重組病毒的穩(wěn)定制劑的制作方法
【專利說明】重組病毒的穩(wěn)定制劑 本申請為分案申請，原申請的申請日為2006年11月15日，申請?zhí)枮?00680051299. 7， 發(fā)明名稱為"重組病毒的穩(wěn)定制劑"。 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于例如疫苗或其它藥物或研宄用途的病毒制品，使這種制品穩(wěn)定的 方法和生產(chǎn)這些制品的方法，以及它們的用途，例如作為疫苗或病毒載體。 發(fā)明背景
[0002] 已經(jīng)知道生產(chǎn)用于疫苗和其它目的的活病毒制品的多種方法。而且還知道為了保 持活性而用于實驗室或疫苗用途的冷凍、凍干或其它保存活病毒制品的制劑和方法。
[0003] 通常，重組病毒以冷凍干燥小糖丸（freeze-dried pellet)保存，其中含有鹿糖、 酪蛋白和/或膠原水解產(chǎn)物的磷酸緩沖生理鹽水（PBS)。然后這些小糖丸在藥學(xué)上可接受 的溶液（例如0.4-0. 9% NaCl)中再水化。然而，卻存在與這種制劑有關(guān)的重大缺點(diǎn)并且 為本領(lǐng)域所知。在這些缺點(diǎn)中包括使用了動物源性物質(zhì)、不完全確定的成分、復(fù)雜的制備方 法、高成本和不能保持某些所需的病毒特性。
[0004] 本領(lǐng)域需要適于制備穩(wěn)定的病毒制品以用于免疫制劑和疫苗的制劑。需要提供保 持病毒所需特性（包括病毒存活力和感染力）的穩(wěn)定制劑（stabilizing formulation)，即 免疫制劑或疫苗。另外，出于對有關(guān)動物傳播疾病的考慮，本領(lǐng)域需要不是由動物類型產(chǎn)品 得到的穩(wěn)定制劑，還需要提供滴度高、體積小、適于快速冷凍干燥處理的制劑。本申請?zhí)峁?了這樣的制劑及其使用方法。 附圖簡沭
[0005] 圖1.在不同溫度下，對液體制劑與本發(fā)明一個實施方案的新的凍干制劑F12 (FD) 進(jìn)行的重組病毒制品穩(wěn)定性比較。在規(guī)定時間測定每種病毒制劑的感染滴度（CCID5tl)。 發(fā)明概沭
[0006] 本發(fā)明提供用于保存病毒（例如病毒載體）并且具有各種用途的穩(wěn)定制劑，包括 免疫制劑和疫苗。在一個實施方案中，本發(fā)明制劑包含糖、防腐劑、分散劑、熱穩(wěn)定劑、緩沖 劑和最多3種不同類型的氨基酸（即1、2或3種不同類型的氨基酸）。在一個實施方案中， 本發(fā)明制劑包含3種不同類型的氨基酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明制劑包含2種不同類 型的氨基酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明制劑僅包含一種類型的氨基酸。優(yōu)選的氨基酸 是精氨酸、丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸。另外優(yōu)選的氨基酸是精氨酸、絲氨酸或甘氨酸。將病 毒加到穩(wěn)定制劑中，在所需時間內(nèi)保持可測量的具體特性（例如存活力、感染力）。優(yōu)選的 制劑在病毒存在的特定條件下保持某些所需的可測量特性，例如有利的外觀和溶解時間， 下面將予以描述。本發(fā)明的其它實施方案從所附說明書、實施例和權(quán)利要求書來講是顯而 易見的。 發(fā)明詳沭
[0007] 通常，重組病毒（例如禽痘病毒ALVAC)作為冷凍干燥小糖丸保存，其中含有蔗糖、 酪蛋白和/或膠原水解產(chǎn)物的磷酸緩沖生理鹽水（PBS)。然后這些小糖丸在藥學(xué)上可接受 的溶液（例如0.4-0. 9% NaCl)中再水化。然而，卻存在與這種制劑有關(guān)的重大缺點(diǎn)，而且 是本領(lǐng)域已知的難以克服的困難。因此，本發(fā)明所提供的是如下所述的新的穩(wěn)定制劑。
[0008] 本發(fā)明提供用于穩(wěn)定地貯藏和保存病毒的制劑，包括用作表達(dá)載體的重組病毒、 免疫制劑和/或疫苗。所述制劑可用于制備、保存和使用這些病毒的方法中，與現(xiàn)有的制劑 相比，制備、保存和使用起來較為容易，成本較低而且病毒活性沒有顯著降低。這些制劑可 稱為"穩(wěn)定制劑"，通常包括糖（例如蔗糖或山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖）、防腐劑 (可以是糖、氨基酸、其它組分）、分散劑（例如聚乙烯吡咯烷酮40、葡聚糖、PEG)、熱穩(wěn)定劑 (例如尿素）、緩沖劑（例如三（羥甲基）氨基甲烷（Tris)、磷酸緩沖鹽溶液（PBS)、磷酸鈉、 乙酸鹽、硼酸鹽、H印es、MOPS、PEG)和一種或多種氨基酸。
[0009] 本發(fā)明制劑中優(yōu)選包括不超過1、2、3或4種氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的 是，在描述組成時提及的氨基酸不包括在制備后加到制劑中的病毒、佐劑或其它組分內(nèi)的 氨基酸或者從病毒、佐劑或其它組分內(nèi)中釋放出的氨基酸。因此，作為制劑組成部分的所述 氨基酸在向制劑中加入病毒或佐劑之前就已存在。
[0010] 在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明制劑中包括單種氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，本 發(fā)明制劑包括精氨酸、絲氨酸或甘氨酸中的至少一種。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明制劑 包含單種氨基酸，該氨基酸是精氨酸、絲氨酸或甘氨酸。優(yōu)選本發(fā)明制劑中氨基酸的含量約 為100mg/ml以下。更優(yōu)選本發(fā)明制劑中氨基酸的含量為約9〇-95mg/ml、約85-90mg/ml、約 80-85mg/ml或約80mg/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到各種大量的氨基酸。
[0011] 穩(wěn)定制劑優(yōu)選作為液體、冷凍干燥制品（freeze-dried preparation)、凍干制品 (lyophilized preparation)或其它形式而用于保存病毒。對于液體，優(yōu)選液體制劑是藥物 制劑。凍冷干燥制品或凍干制品通常使用液體（例如藥學(xué)上可接受的載體）復(fù)原而被轉(zhuǎn)化 為液體形式。藥學(xué)上可接受的載體可以是例如含有緩沖劑和鹽的液體載體（即PBS)。合適 的緩沖劑和鹽的實例以及其它類型的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域眾所周知的。
[0012] 在評價用于保存病毒制品具體制劑的適宜性時，本發(fā)明制劑的視覺外觀已被確 定為適宜性的重要指標(biāo)。例如，最合適的制劑呈光滑的白色藥層或"塊"，在凍干并保存在 約-20°c下約52周后不會從小瓶的邊緣皺縮。較不合適的制劑呈"熔融"、"起泡"或其它畸 形形狀，并且在貯存后從小瓶邊緣皺縮。如以下實驗結(jié)果所示，光滑的白色藥層與較快的溶 解時間有關(guān)，這是本文所述制劑的另一個所需特性。光滑的白色層塊與用于穩(wěn)定地保存病 毒的制劑緊密相關(guān)。
[0013] 如上所述，溶解時間是合適制劑的非常重要的特性。優(yōu)選在病毒制品凍干后，在約 5°C下保存約52周后，本發(fā)明制劑在藥學(xué)上可接受的載體（例如PBS)中的溶解時間約為 20-25秒鐘、約15-20秒鐘或優(yōu)選約15秒鐘以內(nèi)。這就為技術(shù)人員提供了現(xiàn)場可快速使用 的制劑。
[0014] 使病毒在穩(wěn)定制劑中維持不變的溫度是適于保存一段時間后（例如長達(dá)約52周） 維持病毒/制劑所需狀態(tài)（例如通過觀察外觀、溶解時間、滴度或制品其它特性而確定）的 任何溫度。制劑通常并最便于保持在約10°c以下（例如約5°C)的溫度下。在某些情況下， 本發(fā)明制劑應(yīng)保持在-20 °C下。
[0015] 對于制劑復(fù)原后合適的pH是在保存一段時間（例如長達(dá)約52周）后維持病毒所 需狀態(tài)（例如存活力、感染滴度、溶解時間）的任何pH。例如，液體制劑理想的pH約為6-9、 6-8. 5、6· 5-8. 5、7-8. 5、7· 5-8. 5、6-8、6· 5-8、7-8、7· 5-8 或 7-7. 5。優(yōu)選制劑的 pH 約為 7· 5。 可將液體制劑放置（例如保持或保存）在任何合適的容器中。通常，容器包括玻璃或塑料 小瓶或其它貯存容器的形式，或基本上由玻璃或塑料小瓶或其它貯存容器的形式組成，或 由玻璃或塑料小瓶或其它貯存容器的形式組成。
[0016] 實施本發(fā)明時可使用許多不同的病毒。合適的病毒包括例如腺病毒、蟲媒病 毒、星狀病毒、噬菌體、腸道病毒、胃腸炎病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰瘆病毒（例如EB病毒（EBV)、巨細(xì)胞病毒（CMV)和 單純皰瘆病毒（HSV))、流感病毒、諾沃克病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、脊椎動物痘病毒科 (Chordopoxviridae)(例如正痘病毒屬、痘苗病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、 ALVAC、ALVAC(2)、家禽痘病毒（fowlpox))、彈狀病毒、呼腸孤病毒、鼻病毒、輪狀病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒科（Baculoviridae)、杯狀病毒科（Caliciviridae)、花椰菜花葉病 毒科（Caulimoviridae)、冠狀病毒科（Coronaviridae)、絲狀病毒科（Filoviridae)、黃 病毒科（Flaviviridae)、肝 DNA 病毒科（Hepadnaviridae)、羅達(dá)病毒科（Nodaviridae)、 正黏病毒科（Orthomyxoviridae)、副黏病毒科（Paramyxoviridae)、乳頭多瘤空泡病毒科 (Papovaviridae)、細(xì)小病毒科（Parvoviridae)、藻類 DNA 病毒科（Phycodnaviridae)、小 核糖核酸病毒科（Picomaviridae)和披膜病毒科（Togaviridae)以及起源于、基于或基本 類似于上述病毒或其它合適病毒的經(jīng)修飾的病毒。用于實施本發(fā)明優(yōu)選的病毒是痘病毒， 特別是ALVAC。本領(lǐng)域已知的其它合適的病毒參見例如Fields等，Virology (第34版， Lippincott Williams&Wilkins(2001)) 〇
[0017] 在某些實施方案中，重組病毒在其基因組內(nèi)含有編碼抗原或免疫原的核酸序列， 因此該病毒可用于免疫制劑或疫苗。術(shù)語"重組病毒，，是指不是病毒基因組天然部分的異 源基因插入到病毒基因組的任何病毒。免疫制劑是這樣一種制劑，即在給予宿主時，產(chǎn)生針 對由病毒編碼的抗原或免疫原或者對由病毒編碼的抗原或免疫原起反應(yīng)的免疫應(yīng)答。這種 免疫應(yīng)答對宿主可能有或者沒有保護(hù)作用，或者可能或不能為宿主提供免疫力。疫苗是引 起宿主產(chǎn)生針對由宿主編碼的抗原或免疫原或者對由宿主編碼的抗原或免疫原起反應(yīng)的 保護(hù)性免疫應(yīng)答的制劑?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員可采用的多種技術(shù)中的任一種來測定免疫應(yīng) 答，這些技術(shù)包括但不限于ELISA、BIACORE、DOT-BLOT、免疫擴(kuò)散技術(shù)。
[0018] 在某些情況下，重組病毒可編碼一種或多種腫瘤抗原（"TA")。腫瘤抗原包括腫瘤 相關(guān)抗原（TAA)和腫瘤特異性抗原（TSA)，其中癌細(xì)胞是抗原的來源。腫瘤相關(guān)抗原是在腫 瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的量比正常細(xì)胞中所觀察的量高的抗原，或者是胎兒發(fā)育期間在正常細(xì) 胞中表達(dá)的抗原。TSA是腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的抗原，不在正常細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤抗原還包括TAA 或TSA、其抗原片段和保持其抗原性的修飾形式。腫瘤抗原通常根據(jù)腫瘤抗原的表達(dá)模式、 功能或遺傳來源分為以下五類：腫瘤/睪丸（CT)抗原（例如MAGE、NY-ES0-1);黑素細(xì)胞 分化抗原（例如Melan A/MART-1、酪氨酸酶，gplOO);突變抗原（例如MUM-l、p53、CDK-4); 過量表達(dá)的"自身"抗原（例如HER-2/neu、p53);和病毒抗原（例如HPV、EBV)。為了實施 本發(fā)明，合適的腫瘤抗原是在給予腫瘤抗原的宿主中誘導(dǎo)或提高抗腫瘤免疫應(yīng)答的任何腫 瘤抗原。合適的腫瘤抗原包括例如gplOO (Cox等，Science，264 :716-719 (1994))、MART_1/ Melan A (Kawakami 等，J. Exp. Med.，180 :347-352(1994))、gp75