一種h5亞型禽流感dna疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及DNA疫苗技術領域，具體地，涉及一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法，所述H5亞型禽流感DNA疫苗由H5亞型禽流感病毒HA基因和真核表達載體組成。所述的H5亞型禽流感DNA疫苗能夠預防H5亞型禽流感，減少感染，對養(yǎng)殖業(yè)與人類健康具有十分重要的意義。
【專利說明】
一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法
技術領域
[00011本發(fā)明涉及DNA疫苗技術領域，具體地，涉及一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 目前，制約家禽養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的關鍵疫病因素依然是禽流感疫情的預防與控 制。從2003年到目前為止，H5N1高致病性禽流感病毒影響了三個大洲總共63個國家或地區(qū)， 各國均采用了多種有利方法旨在遏制和根除禽流感的爆發(fā)與流行(1!10,2015)。2010年在羅 馬尼亞和保加利亞分離到了位于2.3.2分支的H5N1亞型高致病性禽流感病毒，這是自2005 年以來該分支的高致病性禽流感病毒首次出現(xiàn)在歐洲(Dundon et al.，2012)。2012年，全 球共有14個國家或地區(qū)包括孟加拉國、印度、不丹、尼泊爾、越南、印尼、柬埔寨、緬甸、日本、 中國、中國臺灣、中國香港、以色列和埃及等向WHO報告了H5N1高致病性禽流感疫情，而在中 國臺灣、南非、斯里蘭卡、愛爾蘭和荷蘭等5個國家或地區(qū)發(fā)生H5N2低致病性禽流感疫情 (Ramey et al.，2016)。2013年下半年出現(xiàn)位于2.3.4分支的!15_亞型毒株目前已在亞洲和 歐洲多國的多種鳥類（雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉和野生水禽等）中發(fā)生感染并形成流行情況 (Lee et al. ,2014)，其中包括中國、日本、韓國、蒙古、加拿大、俄羅斯西伯利亞、美國、英 國、荷蘭、德國、匈亞利等(Conraths et &1.，2016)。2014年以來，全世界共有17個國家暴發(fā) H5N1高致病性禽流感疫情或在野禽中檢測到病毒，亞洲和非洲是疫情重災區(qū)，而亞洲疫情 則呈現(xiàn)區(qū)域性流行(Arafa et al.，2016;Berhane et al.，2016)。世界各地出現(xiàn)候鳥感染 的報道也在不斷增加，其中包括天鵝、大雁、野鴨等，而候鳥感染率的升高、感染病毒亞型的 增多、分布地域的擴大都暗示著禽流感病毒流行與變異會加劇(Wawegama et al.，2016; 朱迪國等，2015)。
[0003] 1996廣東省首次報道了 H5N1亞型高致病性禽流感病毒的暴發(fā)式流行(Shortridge et al.，1998)。此前，從中國東南沿海地區(qū)的家鴨和家鵝體內只分離出了低致病性H5亞型 禽流感病毒，但是沒有在雞體內分離出病毒。1997年香港雞群中暴發(fā)了 H5N1亞型HPAI疫情， 并引起了 18人的感染，最終造成6人死亡，這是全球首次出現(xiàn)H5N1亞型AIV直接感染人類并 致死的案例(De Jong et &1.，1997)。2004年初，H5亞型HPAI疫情在我國多個地區(qū)流行，并 持續(xù)數(shù)月，對我國畜牧業(yè)造成了沉重的打擊(Fang et &1.，2008)。2012年，中國臺灣與香港 相繼報道了H5亞型禽流感疫情，而2013年2月在我國暴發(fā)的H7N9亞型禽流感更是造成了巨 大的損失，引起了世界各國的廣泛重視(Wang et al. ,2013)。在2013-2014年，我國因 H5N1 疫情撲殺的家禽超過36萬只，造成這大量撲殺的主要原因是多亞型病毒同時感染、抗原匹 配度差、免疫抗體水平參差不齊，從而出現(xiàn)自然感染和排毒現(xiàn)象。2015年，我國多地出現(xiàn)了 H5N2和H5N8亞型禽流感的感染(Kapczynski et al.，2016;Ramey et al.，2016)。
[0004] 當前我國禽流感流行現(xiàn)狀為同時存在多種不同亞壓型毒株的感染，其中H5亞型高 致病性禽流感主要有2.3.2、2.3.4和7.2分支的病毒混合感染，包括H5N1、H5N2、H5N5、H5N8 和H5N6等多種亞型病毒（Gu et al.，2012;Gu et al.，2011;Song et al.，2015;Wu et al.，2014)。而且出現(xiàn)感染情況的范圍在逐漸擴大，幾乎已經遍布全國各地。而從近期感染 情況可以看出，感染多呈散發(fā)，但也有在個別地區(qū)呈流行趨勢。流行毒株在不斷的變異，包 括出現(xiàn)不同分支的新毒株及其他亞型毒株，例如H5N3亞型感染鴨的報道（Deriabin et al.,2007；Nicholson et al·，2001;Stephenson et al.,2005；Stephenson et al., 2003)。耶亞型高致病性禽流感疫情爆發(fā)的區(qū)域相對集中，目前主要集中在中東、東南亞和 南亞，而且疫情的爆發(fā)呈明顯的季節(jié)性，多為寒冷的月份(朱迪國等，2015)。H5亞型禽流感 在我國長期大范圍的存在，呈現(xiàn)反復感染與不斷變異，對多地區(qū)造成不同程度的經濟損失， 且感染禽類的發(fā)病情況日趨復雜化，已成為危害養(yǎng)殖業(yè)與人類健康事業(yè)的重要破壞性因 素。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方 法，所述H5亞型禽流感DNA疫苗能夠預防H5亞型禽流感，能夠解決上述技術問題。
[0006] 本發(fā)明的技術方案如下：一種H5亞型禽流感DNA疫苗，該疫苗由H5亞型禽流感病毒 HA基因和真核表達載體組成。
[0007] 所述 HA 基因為 H5 亞型禽流感病毒 A/chicken/Guangdong/E85/2011 (H5N1)的 HA 基 因，其序列如HAseq所示;或HA基因的密碼子優(yōu)化型optiHA基因，其序列如optiHAseq所示。
[0008] 所述真核表達載體為限制性內切酶SacI或EcoRI和Nhel同時酶切質粒pCAGGK(卡 納抗性)得到的載體片段。
[0009] 所述H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，包括如下步驟
[0010] S1.獲取野生H5亞型禽流感病毒的HA基因，其序列如HAseq所示；
[0011] S2.獲取將H5亞型禽流感病毒HA基因根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化的optiHA基因， 其序列如optiHAseq所示；
[0012] S3.利用內切酶處理S1和S2獲取的目的基因 HA和optiHA與真核表達載體；
[0013] S4.回收目的片段與載體片段，連接轉化篩選陽性菌落后，提取質粒并進行酶切鑒 定。
[0014] 步驟S1 中，擴增H5亞型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/E85/2011 (H5N1)的HA基 因的引物的5 '端添加的酶切位點為EcoRI，3 '端添加的酶切位點為NheI，引物序列如下：
[0015] E85-F CCGGAATTCATGGAGAAAATAATGCTTC
[0016] E85-R CTAGCTAGCTTCAAATGCAAATTCTG
[0017]所述H5亞型禽流感DNA疫苗為主要活性成分制備的預防或免疫治療H5亞型禽流感 的疫苗和藥物。
[0018] 所述5亞型禽流感DNA疫苗在制備或免疫治療H5亞型禽流感的疫苗和藥物中的用 途。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述的H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法，能夠預 防H5亞型禽流感，減少感染，對養(yǎng)殖業(yè)與人類健康具有十分重要的意義。
【附圖說明】：
[0020] 圖1為本發(fā)明E85病毒HA基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果，該圖中M:DL2000; 1、2: E85病毒HA基因。
[0021]圖2為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后的密碼子適用指數(shù)CAI對比結 果。
[0022]圖3為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后GC含量對比。
[0023]圖4為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后最優(yōu)密碼子使用頻率F0P對比 結果。
[0024] 圖 5 為本發(fā)明質粒 pUCoptiHA 酶切分析，其中，M:DL5000;l:pUCoptiHA/SacI/NheI; 2：pUCoptiHA/NheI；3：pUCoptiHA/SacI〇
[0025] 圖6為本發(fā)明質粒pCAGGKHA酶切分析，其中Μ: DL5000; 1: pCAGGK;
[0026] 2:pCAGGKHA；3:pCAGGKHA/EcoRI；4：pCAGGKHA/NheI；5：
[0027] pCAGGKHA/EcoRI/Nhel。
[0028] 圖 7 為本發(fā)明質粒 pCAGGKopt iHA 酶切分析 Μ: DL5000; 1: pCAGGK; 2: pCAGGKopt iHA; 3:pCAGGKoptiHA/SacI；4:pCAGGKoptiHA/NheI；
[0029] 5:pCAGGKoptiHA/SacI/NheI〇
[0030] 圖8為本發(fā)明質粒轉染293T細胞間接免疫熒光的結果(200X)了，其中A.未轉染的 293T細胞;B.轉染pCAGGK 的 293T細胞;C.轉染pCAGGKHA 的 293T細胞;D.轉染pCAGGKoptiHA 的293T細胞。
[0031] 圖9為本發(fā)明H5亞型DNA疫苗質粒在293T細胞中蛋白表達產物Western-blot結果 M:蛋白Marker; 1.未轉染質粒的293T細胞；2 .轉染質粒pCAGGK的293T細胞；3 .轉染質粒 pCAGGKHA的293T細胞;4.轉染質粒pCAGGKoptiHA的293T細胞;5. E85病毒病毒尿囊液的陽性 對照。
[0032]圖10為本發(fā)明H5亞型禽流感DNA疫苗免疫后HI抗體的變化。
【具體實施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的發(fā)明目的，技術方案及技術效果更加清楚明白，下面結合具體實 施方式對本發(fā)明做進一步的說明。應理解，此處所描述的具體實施例及相關附圖，僅用于解 釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034]材料與方法 [0035] 1 材料
[0036] 1.1病毒、H5陽性血清和抗原
[0037] 本實驗中使用的H5亞型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/E85/2011(H5Nl)(以下 簡稱E85)和由其制備的陽性血清由華南農業(yè)大學人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程 實驗室保存。
[0038] 1.2載體質粒
[0039]真核表達質粒pCAGGK(卡納抗性)和基因工程菌DH5a均由華南農業(yè)大學人獸共患 病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室保存提供。
[0040] 1.3SPF雞
[0041 ] 3周齡SPF(Specific Pathogen Free)白來航雞和9-10日齡SPF雞胚購自廣東省新 興大華農禽蛋有限公司;本實驗中涉及活病毒的試驗均在華南農業(yè)大學動物生物安全三級 (Animal biosafety level 3，ABSL_3)實驗室中進行。
[0042] 1.4主要試劑
[0043] Trizol LS Reagent、Pfx Taq DNA聚合酶、無血清培養(yǎng)基Opti_MEM、Gibco 胎牛血 清、轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)反 轉錄酶購自Promega公司；RNA酶抑制劑（Rib nuclease Inhibitor，RNAsin)、dNTP、ExTaq 酶、T載體(pMD19_T vector)購自TaKaRa公司；核酸染料(EB替代物)購自Bioteke公司；兔抗 雞二抗抗體(F8888)購自SIGMA-AL0RICH公司；T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自New England Bliolabs公司；通用型DNA純化回收試劑盒、普通質粒抽提試劑盒均購自天根生化科技有限 公司；去內毒素質粒大量抽提試劑盒購自德國麗公司；DNA marker購自東盛生物公司；蛋白 marker和限制性內切酶購自Thermo公司；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑和SDS-PAGE蛋白 凝膠試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。
[0044] 一、H5HA基因的獲取及優(yōu)化
[0045] 將含有E85病毒的尿囊液12000r/m離心5min，取上清液250yL到DEPC處理過的 1.5mL的Eppendorf管中，加入750yL預冷的Trizol LS Reagent，劇烈振蕩后室溫放置5min， 加250yL氯仿靜置l_2min后充分混合，于4°C離心機12000r/m離心15min。取600yL上層水相 移至另一新的DEPC處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管中，加入600yL預冷的異丙醇，顛倒混 勻，-20°C放置30min，4°C12000r/m離心15min，棄去上清液，加入1000yL預冷的75%乙醇，緩 慢顛倒搖勾，4°C，12000r/m離心10min。棄去上清液，在超凈工作臺內風干后，加入41yL DEPC處理水溶解RNA，-40 °C保存或直接用于反轉錄。
[0046] 參照Promega公司的M-MLV反轉錄酶說明書進行操作。反轉錄體系中包括以下兩部 分：
[0047] 病毒 RNA(DEPC 水溶）41yL
[0048] 12bp(20pmol/yL) 4yL
[0049] 在41yL病毒RNA(DEPC水溶）中加入4yLl 2bp，置于70 °C水浴鍋中10min，取出后置于 冰上2min。再加入以下試劑：
[0050] 5X M-MLV Buffer 16μ1. dNTPs (2.5minol/pL) 16'uL
[0051 ] M-MLV (5?/μΙ.) 2\ L Rnasiii (401Ι/μ￡) lpL
[0052] 加入以上組分混勻后，置于42°C水浴lh，所得到的E85病毒cDNA置于-20°C保存或 直接進行PCR擴增。
[0053] 應用軟件〇lig〇7設計H9HA基因的擴增引物為E85-F、E85-R，如表1所示，同時加入 酶切位點，以E85病毒cDNA做模版，利用pfx高保真酶進行PCR擴增HA基因。
[0054] 表1E85病毒HA基因 PCR引物
[0055]
[0056] 反應體系和條件如下： l〇xpfx buffer 5 pL 10 χ pfx enhancer Buffer 5 μΙ dNTP 4 [iL cDNA 模板 3 pL 50mg MgS04 1 |iL
[0057] E85-F 0.5 μL^ E85-R 0.5 μL Pfx DNA Polymerase 0.:5. pL ddH20 30.5 pL Totle 50 pL
[0058] 反應條件：94°(：預變性21^11;94°(：158,581€3〇8,681€21^1130個循環(huán) ；最后68°(：延 伸lOmin。
[0059] 將PCR擴增產物在1%的瓊脂凝膠中電泳。其電泳結果見圖1，電泳顯示得到了一條 位于2000bp下方的條帶，與預期大小一致。
[0060] 切下目的片段的DNA條帶后，按照PCR產物瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行：平 衡柱子，向吸附柱中加入500yL的平衡液BL，12000r/m離心lmin。切下含有目的片段的凝膠， 稱重，按照l〇〇yL/mg凝膠的比例加入PC緩沖液，55°C水浴融化凝膠。將融化后的凝膠液轉入 離心柱中，12000r/m離心lmin，棄掉收集管中的廢液。加入600yL漂洗液PW，12000r/m離心 lmin，棄掉收集管中的廢液，再加入700yL漂洗液PW，12000r/m離心lmin，棄掉收集管中的廢 液，12000r/m離心2min，盡量出去漂洗液。將吸附柱放入新的離心管中，加30yL滅菌去離子 水，12000r/m離心2min。取2yL回收產物進行瓊脂糖凝膠電泳或者直接檢測濃度，檢測回收 效果，將部分產物送上海英濰捷基生物有限公司測序。測序結果如表2中HAseq。
[0061 ] 二、H5HA基因的密碼子優(yōu)化
[0062]根據(jù)測序獲得的E85病毒HA基因序列及雞的基因組序列，利用密碼子優(yōu)化軟件 OPTHWIZ設計合成雞的密碼子偏嗜性的optiHA基因，其序列如表2中optiHAseq。將optiHA 基因片段以合適的酶切位點（5'SacI和3'NheI)連接到載體pUC57-Amp以便于獲得大量克 隆，以上操作均有蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
[0063]將E85病毒HA基因的開放閱讀框根據(jù)雞密碼子偏嗜性優(yōu)化后，密碼子適用指數(shù) (CAI)從原來的0.78變?yōu)楝F(xiàn)在的0.93，如圖2，最基因中GC含量由原來優(yōu)化前的40 %變?yōu)閮?yōu) 化后的54 %，如圖3，最優(yōu)密碼子使用頻率(F0P)由44 %上升到80 %，如圖4，優(yōu)化前后序列對 比如下表2,表2中下劃線表示優(yōu)化后的差異序列。
[0064] 表2優(yōu)化前后HA與optiHA核苷酸對比
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 二、H5亞型DNA疫苗質粒的構建及抽提
[0069] 抽取質粒pUCoptiHA，利用SacI和Nhel限制性內切酶對質粒pUCoptiHA進行雙酶 切。酶切反應體系如下： l〇x buffer 4 gL DNA 模板 2Q pL Sad 2.5 μL
[0070] Nhei 2.5 pL 去離子水 21 μL Totle 50 μL
[0071] 將酶切產物進行瓊脂凝膠電泳，電泳顯示獲得了 1700bp左右的條帶，如圖5所示。 將切下條帶按照天根通用型DNA純化回收試劑盒說明書進行膠回收，送測序。序列比對與 op t i HA-致，無位點突變，說明密碼子優(yōu)化基因 op t i HA合成正確。
[0072] 利用SacI或EcoRI和Nhei限制性內切酶對質粒pCAGGK進行進行單酶切和雙酶切， 利用瓊脂凝膠電泳檢測酶切情況，回收雙酶切產物(線性PCAGGK)，按照天根通用型DNA純化 回收試劑盒說明書進行。
[0073]分別將回收的E85的HA基因及optiHA基因與表達質粒pCAGGK連接，連接體系如下： T4 DNA Ligase buffer ΙμΕ T4DNALigase (5U,'VL)
[0074] pCAGGIC (50ng/LiL) 2pL 目的基因片段
[0075] 將上述混合物混勻，16°C連接過夜。將獲得的連接產物10yL加到50uL感受態(tài)細胞 DH5a中，輕輕混勻，冰浴30min;42°C熱沖擊lmin后，迅速冰浴3~5min;加800yL不含抗菌素 的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37°C，180r/m搖動50min; 3000r/m離心5min;棄去300yL上清， 將剩下的培養(yǎng)基吹吸混勻;取上述菌液涂布于含卡納青霉素(終濃度為1 〇〇yg/mL)的LB固體 選擇培養(yǎng)基平板上，待菌液完全吸收后放入溫箱，37°C倒置培養(yǎng)12-16h。
[0076] 從每個培養(yǎng)基平板中隨即挑取8個單菌落接種于10ml含100yg/mL卡納青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩（200r/m)培養(yǎng)12h-16h后，用天根質粒小提試劑盒抽提質粒，抽提 質粒方法參考說明書。將質粒抽提產物進行瓊脂凝膠電泳，根據(jù)電泳結果挑選出3個疑似陽 性克隆，對疑似陽性克隆的抽提產物進行雙酶切鑒定。
[0077] 將質粒pCAGGKHA進行酶切處理(EcoRI和Nhel)，得到了一條位于1500bp和2000bp 之間的片段條帶，如圖6,回收該片段后送測序，同時送質粒pCAGGKHA測序，測序結果與E85 病毒HA基因成功比對，無突變，說明質粒pCAGGKHA構建成功。
[0078] 質粒pCAGGKoptiHA用SacI和Nhei雙酶切處理，得到了一條位于1500bp和2000bp之 間的片段條帶，如圖7，測序結果與optiHA序列一直，無突變位點，表明質粒pCAGGKoptiHA構 建正確。
[0079] 將獲得的陽性克隆菌按1:1000擴大培養(yǎng)，使用去內毒素質粒大提試劑盒(德國MN 公司）抽提質粒，步驟如下:將l〇〇mL菌液，用50mL離心管分多次以5000-10000r/m離心，每次 10min，每次棄菌液上清;加8mL的RES-EF于上述離心管中，振蕩，重懸菌體；向上述離心管中 加8mL的LYS-EF，顛倒8-10次，室溫放置5min;加8mL的NEU-EF于上述混合液中，上下顛倒ΙΟ-? 5次 ，冰上放置5min; 潤洗柱子， 從柱子邊緣加 15mL 的 EQU-EF ， 待柱中的 液體過濾完后 ，將上 述混合液加入柱中；待柱中液體過濾完后，從柱子邊緣加5mL的FIL-EF;待柱中液體過濾完 后，棄濾膜，加35mL的ENDO-EF到柱中；加15mL的WASH-EF于柱中，待柱中液體過濾完后，將柱 子放在15mL離心管上，加5mL的ELU-EF，待柱中液體全部過濾到離心管中；向離心管中加 3.5mL的常溫異丙醇，搖勻后靜置2min。12000r/m，4°C離心30min;棄上清液，加入2mL 70% 乙醇，12000r/m，離心5min;棄上清液，盡量吸干離心管底部液體，開蓋放置5min;向管中加 200yL H2〇-EF，使白色沉淀全部溶解;用分光光度儀測提取質粒的濃度后保存。
[0080] 三、H5亞型疫苗質粒的體外表檢測達
[0081 ]在轉染前20-30h，將293T細胞均勻鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達到90 %左 右進行轉染；每孔用500yL Opti-MEM稀釋4yg質粒，吹打混勾；向質粒稀釋液中加入10yL Lipofectamine 2000，并輕輕震蕩混勻；室溫下孵育15-20min;將6孔細胞板中的培養(yǎng)液吸 出并使用Opti-ΜΕΜ或PBS洗2-3次，并加400yL Opti-MEM培養(yǎng)液;將靜置了30min的混合液加 入到6孔板中，輕輕晃動細胞板使均勻分布;將細胞板置于C〇2濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48h，檢測表達情況。
[0082]間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達在6孔板中轉染后48h的細胞，經PBS (pH7.4)洗 2次，用中性甲醛固定15min后，PBS洗滌2次，加上適量1:100稀釋的H5亞型的AIV陽性血清， 37°C作用60min，roS洗滌3次，每次5min，然后避光加入lmL的1:320稀釋的FITC標記的羊抗 雞二抗，37 °C作用60min，PBS洗滌3次，加入適量堿性甘油，焚光顯微鏡下觀察熒光。如圖8所 示，結果顯示質粒轉染293T細胞48h后，表達的特異性HA蛋白主要分布于細胞膜上，間接免 疫熒光染色后，能在顯微鏡下呈現(xiàn)出綠色熒光。間接免疫熒光的結果顯示，未轉染質粒及轉 染質粒pCAGGK的293T細胞均檢測不到熒光信號，而轉染質粒pCAGGKHA和pCAGGKoptiHA的 293T細胞可觀察到特異性熒光，且密碼子優(yōu)化質粒pCAGGKoptiHA轉染組的熒光強度顯著高 于未優(yōu)化的野生型質粒pCAGGKHA，如圖8，說明構建的質粒pCAGGKHA和pCAGGKopt iHA可以表 達HA特異性蛋白，且優(yōu)化組質粒表達水平遠遠高于未優(yōu)化組質粒的表達水平。
[0083] Western blot檢測目的蛋白的表達裂解之前將PMSF和RIPA按照1:100的比例混勻 (現(xiàn)用現(xiàn)配）；將在6孔板表達的外源蛋白的293T細胞，用PBS清洗3次后，加入上述混合液(每 孔100uL)，反復吹打，并收集至1.5mL離心管中；5000r/m 4°C離心5min，取上清與5XSDS混 合，沸水中煮1 〇min; 5000r/m4 °C離心5min，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0084] 蛋白膠的配置參考碧云天SDS-PAGE凝膠配置試劑盒。在進行SDS-PAGE凝膠電泳 時，加入樣品，同時設立陽性對照孔與陰性對照孔。先恒壓80V電泳，當樣品進入下層膠后， 恒壓120V電泳直至溴酚藍達到凝膠底部。電泳完畢后，根據(jù)目的蛋白大小切膠，測量膠片大 小，將切好的膠置于轉膠緩沖液中室溫搖晃平衡5min;裁剪硝酸纖維素膜和濾紙;將切好的 硝酸纖維素膜置于轉膜緩沖液中平衡15min，同時浸泡濾紙；用濕電轉膜儀進行轉膜，根據(jù) 目的蛋白大小設定轉膜條件和時間。
[0085]轉膜完成后，取下硝酸纖維素膜，用TBST漂洗3次，每次5min，漂洗后將硝酸纖維素 膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床2h，或者4°C冰箱過夜;將封閉后的硝酸纖維素 膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min，放入一抗中（1:100的H5亞型AIV陽性 血清）室溫低速孵育2h;回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫搖床漂洗3次，每次 5min，然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放入稀釋的二抗（鼠抗雞抗體）中，避光室溫孵育lh，孵 育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次，每次lOmin。用掃膜儀進行掃膜，分析處理圖片后 保存。
[0086]從Western blot結果看出，未轉染質粒及轉染質粒pCAGGK的293T細胞裂解產物均 無特異性條帶，而轉染質粒pCAGGKHA和pCAGGKoptiHA的293T細胞裂解產物均有約70KDa大 小的特異性條帶，與E85病毒尿囊液的陽性條帶一致，且質粒pCAGGKoptiHA轉染的細胞條帶 比質粒pCAGGKHA的濃。說明質粒pCAGGKHA和pCAGGKopt iHA均能在體外表達HA特異性蛋白， 且后者表達蛋白的效率尚于如者，如圖9。
[0087] 五、SPF雞的免疫
[0088] 將3周齡SPF雞隨機分為3組，每組10只，分別免疫 免后二周以同等劑量進行二免，采用大腿肌肉多點注射免疫方式。具體分組情況如下表3:
[0089] 表3實驗分組情況
[0090]
[0091] 六、HI抗體檢測
[0092]在免疫期間對每組雞每周采集其靜脈血，分離血清，置-20°C保存?zhèn)溆茫ㄟ^微量 血凝抑制實驗(HI)測定抗體滴度。首先通過微量血凝法(HA)實驗測定E85病毒的效價，可參 照《WHO動物流感培訓手冊》進行。首先在V型96孔板每排的第1孔至第12孔中加入50yL的 PBS，吸取待檢尿囊液50yL加入第1孔，混勻后取50yL加入第2孔，如此倍比稀釋至第11孔，從 該孔中棄去50yL，第12孔不加尿囊液作為陰性對照，最后在每孔中加入50yL的1 %的紅細胞 懸液，輕微振蕩混勾，靜置于室溫下15~30min后判定結果，出現(xiàn)100 %凝集的病毒的最高稀 釋度即為該樣品的病毒凝集價。根據(jù)測定的病毒的HA效價，配置4倍抗原。
[0093]在V型96孔血凝抑制板每排的第1到第12孔中加入25yL PBS溶液，將被檢血清25yL 加到第1孔，混勻后取25yL至第2孔，依次倍比稀釋到10孔棄去25yL，第11孔留作陽性對照。 每孔中加入25yL的4倍抗原，輕輕搖勻后室溫下作用15min后，每孔中加入25yL的1%的紅細 胞懸液，室溫作用20min后判定并記錄結果。
[0094] 從表4和圖10可以看出，PBS對照組無 HI抗體產生；在首免后pCAGGKHA質粒免疫組 及密碼子優(yōu)化型pCAGGKoptiHA質粒免疫組的HI抗體滴度均值呈上升趨勢，在二免后二周 pCAGGKHA質粒組HI均值為4 · 51og2，pCAGGKoptiHA組HI均值為5 · 01og2，優(yōu)化質粒組在二免 后一周及二免后2周HI抗體均值均高于未優(yōu)化質粒組，表明優(yōu)化型質粒pCAGGKoptiHA免疫 組能誘導機體產生更高的HI抗體水平。
[0095] 表4免疫后HI抗體的動態(tài)變化
[0096]
[0097] 以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，其架構形式能夠靈活多變，可以派生系列產品。只是做出若干 簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明由所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。
【主權項】
1. 一種H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，該疫苗由H5亞型禽流感病毒HA基因和真核 表達載體組成。2. 如權利要求1所述的H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，所述HA基因為H5亞型禽流 感病毒六/(：11；^1^11/6皿即(1〇即/^85/2011(!15附）的]^基因，其序列如]^869所示;或撤基因的 密碼子優(yōu)化型optiHA基因，其序列如optiHAseq所示。3. 如權利要求1所述的H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，所述真核表達載體為限制 性內切酶SacI或EcoRI和Nhe頂每切質粒pCAGGK(卡納抗性)得到的載體片段。4. 如權利要求1-3任一項所述的H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟51. 獲取野生H5亞型禽流感病毒的HA基因，其序列如HAseq所示；52. 獲取將H5亞型禽流感病毒的HA基因根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化的optiHA基因，其 序列如optiHAseq所示；53. 利用內切酶處理S1和S2獲取的目的基因 HA和optiHA與真核表達載體；54. 回收目的片段與載體片段，連接轉化篩選陽性菌落后，提取質粒并進行酶切鑒定。5. 如權利要求4所述的H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，其特征在于，步驟S1中，擴增 !15亞型禽流感病毒4/(3]1；^1^11/6皿]^(1〇]^/^85/2011(!151'11) 的HA基因的引物的5 '端添加的酶切位點為EcoRI，3 '端添加的酶切位點為Nhel，引物序 列如下： E85-F CCGGAATTCATGGAGAAAATAATGCTTC； E85-R CTAGCTAGCTTCAAATGCAAATTCTG 〇6. 如權利要求1-3任一項所述的H5亞型禽流感DNA疫苗為主要活性成分制備的預防或 免疫治療H5亞型禽流感的疫苗和藥物。7. 如權利要求1 _3任一項所述的所述H5亞型禽流感DNA疫苗在制備或免疫治療H5亞型 禽流感的疫苗和藥物中的用途。
【文檔編號】A61P31/16GK106039303SQ201610457461
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】廖明, 焦培榮, 宋慧
【申請人】華南農業(yè)大學