趨勢顯示程序等。

所述的光譜采集系統(tǒng)采用工業(yè)型快速傅里葉變換近紅外光譜儀，保證在復(fù)雜工況下運行的穩(wěn)定性，所選光譜儀的波長范圍應(yīng)為700-2500nm，確保覆蓋短波近紅外和中長波近紅外光譜區(qū)，光譜的分辨率最少應(yīng)為16cm-1，以保證光譜的測量精度。光譜儀配備有光纖探頭，因為發(fā)酵液為半透明液體，光譜的采集方式為透反射方式，同時采集發(fā)酵液漫反射和透射混合光譜，得到更多的成分信息。光纖探頭配備有反射鏡，以實現(xiàn)上述功能。所述的PLC控制器具有三個功能：實現(xiàn)光譜儀的在線啟?？刂?；實現(xiàn)溫度、pH值等傳統(tǒng)信號的采集和工況反饋信號的采集；實現(xiàn)沖洗裝置的啟停控制。所述的工控機用于光譜數(shù)據(jù)的存儲，過程監(jiān)控畫面的顯示，所開發(fā)的化學(xué)計量程序的運行和監(jiān)控數(shù)據(jù)的存儲。所述的沖洗裝置噴口位于光纖探頭與反射鏡之間，吸取發(fā)酵液，對光纖探頭的光學(xué)部件進(jìn)行沖洗，防止光纖探頭與反射鏡間的狹小縫隙出現(xiàn)發(fā)酵物質(zhì)的附著和沉淀，影響發(fā)酵液光譜的采集。

所述的軟件部分分為PLC控制程序和上位機程序兩部分。PLC程序主要包括三個部分。第一部分：發(fā)酵罐中溫度、pH、溶氧、冷卻水流量和出入口溫度檢測，以上參數(shù)都為模擬量，使用模擬量采集模塊進(jìn)行采集。第二部分：葡萄糖流加閥門狀態(tài)信號、前體補充閥門狀態(tài)信號、補氮閥門狀態(tài)信號的采集，這些狀態(tài)信號都為開關(guān)量，使用數(shù)字量采集模塊采集。第三部分：光譜儀和沖洗系統(tǒng)的啟動，光譜的采集可以使用自動采集或人工控制方式。自動方式下，光譜儀處于待機狀態(tài)，PLC每隔10分鐘控制光譜儀采集一次數(shù)據(jù)；人工方式下，實現(xiàn)人為控制光譜采集。在每次采集前，PLC控制沖洗系統(tǒng)啟動，對光纖探頭進(jìn)行沖洗10s，使光路部分保持潔凈。PLC所采集各模擬量和數(shù)字量信號發(fā)送至上位機等待處理。

所述的上位機程序部分，分為四個模塊，第一模塊是光譜采集存儲程序，此程序應(yīng) 為光譜儀生產(chǎn)廠家所編寫，實現(xiàn)對光譜的快速傅里葉變換處理。第二模塊為實現(xiàn)發(fā)酵工況判別的聚類判別分析算法和多模型切換程序，此程序一方面采用化學(xué)計量學(xué)判別分析方法，對發(fā)酵過程的工況進(jìn)行初步判斷；另一方面程序?qū)LC所發(fā)送的發(fā)酵罐溫度、pH、通氣量、各閥門開關(guān)狀態(tài)加以綜合，并結(jié)合程序所記錄發(fā)酵時間，對當(dāng)前時刻發(fā)酵罐中的發(fā)酵工況進(jìn)行精確的判斷，確定子模型的切換和使用。第三模塊為化學(xué)計量學(xué)的回歸分析算法，對發(fā)酵罐中的生物量、青霉素濃度、含糖量、含氮量進(jìn)行分析，并記錄數(shù)據(jù)。第四模塊為上位機監(jiān)控程序，用來顯示測量以及計算所得的各種生化信號，并實現(xiàn)存儲、報表以及打印的功能。

本發(fā)明與目前缺乏的技術(shù)相比，優(yōu)點是：

1.本發(fā)明可以實現(xiàn)對青霉素發(fā)酵過程中傳統(tǒng)方法無法測量的指標(biāo)的在線檢測，如含糖量、含氮量、生物量和青霉素濃度等?？梢詫崿F(xiàn)多種理化指標(biāo)同時、快速檢測，采集一次光譜，得到多種數(shù)據(jù)?？梢圆糠秩〈鷤鹘y(tǒng)的檢測方法，提高青霉素發(fā)酵過程監(jiān)控的自動化水平。

2.本發(fā)明采用多模型方式，將整個發(fā)酵過程詳細(xì)的分為不同的工況，對于不同工況以不同的子模型來加以適應(yīng)，提高了檢測的精度。采用子模型自動切換策略，根據(jù)發(fā)酵過程當(dāng)前時間以及過程中的可直接測量變量，得到當(dāng)前工況的詳細(xì)信息，實現(xiàn)模型的自動切換。

3.本發(fā)明可通過以太網(wǎng)或現(xiàn)場總線與原有DCS系統(tǒng)進(jìn)行簡便綜合，無需對已有計算機控制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)雜的改造，節(jié)省投資成本。

四、附圖說明

圖1是本發(fā)明基于近紅外光譜分析技術(shù)的青霉素發(fā)酵過程監(jiān)控系統(tǒng)的硬件架構(gòu)圖

圖2是本發(fā)明中程序算法流程圖

圖3是本發(fā)明中所涉及的青霉素發(fā)酵過程生物量變化曲線圖

圖4是本發(fā)明中多模型化學(xué)計量回歸方法示意圖

圖5是本發(fā)明中光纖探頭細(xì)節(jié)圖

五、具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實例講解對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明和解釋，可使本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明。

圖1提供了本發(fā)明所述系統(tǒng)的硬件結(jié)構(gòu)圖，其工作原理為：光譜儀與工控機通過專用USB接口相連，與PLC通過RS232口相連；PLC與工控機也通過RS232口相連，實現(xiàn)相互之間的通訊。光譜儀所配備光纖探頭插入發(fā)酵罐罐體中部30cm，并安裝配備沖洗裝置。采用PT100熱電阻進(jìn)行溫度檢測，配有相應(yīng)溫度變送器，輸出信號4-20mA，共三路，分別為發(fā)酵罐溫度，冷卻水入口溫度，冷卻水出口溫度。采用工業(yè)在線pH計進(jìn)行pH信號的采集，輸出信號4-20mA。使用工業(yè)電磁流量計進(jìn)行冷卻水流量的檢測，輸出信號4-20mA。所得5個模擬量信號進(jìn)入PLC模擬量輸入模塊。葡萄糖流加閥門狀態(tài)、 前體補充閥門狀態(tài)、補氮閥門狀態(tài)等三個開關(guān)量信號，直接采用電磁閥自帶閥位反饋信號，進(jìn)入PLC數(shù)字量輸入模塊。光譜儀的啟動信號通過PLC數(shù)字量輸出模塊進(jìn)行輸出，啟停的反饋信號經(jīng)由數(shù)字量輸入模塊反饋至PLC。

系統(tǒng)的運行過程如下：發(fā)酵過程開始，PLC上電，光譜儀開機并處于待機狀態(tài)。10分鐘后，對發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液光譜進(jìn)行第一次測量，測量前進(jìn)行10s沖洗。沖洗完畢等待30s，待發(fā)酵液流動均勻時開始光譜采集。采集過程由光譜儀自動完成。光譜數(shù)據(jù)采集完成后發(fā)送至工控機，在工控機內(nèi)完成光譜預(yù)處理，發(fā)酵工況判別，回歸分析等過程，得到所需生化指標(biāo)。將所需參數(shù)存儲并予以顯示，生成狀態(tài)曲線，完成一次采集過程。后續(xù)每隔一定時間，進(jìn)行一次光譜采集與分析，時間間隔可人為設(shè)定。光譜重復(fù)采集次數(shù)也可人為根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行選取。

整個系統(tǒng)程序控制過程如圖2所示，其中PLC程序部分單獨標(biāo)出，PLC程序中包含光譜儀控制程序塊，模擬量信號采集程序塊，開關(guān)量信號采集程序塊，沖洗裝置控制程序塊四個部分。光譜儀控制程序塊與沖洗裝置控制程序塊為簡單的開關(guān)量控制。模擬量、開關(guān)量信號采集程序塊簡單使用PLC內(nèi)部寄存器實現(xiàn)。根據(jù)前文的描述，配合工控機實現(xiàn)信號的采集以及所需的開關(guān)量控制。

光譜數(shù)據(jù)的處理在工控機中完成。光譜數(shù)據(jù)采集后，首先經(jīng)過光譜預(yù)處理，然后使用判別分析算法進(jìn)行子模型歸屬判斷，與模型中預(yù)存的幾種子模型的光譜進(jìn)行對比，初步確定當(dāng)前光譜的子模型歸屬。此后，將初步確定的子模型狀態(tài)與使用各種數(shù)字量、模擬量信號所達(dá)成的工況判斷結(jié)論進(jìn)行綜合，在時間標(biāo)尺的輔助下，精確確定此時的工況。根據(jù)判定的工況，在多模型回歸算法中調(diào)用匹配的子模型。將預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入子模型，經(jīng)回歸分析計算出生物量，含糖量、含氮量和青霉素濃度四個指標(biāo)。最后，上位機軟件對所測得參數(shù)進(jìn)行顯示和歸檔。

圖3表示了青霉素發(fā)酵過程中生物量的變化曲線。由圖中曲線可以看出，青霉素發(fā)酵過程可以大致分為5個階段：延遲期、加速期、對數(shù)期、減速期、停滯期，其中停滯期后為死亡期，細(xì)胞溶解，發(fā)酵液品質(zhì)變差，因此死亡期之前，就要完成放罐。延遲期、加速期和對數(shù)期共約60小時，其后為減速期和停滯期。由于青霉素發(fā)酵使用的是分批補料發(fā)酵方式，因而在對數(shù)期中就開始進(jìn)行多次的補料以及補充氮源，每次新物質(zhì)的加入都會使模型特性發(fā)生變化。因此，針對青霉素發(fā)酵整個過程中的不同時期和分批補料的特點，本發(fā)明中采用了多模型建模方式。初步將子模型設(shè)置如下：延遲期為子模型1，加速期為子模型2，進(jìn)入對數(shù)期到補糖之前為子模型3，補糖后與補氮之前一段為子模型4，補氮之后為子模型5，減速期為子模型6，停滯期前期為子模型7，停滯期后期至放罐前為子模型8。在系統(tǒng)的初始設(shè)計階段，對應(yīng)于每個工況，建立相應(yīng)的子模型。當(dāng)系統(tǒng)投入在線檢測時，根據(jù)工況判別情況對子模型進(jìn)行調(diào)用和分析。

圖4表示子模型的組成方式。如圖所示，未知光譜首先經(jīng)預(yù)處理，然后進(jìn)行工況的初步判別，得到所屬的子模型序號，接著程序調(diào)用其所對應(yīng)的子模型，每個子模型都是由PLS偏最小二乘回歸方法進(jìn)行建模。未知光譜經(jīng)模型計算，得到最終生化指標(biāo)的值。 快速迭代偏最小二乘NIPALS回歸計算速度快，占用內(nèi)存小，是一種理想的在線分析算法。

圖5為本發(fā)明中光纖探頭的安裝細(xì)節(jié)圖。為得到發(fā)酵罐體中準(zhǔn)確的信息，光纖探頭插入罐體30cm，發(fā)出并接收近紅外光。正對光纖探頭，使用不銹鋼支架支撐一塊平面鏡，與光纖探頭的間隙為5mm，用以構(gòu)建近紅外光的透反射光路。光纖和平面鏡間狹縫的正上方，是沖洗裝置的噴嘴，沖洗裝置采用微型直流水泵實現(xiàn)，直接吸取發(fā)酵罐中發(fā)酵液，并以高速噴出，沖洗狹縫，將其中沉積的物質(zhì)清除。這種設(shè)計可以防止在狹縫處產(chǎn)生物質(zhì)堆積，影響光譜測量。

本系統(tǒng)模型的建立過程在產(chǎn)品初始設(shè)計階段完成，不需要使用者自己建立模型。以下內(nèi)容是對模型前期建立過程的進(jìn)一步說明。

系統(tǒng)中所使用判別分析模型和回歸模型都是前期離線建立的。前期建模需要對多個批次的完整發(fā)酵過程進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣，采集所需的光譜和發(fā)酵液成分濃度信息。整個青霉素發(fā)酵過程需要大約200小時，在此過程中每隔6分鐘進(jìn)行一次采樣，共采集2000個樣本。對所采集的樣本使用國標(biāo)方法檢測其中生物量、含糖量、含氮量和青霉素含量，并離線采集近紅外光譜。所采集的數(shù)據(jù)，在后續(xù)的建模階段作為模型輸入。上述發(fā)酵過程需要采取典型的發(fā)酵工藝，擴(kuò)大模型的普適性。

光譜的預(yù)處理過程也需要采用多種不同方法的配合。首先進(jìn)行歸一化處理；接著進(jìn)行多元散射校正(MSC)，消除發(fā)酵液中顆粒物和氣泡對光譜的影響；然后采用一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay卷積平滑處理，使光譜有效信息更為突出。為了不丟失有效的信息，并減少截取光譜的計算，本模型中使用全光譜進(jìn)行判別和回歸。

判別分析模型只需要光譜數(shù)據(jù)。前期離線建模時，首先將經(jīng)過預(yù)處理的2000個樣本光譜進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，劃分出樣本的譜系圖，在譜系圖的基礎(chǔ)上，對所用子模型的數(shù)量進(jìn)行小幅調(diào)整，最終確定子模型數(shù)量n。然后采用無監(jiān)督的模式識別方法，選定n個聚類中心，進(jìn)行聚類。因為青霉素發(fā)酵過程為一個連續(xù)的過程，各類別的分界不夠清晰，因而在本發(fā)明中采用模糊K均值聚類方法將2000個樣本聚成n類，這些類別基本是按照發(fā)酵時間的先后順序聚集在一起，計算每類的中心和邊緣樣本的位置。當(dāng)在線測量時，考慮計算速度，則采用最小距離判別法，分別計算當(dāng)前所采集光譜與每一類別聚類中心之間的馬氏距離，并將當(dāng)前光譜歸結(jié)為馬氏距離最小的一類。當(dāng)出現(xiàn)當(dāng)前光譜與兩類中心馬氏距離都相等的情況，則計算所測樣本和兩個類別最邊緣樣本的馬氏距離，并由此距離大小判定其歸屬。

馬氏距離的計算公式為，

工業(yè)級的發(fā)酵需要高度的可靠性，然而判別分析得到的子模型歸屬可能會出現(xiàn)誤差，需要將其結(jié)果和發(fā)酵過程參數(shù)狀態(tài)加以綜合和對比，最終得到確定的子模型歸屬。由青霉素發(fā)酵過程的經(jīng)驗可知，發(fā)酵前60小時為菌絲生長期，溫度控制為26℃，pH值控制 為6.8-7.2。后140小時為青霉素合成期，溫度控制為24.7℃。pH值控制為6.5。第10小時左右，進(jìn)行補加葡萄糖。發(fā)酵單位升至2500U.mL^-1補加前體。PLC采集每一次的加料動作和溫度、pH的變化，將這些數(shù)據(jù)與發(fā)酵時間相結(jié)合，判斷出此時此刻發(fā)酵過程所處的工況，再對應(yīng)判別分析的結(jié)果，準(zhǔn)確判定子模型的編號。

回歸模型建立在聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明中采用最為穩(wěn)健而快速的偏最小二乘回歸模型PLS。偏最小二乘回歸的基本思想是對光譜矩陣X和成分含量矩陣Y進(jìn)行分解，分別計算載荷和矩陣和得分矩陣。

其中，P為X矩陣的載荷矩陣，T為X矩陣的得分矩陣，Q為Y矩陣的載荷矩陣，U為Y矩陣的得分矩陣。

然后對U和T矩陣進(jìn)行最小二乘回歸。

U＝TB (3)

則乘積PBQ即為光譜對應(yīng)濃度的回歸系數(shù)。

對于每個子模型，需要針對三種不同成分求取三個回歸系數(shù)。

實際的在線監(jiān)測過程中，只需輸入當(dāng)前時刻的光譜數(shù)據(jù)值，就可得出此時所需測量的生物量、青霉素濃度等信息。

Y_未知1＝X_未知PBQ₁ (4)

如上所述，完整的基于近紅外光譜分析技術(shù)的多模型青霉素發(fā)酵過程監(jiān)控系統(tǒng)是一個有機的整體，通過合理的硬件搭建和軟件編寫，實現(xiàn)對傳統(tǒng)檢測方法中所不能獲得信號的快速、精確檢測。另外值得一提的是，本系統(tǒng)可以和發(fā)酵生產(chǎn)線中原有的DCS自動控制系統(tǒng)兼容并配合，或者作為原DCS系統(tǒng)的一部分，實現(xiàn)系統(tǒng)的完美集成，有效提高發(fā)酵過程的自動化水平，對從事青霉素發(fā)酵工程的技術(shù)人員帶來極大的幫助。