新型和改進的流感疫苗的制作方法
【專利摘要】提供了包括包含流感血凝素的抗原的流感疫苗，所述抗原在合適的低pH或其它合適的條件下經(jīng)受處理，以獲得合適程度的效力喪失，和其制造方法。該疫苗不僅誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，也能誘導(dǎo)如目前滅活的疫苗的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護。還提供了施用流感疫苗的方法，以誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，其特別適合在諸如大流行的緊急情況下使用。
【專利說明】新型和改進的流感疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一般地涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，且具體涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)、和疫苗，且更具體地， 流感疫苗。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 存在三種類型的流感病毒，A、B和C型。A和B型流感病毒負責(zé)人和動物中大部分 感染和相關(guān)疾病。A型流感病毒已與所有流感大流行，與2009年中最新的一種有關(guān)。流感 病毒具有錨定在其包膜上的兩種主要的糖蛋白，血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)。HA通過 結(jié)合至細胞受體和介導(dǎo)病毒與細胞膜之間的融合，負責(zé)介導(dǎo)病毒進入靶細胞。HA也是宿主 免疫應(yīng)答的主要靶點和當(dāng)前許可的疫苗的保護抗原。
[0004] 由于其易于出錯的復(fù)制和重配基因組區(qū)段的能力，流感病毒經(jīng)歷不斷的基因改 變，導(dǎo)致在HA中不斷的抗原改變，及變體或新型病毒株的出現(xiàn)。過去的大流行均與變體或 新性病毒株的出現(xiàn)相關(guān)，對此人群具有很少或沒有預(yù)先存在的免疫力?；贖A和NA的抗 原表征，A型流感病毒被分為16種HA(H1-H16)和9種NA(N1-N9)亞型，而B型流感病毒分 為兩大譜系。作為不斷的抗原改變的結(jié)果，同一亞型內(nèi)的病毒仍然可以是抗原性不同的或 異源的。16種HA亞型基于HA蛋白的序列同源性分為兩大系統(tǒng)發(fā)生組（I和II)，其每個還 可以分為3個（H1、H2、H5和H6 ;H8、H9和H12 ;H11、H13、和H16)和兩個進化枝（H3、H4、和 H14;H7、H10、和H15)(Russell等人，NatlAcadSciUSA. 105:17736-17741, 2008)。 [0005] 流感疫苗
[0006] 當(dāng)前許可的流感疫苗主要是含有來自兩種HA亞型（Hl和H3)和一種B型病 毒的抗原的三價滅活疫苗（TIV) (Fukuda等人，InVaccines.Plotkin等人（著），第4 版，第 339-370 頁，2003，Saunders.Philadelphia;Fiore等人，CurrTopMicrobiol Immunol. 333:43-82, 2009)。最近，四價滅活疫苗（QIV)已被許可，其與TIV相同，但摻入了 額外的B病毒。其沒有被廣泛使用。這些疫苗是毒株特異性的。為了匹配傳播中的病毒， 疫苗毒株每年更新。為針對大流行保護，也產(chǎn)生了靶向大流行病毒的單價滅活疫苗，諸如為 2009年HlNl大流行的一種。當(dāng)前TIV的功效僅是中度的，在年齡為18-65歲的成年人中具 有 59%的平均功效（Osterholm等人，LancetInfectDisl2:36-44,2012)，其針對不良地 匹配的變體病毒可能甚至更低。因此，存在改善目前的TIV的巨大需求。
[0007] 使用雞卵或包括MDCK和Vero的培養(yǎng)的鳥類或哺乳類細胞制造滅活疫苗。制造過 程包括病毒的生長、收集、和純化。病毒在制造過程中滅活，例如，在收集的步驟或在病毒純 化后。可以使用各種化學(xué)試劑和物理手段實現(xiàn)滅活。試劑包括甲醛、戊二醛、β-丙內(nèi)酯、 和TritonΧ-100,其中甲醛是最廣泛使用的。物理手段包括加熱、γ輻照、和UV燈。純化 的滅活的病毒可被直接作為全病毒（WV)抗原用于疫苗，或可以裂解為亞病毒粒子組分，以 產(chǎn)生裂解疫苗（splitvaccine)。裂解的亞組分可被進一步純化，以產(chǎn)生亞單位疫苗。目 前，裂解或亞單位抗原制成的TIV是最廣泛使用的。也使用滅活的WV疫苗，其可優(yōu)選的針 對大流行，因為相比裂解或亞單位疫苗，它有更多的免疫原性，且可以更快地制作。
[0008]HA是保護抗原。滅活疫苗基于HA蛋白的量被標(biāo)準化，HA蛋白的量作為疫苗的效力 指標(biāo)。它是由使用特異于待測試并在疫苗中使用的病毒株的HA的多克隆抗體的單一徑向 擴散（SRD)測試確定的。SRD在含有抗HA抗體的瓊脂板上進行，其中測試抗原被與參考抗 原一起置于由瓊脂形成的小圓孔中（Wood等人，JBiolStand. 5:237-247, 1977;DevBiol Stand. 64:169-177, 1986)?？乖瓟U散進入瓊脂允許抗原和抗體結(jié)合，且從而形成沉淀環(huán)。環(huán) 的尺寸反映了存在于抗原或疫苗中HA的量。對于目前的TIV，效力標(biāo)準是對于成人或老人 群體每劑疫苗三種毒株每種15或60μgHA。TIV的免疫原性已被廣泛評價。效力標(biāo)準與 如通過血細胞凝集抑制（HAI)和中和測試（NT)測量的一定水平的保護免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)相 關(guān)。HAI滴度> 1 :40通常被認為是人中的保護閾值。
[0009] 除了滅活疫苗，正在開發(fā)其它形式的流感疫苗（Lambert和Fauci,NEnglJ Med. 363:2036-2044, 2010)。它們包括單獨或與其它病毒蛋白組合的重組HA蛋白和HA蛋白 構(gòu)成的病毒樣顆粒（VLP)。最近，基于重組HA的三價疫苗已被許可。重組HA蛋白和VLP可 以使用各種不同的表達系統(tǒng)生產(chǎn)，所述表達系統(tǒng)包括細菌、鳥類或哺乳類細胞、桿狀病毒、 和植物。它們是無生命的或不是從感染性材料制成的，且因此不經(jīng)過滅活步驟。然而，這些 疫苗的效力也是基于如通過SRD確定的HA的量，雖然對這些疫苗的效力標(biāo)準可以基于抗原 的免疫原性和功效而不同。
[0010]HA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
[0011]HA是由三個相同亞單位構(gòu)成的三聚體蛋白質(zhì)（Skehel和Wiley,Annu.Rev. Biochem. 69:531-569, 2000 ;Luo,AdvExpMedBiol. 726:201-221，2012)。每個亞單位由兩 個部分構(gòu)成，HAl和HA2,作為蛋白酶裂解前體HAO的結(jié)果。HAl和HA2通過二硫鍵和氫鍵 保持聯(lián)合在一起。三個HA亞單位一起形成具有由HAl形成的球狀頭部及主要由HA2形成 的莖區(qū)的傘狀HA分子。HAl具有受體結(jié)合位點并負責(zé)結(jié)合到宿主細胞，而HA2由融合肽和 長螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，負責(zé)介導(dǎo)細胞融合（Bullough等人，Nature. 371:37-43, 1994)。相比 在HAl下方被覆蓋且免疫原性較低的HA2,HAl是免疫應(yīng)答的主要靶點。隨著結(jié)合到宿主細 胞，病毒進入內(nèi)體，在那里它們被暴露于低pH(?5.0)的環(huán)境。在這樣低的pH，HA經(jīng)歷不 可逆的且劇烈的構(gòu)象改變，包括HAl球狀頭部的解離和再折疊的HA2莖的上升（Skehel和 Wiley,Annu.Rev.Biochem. 69:531-569, 2000)。這些構(gòu)象的改變引起病毒和細胞膜的融合， 導(dǎo)致遞送病毒基因組進入細胞質(zhì)。
[0012] 保守的抗原結(jié)構(gòu)域和具有廣譜保護的流感疫苗的開發(fā)
[0013] 流感病毒的不斷抗原改變構(gòu)成了開發(fā)用于控制流感的流行和大流行的疫苗的巨 大挑戰(zhàn)。目前的TIV(H1、H3、和B)是毒株特異性的，且不適用于控制大流行。因此，迫切 需要提供針對不同亞型的流感病毒的廣譜保護的流感疫苗，以提供對流感流行的更好的控 制，及針對大流行的有效對策。
[0014] 開發(fā)廣泛地保護的疫苗的一個關(guān)鍵戰(zhàn)略是靶向高度保守的抗原結(jié)構(gòu)域，以便產(chǎn)生 的特定抗體是交叉反應(yīng)的，即，能夠與來自相同或不同亞型的異源病毒反應(yīng)以提供交叉保 護（Heiny等人，PLoS0ne.2:ell90, 2007;Du等人，MicrobesInfect. 12:280-286,2010; Gilbert,Influenzaandotherrespiratoryviruses. 10. 1111/irv. 12013,2012) 〇 雖 然HA不斷地發(fā)生抗原改變，可以在HAl和HA2兩者中找到高度保守的結(jié)構(gòu)域。然而， HA2 比HAl更為保守得多（Fouchier等人，JVirol. 79:2814-22, 2005;Gerhard等 人，EmergInfectDis. 12:569-574,2006)。對于HA2,每個單獨的亞型中的平均一致 性百分比為至少92%，或在來自分析的四個進化枝的兩個密切相關(guān)的亞型之間為87%(Fouchier等人，79:2814-22, 2005)。識別HAl的受體結(jié)合位點的單克隆抗體已被證 明能夠中和測試的36種HlNl病毒株中的30種（Whittle等人，ProcNatlAcadSci USA. 108:14216-14221,2011)。另一方面，使用單克隆抗體在HA2的莖區(qū)中已鑒定了若干 高度保守的結(jié)構(gòu)域（Kashyap等人，ProcNatlAcadSciUSA. 105:5986-91，20〇8;Ekiert 等人，Science.324:246-51，2009;Sui等人，NatStructMolBiol. 16:265-73,2009; Corti等人，Science. 333:850-856, 2011)。在HA2、M2和其它病毒蛋白質(zhì)中找到的高 度保守的結(jié)構(gòu)域已成為用于廣泛地保護或通用流感疫苗的開發(fā)的主要靶點（Stanekova 和Vareckova,VirolJ. 7:351, 2010 ；Gilbert,Influenzaandotherrespiratory viruses. 10. 1111/irv. 12013, 2012)〇
[0015] 針對高度保守的結(jié)構(gòu)域的交叉反應(yīng)抗體可通過用目前的疫苗接種疫苗或感染后 產(chǎn)生，但僅在較低水平，不足以提供保護。因此，廣泛地保護的疫苗的主要目的是增加針對 這些結(jié)構(gòu)域的交叉反應(yīng)的抗體應(yīng)答。交叉反應(yīng)抗體可以是中和的或非中和的。中和的抗體 可通過阻止病毒進入細胞，預(yù)防感染。非中和抗體可不預(yù)防感染，但能降低疾病的發(fā)病率和 嚴重程度。研究M2蛋白的高度保守的M2e結(jié)構(gòu)域表明，非中和交叉反應(yīng)抗體可以是高度保 護的并降低病毒散播（Stanekova和Vareckova,VirolJ. 7:351，2010 ;E1Bakkouri等人，J Immunol. 186:1022-1031，2011)。
[0016] 應(yīng)當(dāng)認識到，可以提供針對所有流感病毒（A和B)的保護，并代替所有目前的疫 苗的全譜或真正的通用的流感疫苗將是理想的。然而，這是一項艱巨的任務(wù)，且在被許可 在人中使用之前可能需要漫長的開發(fā)過程（Nabel和Fauci,NatMed. 16:1389-91,2010 ; Rappuoli，F(xiàn)lOOOMedR印· 3:16, 2011)。因此，可首先開發(fā)至少可以提供針對對季節(jié)性流行 很重要的，且有較大可能造成未來的流感大流行的包括HI、H3、和H5的主要亞型的保護的 廣譜疫苗，以滿足目前和緊急需求。鑒于流感流行是不斷的年度事件且下一次大流行可能 發(fā)生在任何時間的這一事實，為了世界人口的福祉，針對可能的未來的大流行保護，并更好 地控制疫情的廣譜和通用的疫苗加速的開發(fā)的需求是嚴峻且急切的。 發(fā)明概要
[0017]因此，本發(fā)明提供了一種流感疫苗，它不僅能提供針對變體或異源的病毒的增加 的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，且還能提供針對包含在疫苗中的病毒的如同目前的滅活 疫苗的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護。該疫苗包括包含流感HA的抗原，該抗原在合適的低pH 或其它合適的條件下經(jīng)受處理，以獲得合適程度的效力喪失。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，包含流感HA的 抗原的效力可通過低PH處理逐漸地降低高達100%，與處理條件直接相關(guān)，且僅在合適的 低PH處理條件下獲得的具有合適程度的效力喪失的抗原誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答和 交叉保護，其特殊地與HA2的增加的交叉反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，HA2是HA的高度保守的部分。效力喪 失可與抗原的或結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)且由對抗原的或結(jié)構(gòu)的改變的功能等價的替代測量指示。 通過以適當(dāng)量的額外的抗原或佐劑補償部分效力喪失，可以容易地配制這些抗原以滿足作 為疫苗的效力標(biāo)準。因此，得到的疫苗可提供針對包含在疫苗中的病毒的如與未處理的抗 原或像目前的滅活疫苗相同水平的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護，并在同時還提供針對沒有 包含在疫苗中的病毒的增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，沒有包含在疫苗中的病毒包 括可能的大流行以及季節(jié)性變體病毒。
[0018] 該新型流感疫苗可以以單一或多個抗原制成。它非常適合用于基于相同的三種抗 原（HI、H3、和B)的新型TIV的生產(chǎn)。通過摻入來自所有三個或至少Hl和H3毒株的處理 的抗原，該新型TIV可誘導(dǎo)甚至更寬廣的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答，特別是考慮到Hl和H3亞型分 別屬于兩個不同的系統(tǒng)發(fā)生組。其同樣可以以最近許可的四價滅活疫苗（QIV)來實現(xiàn)，其 與TIV相同，但摻入了額外的B病毒抗原。當(dāng)配制以滿足效力標(biāo)準時，新型TIV或QIV不僅 會履行其原來的適應(yīng)癥（indication)-針對包含在疫苗中的病毒的毒株特異性保護，還能 提供針對不包含在疫苗中的病毒的廣泛交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，從而提供對季節(jié)性 流行的更好控制及針對可能的大流行的保護?？梢該饺雭碜灶~外的亞型或兩個系統(tǒng)發(fā)生組 的進化枝的抗原，以進一步擴大并加強交叉反應(yīng)和保護。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種用于在人或動物中誘導(dǎo)針對流感病毒的增加的交叉反應(yīng)免 疫應(yīng)答和交叉保護的方法，該方法是通過施用有效劑量的包括包含流感HA的抗原的流感 疫苗，所述抗原通過在合適的低PH或其它合適的條件下處理獲得了合適程度的效力喪失。 本發(fā)明還提出了一種用于在人或動物中誘導(dǎo)針對流感病毒的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護 及增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護兩者的方法，所述方法通過施用有效劑量的進一步 配制以滿足效力標(biāo)準的該流感疫苗。
[0020] 本發(fā)明還提供了用于制造誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護的流感疫苗 的方法。該方法包括將包括HA的流感抗原在合適的低pH和溫度下處理。處理的抗原獲得 合適程度的效力喪失。然后處理的抗原與藥學(xué)上可接受的載體配制為疫苗。通過以額外的 抗原或佐劑補償處理的抗原的部分效力喪失，可以進一步配制這些疫苗以滿足效力標(biāo)準。 然后得到的疫苗還將誘導(dǎo)如同目前的滅活疫苗的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護。
[0021] 本發(fā)明還提供了施用流感疫苗用于增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護的誘導(dǎo) 的方法。該方法包括在合適的低PH處理包括包含流感HA的抗原的疫苗，以產(chǎn)生合適程度 的效力喪失，然后將處理的疫苗施用至動物或人。低PH處理可以使用含有所需的酸性和堿 性溶液的試劑盒進行。此方法可用于轉(zhuǎn)化在傳播或庫存中的現(xiàn)有疫苗，以在諸如大流行的 緊急情況下提供增加的交叉保護。在可能的大流行的情況中這可能是極為重要的對策，在 該情況中庫存的疫苗不直接匹配大流行病毒，且對大流行病毒特異性的疫苗不可用或供應(yīng) 短缺。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1顯示了在不同pH和溫度處理后，用滅活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC) (A)和TIV(2006-2007,Fluzone) (B)的單一徑向擴散（SRD)測 試。
[0024] 圖2顯示了用在pH5. 1和不同的溫度下處理后的滅活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC)、以及具有已知的HA濃度（yg/ml)的參考抗原標(biāo)準（std)的單 一徑向擴散（SRD)測試。
[0025] 圖3顯示了低pH處理的抗原誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答。針對未處 理的或在低pH(5. 1)和不同溫度下（0、25、或37°C)處理的滅活WV抗原（A/New Caledonia/20/99,H1N1NC)或由等量的未處理的抗原和在37 °C下處理的抗原組成的抗 原的混合物在小鼠中產(chǎn)生的混合的血清樣品用不同的抗原在ELISA中測試，所述不同的 抗原包括同源滅活HlNlNCWV抗原未處理的（A)或在pH5· 1和0°C(B)、25°C(C)或 37°C(D)處理的，及異源滅活H5N3WV抗原（A/ 鴨 /Singapore-Q/F119-2/97,H5N3 鴨）（E)、 單價 2009H1N1 大流行疫苗（A/California/7/2009,H1N1CA) (F)、滅活H3N2WV抗原（A/ Wisconsin/67/2005) (G)、和滅活BWV抗原（B/Malaysia/2506/2004) (H)。測試的血清樣品 在第2次免疫后的第4周獲得。
[0026] 圖4顯示了未處理的和低pH處理的抗原在交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)中的比較。圖 3中血清樣品的ELISA單位通過將針對未處理的抗原血清樣品任意地指定為100個單位，作 為計算與在相同ELISA板上測試的相同抗原反應(yīng)的其它血清樣品的滴度（單位）的參考來 確定。
[0027] 圖5顯示了低pH處理的抗原誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答。通過如圖3的 ELISA測試了相同的混合血清樣品，但用異源A/PuertoRico/8/34(HlNlPR8)(A)或A/ California/7/2009 (HlNlCA) (B)病毒、或同源A/NewCaledonia/20/99 (HlNlNC)病毒（C) 的重組HA蛋白。以如圖4(D)中相同的方式比較了未處理的和處理的抗原的交叉反應(yīng)抗體 應(yīng)答的誘導(dǎo)。
[0028] 圖6顯示了由低pH處理的抗原誘導(dǎo)的與HAl和HA2增加的抗體反應(yīng)。與在圖3 中相同的針對未處理的或低pH處理的（pH5. 1，在0、25、或37°C)滅活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC)的混合血清樣品通過免疫印跡，用同源（HlNlNC)和不同的異源 抗原（H1N1CA、H5N1VN、和H5N3鴨）進行了測試。圖A顯示了免疫印跡。圖B顯示了圖A 的免疫印跡中HAl和HA2蛋白質(zhì)條帶的密度圖（未校準的0D)。箭頭指示HAl且括號指示 HA2。
[0029] 圖7顯示了由低pH處理的抗原誘導(dǎo)的與HAl和HA2增加的抗體反應(yīng)和交叉保護。 圖A顯示了免疫印跡中HAl和HA2蛋白質(zhì)條帶的密度圖（未校準的0D)。針對未處理的或 低pH處理的（pH5.2,在 0、25、或 37°C)滅活WV抗原（A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC) 的混合血清樣品通過免疫印跡用同源（HlNlNC)和異源（H1N1PR8)抗原測試。測試的血清 樣品在第2次免疫后的第2周獲得。圖B顯示了針對用異源H1N1PR8病毒的致死性攻擊的 交叉保護。在第二次免疫后第3周進行攻擊。
[0030] 圖8顯示了未處理的和低pH處理的（pH5.2,在0、25、或37°C)滅活WV抗原（A/ NewCaledonia/20/99，H1N1NC)的蛋白酶敏感性。圖A顯示了以考馬斯亮藍染色的凝膠；圖 B顯示了蛋白質(zhì)條帶的密度圖。封閉的箭頭指示HA1，開放的箭頭指示HAl消化產(chǎn)物（DP1)， 括號指示HA2/M1，且封閉的箭頭指示胰蛋白酶。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 定義
[0033] 詞語"抗原"和"免疫原"可互換使用，且是指能夠誘導(dǎo)特異性體液（抗體）和細 胞免疫應(yīng)答的分子、物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖蛋白、或活病毒。
[0034] 本文所用的詞語"抗原性"是指抗體與特異性抗原反應(yīng)或結(jié)合的能力。
[0035] 本文所用的詞語"免疫原性"是指抗原或疫苗誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力。
[0036] 術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指針對抗原、疫苗或感染因子的體液或抗體介導(dǎo)的和細胞介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答。
[0037] 詞語"疫苗"是指用于針對感染性或非感染性疾病的治療性處理或預(yù)防性免疫的 包括抗原的組合物。
[0038] 詞語"免疫"是指通過接種疫苗或感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，其提供針對感染性或外來 試劑的保護。
[0039] 術(shù)語"重組蛋白質(zhì)或抗原"是指以重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或抗原，其可用于在 包括細菌、哺乳類細胞、昆蟲細胞、和植物的各種宿主中克隆和表達基因以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。重 組DNA技術(shù)在眾多出版的書籍和手冊中描述了，包括"Currentprotocolsinmolecular biology" (Ausubel著2008.JohnWiley&Son)。重組蛋白質(zhì)或抗原可以作為單獨的蛋白質(zhì) 或復(fù)合物諸如病毒樣顆粒存在。
[0040] 術(shù)語"疾病"或術(shù)語"疾病狀況"是指可由感染因子或其它潛在的機制引起的在動 物或人中的任何異常改變。它與"病癥"可互換使用。
[0041] 術(shù)語"感染因子"和"病原體"可互換使用，且是指感染性微生物，諸如病毒或細菌， 以及致病劑，諸如各種來源的毒素。
[0042] 詞語"一個（a) "或"一個（an) "是指"一個或更多個"。
[0043] 詞語"滅活的"和"滅活"是指在從活病毒產(chǎn)生滅活疫苗的過程中殺滅或致使活病 毒無感染性或無生命。滅活可在疫苗生產(chǎn)過程的不同階段進行，例如，病毒的純化之前或之 后。"滅活的"與"無生命的"也可互換地使用。無生命的疫苗還可以包括通過重組DNA技 術(shù)產(chǎn)生的抗原,諸如重組HA和病毒樣顆粒。
[0044] 術(shù)語"低pH"與酸性pH可互換地使用。它是指pH小于7. 0。
[0045] 詞語"效力"是指如通過指定的效力測定測量的在抗原制劑或疫苗中抗原的量。對 于疫苗，效力的需求水平或標(biāo)準必須被滿足，這與疫苗的功效或有效性直接相關(guān)。對于目前 的滅活的或無生命的流感疫苗，效力是通過指定的SRD測試測量的HA蛋白的量。它是毒株 特異性的，因為用特異地針對待測試的并在疫苗中使用的病毒株的HA產(chǎn)生的多克隆抗體 進行SRD。因為多種因素，用于疫苗的效力標(biāo)準可能有所不同，所述因素包括抗原類型、預(yù)期 使用的人群、及佐劑的使用。
[0046] 術(shù)語"效力喪失（lossofpotency) "、"效力喪失（potencyloss) "和"效力降低" 可互換地使用，且是指如通過效力測試測量的抗原或疫苗的效力的減少。效力喪失反映抗 原或疫苗的抗原或結(jié)構(gòu)的改變。除了效力測試，這些改變可以通過功能等價的替代方法測 量。
[0047] 術(shù)語"同源的病毒或抗原"是指與如通過基于完善確立的標(biāo)準（一般認為是在HAI 滴度中〈4倍的差異）由HAI測試通常定義的亞型內(nèi)的組中的其它病毒或抗原血清學(xué)相似 的流感病毒或抗原。
[0048] 術(shù)語"異源的病毒或抗原"是指與如通過基于完善確立的標(biāo)準（一般認為是在HAI 滴度中> 8倍的差異）由HAI測試通常定義的來自相同或不同亞型的其它病毒或抗原血清 學(xué)不同的流感病毒或抗原。它可以與"變體病毒或抗原"互換地使用。
[0049] 術(shù)語"交叉反應(yīng)"是指由抗原、疫苗或病毒產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與異源病毒或抗原反 應(yīng)。
[0050] 術(shù)語"交叉保護"是指在宿主中由抗原、疫苗、或感染針對一種病毒產(chǎn)生的保護，預(yù) 防由異源病毒引起的感染或疾病。
[0051] 詳細說明
[0052] 本發(fā)明的第一方面是，通過以直接相關(guān)的處理條件在低pH處理，包括HA的流感抗 原的效力可逐漸降低高達1〇〇%。因此，PH越低，效力喪失越高。升高溫度顯著地增強了 低pH對降低效力的作用。如實施例1、2及4所示，在pH5. 1或5.2及37°C下的處理導(dǎo)致 彡90%的效力喪失，而在相同的pH及0或4°C下的處理降低效力的〈50%。當(dāng)在pH5. 2和 〇°C下進行低pH處理時，獲得效力喪失低達?10%。以滅活WV抗原、TIV以及重組HA證明 了低PH對效力的這種作用。效力喪失是不可逆的，因為在低pH處理后，將pH調(diào)節(jié)回到原 始水平（7. 0-7. 4)后，進行SRD測試。在相同條件下效力喪失的程度可以隨不同的抗原而 改變。但可以通過調(diào)節(jié)處理條件容易地獲得不同的抗原或疫苗的相同水平的效力喪失。
[0053] 本發(fā)明的第二個方面是，當(dāng)以與效力喪失的相關(guān)施用至動物時，低pH處理的抗原 可以誘導(dǎo)針對異源抗原的增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答。如實施例3和4中所示，如通過ELISA 對總特異性抗體測量的，所有處理的抗原誘導(dǎo)異源抗原的增加的交叉反應(yīng)。在更嚴格的條 件下（pH5. 1或5. 2,及37°C)處理的那些具有彡90%的效力喪失，誘導(dǎo)最高的交叉反應(yīng)。 但是，在溫和的條件下（pH5. 1或5. 2,及0-25°C)處理的抗原具有〈50%且低至12. 5%的 效力喪失，也誘導(dǎo)強烈的交叉反應(yīng)。這種增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答不僅以滅活的抗原證明， 且還以重組HA蛋白證明，表明增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答指向HA。增加的交叉反應(yīng)的水平表 現(xiàn)為在來自相同系統(tǒng)發(fā)生組的異源抗原中更高。這與兩個系統(tǒng)發(fā)生組是基于HA蛋白的序 列同源性建立的事實相一致。
[0054] 本發(fā)明的第三方面是，在適當(dāng)?shù)牡蚿H條件下處理的具有部分效力喪失的抗原可 誘導(dǎo)與HA2更大的交叉反應(yīng)，HA2是HA的高度保守部分。如通過免疫印跡的實施例3和4 所示，不同的低pH條件（pH5.1或5.2及0、25、或37°C)下處理的抗原誘導(dǎo)與HAl和HA2 兩者增加的反應(yīng)，但顯然，具有明顯不同的模式。以溫和的條件（〇_25°C)處理的抗原誘導(dǎo) 與HA2更大的反應(yīng)，而以更嚴格的條件（37°C)處理的那一個誘導(dǎo)與HAl更大的反應(yīng)。這 表明，不同處理條件下誘導(dǎo)的抗原或結(jié)構(gòu)的改變不僅是定量的，而且是定性的。在實施例3 和4中，以溫和條件處理的具有在20-50%的范圍內(nèi)的效力喪失的抗原獲得了與HA2反應(yīng)的 最大的增加。重要地，其在所有測試的異種抗原中一致地發(fā)生了。因此，在合適的處理條件 下獲得的一定范圍的效力喪失在誘導(dǎo)與HA2的增加的交叉反應(yīng)方面是特別有效的。另一方 面，在不同條件下，與異源抗原的HAl的增加的交叉反應(yīng)的水平在單個抗原之間變化。這些 結(jié)果與HA2比HAl保守得多的事實相一致。與上文描述的通過ELISA的發(fā)現(xiàn)相似，與HA2 的交叉反應(yīng)也表現(xiàn)為在來自相同系統(tǒng)發(fā)生組的異源抗原中更高。
[0055] HAI和NT測量中和抗體。未處理的抗原（A/NewCaledonia/20/99)誘導(dǎo)針 對同源病毒的高HAI和NT滴度，但如預(yù)期的，沒有檢測到針對異源病毒（A/Puerto Rico/8/34，HlNlPR8)的HAI或NT滴度。處理的抗原誘導(dǎo)與效力喪失相關(guān)的針對同源病毒 的較低的HAI和NT滴度。但是，在溫和的條件下（0-25°C)處理的具有〈50%的效力喪失 的抗原仍然能夠誘導(dǎo)實質(zhì)的HAI和NT滴度，相比未處理的抗原它們在相同的水平或僅低? 2倍。重要的是，如實施例4所示在溫和的條件下（pH5.2和25°C)獲得的某些處理的抗 原也能夠誘導(dǎo)針對異源病毒的較低、但增加的HAI和NT滴度水平。
[0056] 本發(fā)明的第四方面是，在合適的低pH條件下獲得的具有部分效力喪失的相同的 處理的抗原可以誘導(dǎo)增加的交叉保護。實施例4顯示，在溫和的條件（0或25°C)下處理 的具有〈50%的部分效力喪失的抗原誘導(dǎo)增加的交叉保護。與之相反且出乎意料的是，在 37°C下處理的具有>90%的效力喪失的抗原在使用的實驗條件下未提供任何可檢測的交 叉保護，雖然通過這種抗原誘導(dǎo)了與HAl高水平的總交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答及交叉反應(yīng)。因此， 很顯然，增加的交叉保護與部分的效力喪失（〈50%)和與HA2的增加的交叉反應(yīng)相關(guān)。Quan 等人（Virology. 417:196-202, 2011)評估了基于低pH對HA的構(gòu)象改變的公知作用的認 識，在低pH(5.0)和37°C下處理的滅活WV抗原試圖產(chǎn)生交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。然 而，處理的抗原喪失了 > 4倍的血細胞凝集活性，且不誘導(dǎo)任何增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答， 也不誘導(dǎo)針對異源病毒的任何增加的交叉保護。它實際上比未處理的抗原在誘導(dǎo)交叉反應(yīng) 的抗體應(yīng)答和交叉保護方面更低效（Quan等人，Virology417:196-202, 2011)。這與在本發(fā) 明中在37°C處理的抗原涉及增加的交叉保護的缺乏的結(jié)果相一致，并且還顯示了本發(fā)明的 意想不到的性質(zhì)，即在溫和的低PH條件下處理的具有部分效力喪失的抗原誘導(dǎo)增加的交 叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。雖然不希望受到理論的束縛，但可能的是在溫和的條件下處 理的抗原可能僅獲得有限的抗原或結(jié)構(gòu)改變，這適合于更好的暴露在其天然形式中的HA2 和可能地其它保守結(jié)構(gòu)域，且從而增加交叉反應(yīng)和保護，而在37°C下處理的那些可能獲得 過度的抗原或結(jié)構(gòu)改變，如通過幾乎完全的效力喪失證明的，且因此可能與天然HA較不相 關(guān)，且因此較少的保護，即使當(dāng)針對它們誘導(dǎo)了增加的免疫應(yīng)答。
[0057] 低pH對流感病毒的HA的作用已被廣泛研究（Skehel和Wiley,Annu.Rev. Biochem. 69:531-569, 2000 ;Luo,AdvExpMedBiol. 726:201-221, 2012)。但是，先前沒有 研究集中于低pH對流感抗原和疫苗的效力的作用，及以在不同的低pH條件下處理的抗原 誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。因此，本發(fā)明首次表明，與低PH處理的條件相 關(guān)，流感抗原的效力可降低達100%。本發(fā)明還證明，僅在合適的低PH處理的條件下獲得的 具有合適程度的效力喪失的抗原誘導(dǎo)與HA2更大的交叉反應(yīng)，及增加的交叉保護，HA2是HA 的高度保守部分?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)形成了基于合適的低PH條件下處理的抗原的新型和改進 的流感疫苗的基礎(chǔ)。
[0058] 本發(fā)明的一個實施方案是包括在合適的低pH條件下處理的具有部分效力喪失的 流感抗原的流感疫苗，其誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)應(yīng)答和交叉保護。優(yōu)選地，低PH處理后，處理 的抗原保留了其原始血細胞凝集活性。疫苗可與佐劑配制以進一步增強交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答 和交叉保護。
[0059] 本發(fā)明的另一個實施方案是包括在合適的低pH條件下處理的具有部分效力喪失 的流感抗原的流感疫苗，其不僅提供了增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，且還滿足了 效力標(biāo)準，從而提供了如與未處理的抗原或像目前的滅活疫苗相同水平的針對包含在疫苗 中的流感病毒的毒株特異性保護。這種雙效疫苗可通過如實施例6中描述的制備，通過摻 入合適量的額外的抗原或佐劑，補償處理的抗原的部分效力喪失。
[0060] 已知的是，毒株特異性免疫應(yīng)答和保護主要通過HAl介導(dǎo)，HAl是目前的滅活疫苗 中HA的免疫顯性的部分。毒株特異性保護主要通過中和抗體賦予，如由HAI和NT測量的。 根據(jù)本發(fā)明，由在合適的低PH條件下處理的抗原誘導(dǎo)的增加的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答和交叉 保護與以HA2的增加的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。因此，這種雙效疫苗均衡地使用HAl和HA2,前者用于 主要誘導(dǎo)毒株特異性免疫應(yīng)答和保護，后者用于主要誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉 保護。中和及非中和抗體兩者可以牽涉在由在合適的低PH條件下處理的抗原誘導(dǎo)的交叉 保護中。如上文所述，非中和抗體也可以是高度保護的。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的流感疫苗可以以一種或更多種抗原制備。在多種抗原的情況下，部 分或全部的抗原可在適合于各自抗原的低pH條件下處理。目前的TIV包含來自三個病毒株 的抗原，三個病毒株是H1NUH3N2、和B。最近，四價滅活疫苗（QIV)已被許可，其與TIV相 同，但摻入了額外的B病毒。Hl亞型屬于系統(tǒng)發(fā)生組I，而H3亞型屬于系統(tǒng)發(fā)生組II。因 此，如果來自Hl和H3亞型兩者的處理的抗原合并，可生成甚至更廣泛的交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答 和交叉保護?？紤]到兩個系統(tǒng)發(fā)生組基于HA蛋白的序列同源性確立，這是特別有利的，且 因此預(yù)計以相同系統(tǒng)發(fā)生組內(nèi)的病毒交叉反應(yīng)的水平將較高。因此，根據(jù)本發(fā)明，這些抗原 高度適用于制造新一代TIV或QIV。這樣的新疫苗將不僅發(fā)揮其原來的適應(yīng)癥一針對包含 在疫苗的病毒的毒株特異性保護，而且還可以提供針對不包含在疫苗中的其它病毒，包括 可能的大流行以及季節(jié)變體病毒的增加的交叉保護。這種新型廣譜TIV或QIV的非常顯著 的優(yōu)點是，它可以容易地摻入到針對流感的目前的免疫項目中。該新型TIV或QIV還可摻 入來自額外的進化枝的處理的抗原，以成為多價或多進化枝疫苗，所述疫苗包括來自一個 系統(tǒng)發(fā)生組的兩個或更多個進化枝的抗原、及來自另一系統(tǒng)發(fā)生組的至少一個進化枝的抗 原。來自兩個系統(tǒng)發(fā)生組的所有五個目前的進化枝的抗原可摻入該多進化枝疫苗中。作為 使用在合適的低PH條件下處理的抗原的結(jié)果，由通過更保守的HA2進一步加強進化枝和系 統(tǒng)發(fā)生組內(nèi)和之間的交叉反應(yīng)性，所得疫苗將進一步增強和擴大交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉 保護。這樣的疫苗具有提供足以達到實現(xiàn)真正的通用保護的最終目標(biāo)的抗原寬度的能力。 [0062] 本發(fā)明的又另一實施方案是生產(chǎn)誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護的流 感疫苗的方法。因此，包括HA的流感抗原在合適的低pH條件下處理，以獲得期望水平的效 力喪失，用于誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。對于低pH處理，酸性pH溶液可被 添加到抗原以調(diào)節(jié)PH至合適的低pH水平，然后將抗原保持在合適的溫度持續(xù)合適的一段 時間，且在處理結(jié)束后，抗原的PH被調(diào)節(jié)回到原始的或生理學(xué)的水平（7. 0-7. 4)。具體處理 條件可以基于抗原形式、病毒株、來源和生產(chǎn)方法對不同的抗原而改變。對于給定的抗原， 可以通過在寬的pH和溫度范圍下的測試確定合適的條件。低pH處理可以在制造過程中的 任何階段進行，例如散裝抗原在其配制成最終的疫苗產(chǎn)物前。對于由雞卵或培養(yǎng)的鳥類或 哺乳類細胞中生長的活病毒制成的滅活的抗原，低PH處理可以在滅活之前或之后進行。低 PH處理后，滅活的抗原可進一步用甲醛或其它合適的試劑固定，以確?？乖拈L期穩(wěn)定性。 低PH處理可以優(yōu)選在2-8°C或低于室溫進行，以保持抗原的穩(wěn)定性并最小化微生物污染的 機會。對于多價疫苗，在被合并以制備最終的疫苗前，單個抗原可以分別在不同的合適的條 件下處理。最終的疫苗可通過如實施例6中描述的，由通過摻入合適量的額外的未處理的 或處理的抗原或合適的佐劑，補償處理的抗原的部分效力喪失，制備以滿足效力標(biāo)準。對于 具有非常低的效力喪失的處理的抗原，抗原補償可能不是必要的，因為這樣的抗原可能仍 然能夠誘導(dǎo)相同水平的毒株特異性免疫應(yīng)答。
[0063] 本發(fā)明另一實施方案是施用流感疫苗至動物或人的方法，以誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng) 免疫應(yīng)答和交叉保護。因此，將酸性溶液或低pH緩沖溶液（處理溶液）加入疫苗，以降低 疫苗的pH至合適的水平，例如5. 0-6. 0。然后疫苗保持在合適的溫度下（4、25、或37°C) 持續(xù)合適的一段時間以誘導(dǎo)合適水平的效力喪失。加入堿性溶液或高pH緩沖液（終止溶 液）通過使PH回到其原始或生理學(xué)水平（7. 0-7. 4)以停止處理。然后將疫苗施用至動物或 人。加入堿性溶液的步驟是任選的，因為與酸性溶液混合的疫苗的PH-經(jīng)接觸體液可以很 快改變至生理學(xué)水平。可以提供包括酸性溶液和堿性溶液的試劑盒，以便于在多劑量小瓶 或單劑量注射器中的疫苗的處理。在可能的大流行的情況中這種方法是非常重要的，其中 傳播或庫存中的現(xiàn)有的疫苗不直接匹配大流行病毒，且對大流行病毒特異性的疫苗不可用 或供應(yīng)短缺。因此，這些現(xiàn)有的疫苗可通過就在施用前在合適的條件下低PH處理被轉(zhuǎn)化， 以提供增加的交叉保護，否則功效將較低或沒有。考慮到目前有限的全球疫苗生產(chǎn)能力，大 流行疫苗的短缺是不可避免的，特別是在大流行的早期階段。因此，在合適的低的條件下低 PH處理現(xiàn)有疫苗能夠在這樣緊急的情況下提供有效的對策。
[0064] 包括HA的任何抗原或疫苗可適合于通過本發(fā)明使用。它們可以通過各種制造系 統(tǒng)生產(chǎn)，諸如細菌細胞、鳥類細胞（aviancell)、哺乳類細胞、雞卵、昆蟲細胞、植物細胞、昆 蟲、和植物。它們也可以以不同的形式，如WV、裂解病毒、亞單位、病毒體、重組HA和病毒樣 顆粒。它們可以是由活病毒產(chǎn)生的滅活的抗原或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)?？?原中的HA可以是部分或全部的HA分子，且還可以通過重組DNA技術(shù)插入、缺失、和/或取代 一個或更多個氨基酸被修飾。低pH處理前，重組HA可以任選地用蛋白酶處理，以去除HAl 和HA2 之間的共價連接（Wang等人，Vaccine. 24:2176-2185, 2006)。
[0065] 對于本發(fā)明的實踐，抗原可以在從3. 0至6. 8的合適的低pH范圍，及(TC或更高的 溫度下處理。合適的低PH處理條件可以基于毒株、形式、來源和生產(chǎn)方法對不同的抗原而 改變。因此，對于給定的抗原，合適的處理條件可以通過基于用于誘導(dǎo)交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和 交叉保護的效力喪失的期望水平或范圍，在不同的溫度（〇_37°C)篩選廣泛的低pH(3-6.9) 確定。該抗原可能有在非常低的pH(〈4. 5)變性的風(fēng)險，這使得其對流感病毒抗原性相關(guān)性 較低。因此，低pH處理可以優(yōu)選地在pH4. 5-6. 5及合適的溫度進行，以達到效力喪失的期 望水平，同時最小化抗原的任何可能的變性。因為低PH對效力的作用通過增加溫度而增 力口，基于使用的特定的低PH和溫度的組合，在不同的條件下可達到相同水平的效力喪失是 可能的。
[0066] 適于增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護的誘導(dǎo)的效力喪失的程度可根據(jù)不同 的抗原而改變，其范圍可從1% -100%。如在實施例3和4中證明的，在一定范圍內(nèi)的效力 喪失（20% -50% )以HlNl的NCWV抗原誘導(dǎo)與HA2的最高交叉反應(yīng)。然而，效力喪失的 合適范圍可隨著不同抗原而變化。約50%或更少的效力喪失是優(yōu)選的，因為具有這種部分 效力喪失的抗原可以特別有效地誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，且在同一時間 也能誘導(dǎo)顯著的或相同水平的毒株特異性免疫應(yīng)答。它們可以額外的抗原配制，以滿足效 力標(biāo)準。如實施例4中所示，具有僅為12. 5%的效力喪失的抗原可以是有效的。在0-25°C 范圍內(nèi)的溫度優(yōu)選用于產(chǎn)生具有相對較低的效力喪失（約50%或更少）的處理的抗原。因 為疫苗在低溫下（2-8°C)生產(chǎn)并儲存，出于疫苗穩(wěn)定性和預(yù)防微生物污染的目的，在2-8°C 范圍內(nèi)的溫度可以是特別合適的。
[0067] 優(yōu)選的是，抗原的血細胞凝集活性在低pH處理后被保持。因此，低pH處理后血細 胞凝集滴度優(yōu)選地保持相同或具有〈2倍的降低。血細胞凝集活性反映了HA對細胞受體的 結(jié)合，且是穩(wěn)定性的重要指標(biāo)?？梢允褂糜糜跍y量HA與受體結(jié)合的可替代方法。應(yīng)當(dāng)理解， 取決于使用的生產(chǎn)方法，一些抗原或疫苗可以不具有血細胞凝集活性。因此，可能不能用血 細胞凝集活性評估一些處理的抗原或疫苗。
[0068]用于在低pH處理期間調(diào)節(jié)pH的試劑可以是簡單的酸和堿。用于降低pH的酸可 選自包括以下的組，鹽酸（HC1)、乙酸、檸檬酸、硼酸、MES(2-(N-嗎啉代）乙磺酸）、和磷酸。 低pH處理后用于提高pH到生理學(xué)水平的堿可以選自包括以下的組，氫氧化鈉（NaOH)、乙 酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉、磷酸鈉、和Tris(三（羥甲基）氨基甲烷）。它們可制成無菌溶液 用于與抗原或疫苗混合。可替代地，以這些酸和堿制成的低pH緩沖液，如在合適的低pH的 檸檬酸鹽或乙酸鹽緩沖液，可用于降低pH，且堿性pH緩沖液，如在?pH8. 0的檸檬酸鹽、 Tris、或磷酸鹽緩沖液，可以用于提高pH回到原始的或生理學(xué)的pH水平（7. 0-7. 4)。緩沖 劑的用途具有最小化暴露抗原至極端PH的機會的優(yōu)點。
[0069] 可以通過在其它合適的條件下處理，獲得用于增加交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護 的合適范圍的效力喪失的抗原。已知的是，在高溫或用變性劑諸如尿素的處理可如低PH誘 導(dǎo)HA蛋白的相似的構(gòu)象改變（Carr等人，1997)。因此，也可以使用基于變性劑如尿素、高 溫或其它化學(xué)和物理手段的替代的處理條件，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的具有合適范圍的效力喪 失的處理的抗原，用于誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。作為一個實例，可以通過 在不同的高溫（50_68°C;實施例8)下處理，獲得效力的逐漸降低。用于抗原處理的合適范 圍的高溫可以從40至80°C的范圍，考慮到合適的溫度可以隨不同抗原而改變。為了避免抗 原的可能變性，可優(yōu)選37-70°C的較低的溫度范圍。溫度的作用是依賴于時間的。合適程度 的效力喪失可以通過在可以包括37°C或更低的較低的溫度下處理較長的時間獲得。在高溫 或其它替代處理后，抗原的血細胞凝集活性也優(yōu)選被保持。
[0070] 效力喪失反映了HA分子的抗原或結(jié)構(gòu)的改變。以對HA特異性的多克隆抗體進行 SRD。多克隆抗體由識別HA分子上的各種不同的表位的單個抗體構(gòu)成，所述表位作為由一 級氨基酸序列的不連續(xù)的部分或線性拉伸制成的結(jié)構(gòu)可以是構(gòu)象的或線性的。因此，效力 的降低反映了在分子的某些區(qū)域中抗原的或結(jié)構(gòu)的改變，消除了一些原始的表位并暴露了 先前較少暴露或隱藏的那些。效力喪失是低PH處理后抗原或結(jié)構(gòu)改變的優(yōu)選的指標(biāo)，因為 它直接關(guān)系到抗原或疫苗誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和蛋白質(zhì)以及毒株特異性免疫應(yīng) 答和保護的能力。然而，效力喪失可與對部分或全部HA的抗原或結(jié)構(gòu)的改變的功能等價的 替代測量相關(guān)，其可以包括生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或形態(tài)學(xué)的方法，諸如與單克 隆抗體反應(yīng)、蛋白酶敏感性、溶血、細胞融合、電子顯微鏡術(shù)、差示掃描量熱法（DSC)和圓二 色性（CD)。因此，在低pH處理期間，通過功能等價的替代測量，可以指示并監(jiān)測抗原或結(jié)構(gòu) 的改變，且稍后確定處理的抗原的效力用于配制最終疫苗以滿足效力標(biāo)準。作為一個實例， 蛋白酶敏感性可以與效力喪失相關(guān)（實施例5)。在將來，可開發(fā)新型效力測定用于流感疫 苗以關(guān)聯(lián)并替代目前的SRD測試。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以以各種不同的藥物賦形劑或載體配制。它們可以包括鹽和 緩沖劑以提供生理學(xué)的離子強度和PH，表面活性劑諸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚 集，用于抗原穩(wěn)定的穩(wěn)定劑，諸如PEG、海藻糖、和明膠，及用于緩釋的聚合物諸如CMC、HEC、 和葡聚糖。疫苗還可以受控釋放或增強的展示系統(tǒng)配制，諸如水凝膠、病毒體、納米顆粒、和 乳液。疫苗還可以佐劑配制，以進一步增加交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，所述佐劑可包括 實施例6中描述的那些。疫苗可通過各種途徑使用，如肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、局部、舌下、或口 服。
[0072] 總之，本發(fā)明提供了新型和改進的流感疫苗，及制造和施用其的方法。這種疫苗不 僅可以提供針對異源病毒的增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護，還可以像目前的滅活疫 苗提供針對季節(jié)性流感病毒的毒株特異性保護。因此，在滿足提供針對可能的未來的大流 行的保護以及更好地控制季節(jié)性流感的流行的迫切需要方面，它具有明顯的優(yōu)勢。提供以 下實施例以說明本發(fā)明的原理而非限制其范圍。
[0073] 實施例1
[0074] 低pH處理后的滅活流感全病毒（WV)抗原的效力
[0075]使用了來自三種病毒株（A/NewCaledonia/20/99,HlHl(HlNlNC) ;A/ Wisconsin/67/2005，H3N2(H3N2Wis) ;B/Malaysia/2506/2004(BMal)的滅活WV抗原。它 們是通過從感染的MDCK細胞純化，并在4°C以甲醛（1/4000稀釋或0. 01 % )滅活至少三天 產(chǎn)生的。滅活通過在雞卵中的滴度和在MDCK細胞中的空斑測定確認。
[0076] 對于低pH處理，在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7. 2;?2.Omg/ml)中的抗原以含 有150mMNaCl(pH4. 6-5. 4,以0· 2增量）的20mM檸檬酸鈉緩沖液1:10稀釋使抗原的pH 達到4.9-5.5，最終抗原濃度為?0.211^/1111。然后，將抗原在01：(冰上）、41：、251：(室 溫）、或37°C保持15min，隨后用適當(dāng)體積的IMTrisHCl緩沖液（pH8. 0)將pH調(diào)節(jié)回到 原始的水平（7. 0-7. 4)?？商娲兀褂靡钥乖♂專ɡ纾? :10)的低pH緩沖液（0. 2M 檸檬酸鹽/〇.IM磷酸鹽，pH3. 6-6. 6,以0.2增量）。這允許抗原在更高的蛋白質(zhì)濃度被 處理。滅活抗原的HA的效力或量通過SRD測試根據(jù)Wood等人描述的方法測量（JBiol Stand. 5:237-247, 1977;DevBiolStand. 64:169-177, 1986)。以在說明書中提供的推薦濃 度使用SRD參考血清和抗原（H1N1、H3N2和B;FDA)。
[0077] 對于不同條件的篩選，基于在SRD測試板中形成的沉淀環(huán)的尺寸分析了結(jié)果。它 們表明，如較小的沉淀環(huán)所反映的，低pH處理的抗原表現(xiàn)出降低的效力（圖IA和表1)。沉 淀環(huán)尺寸或效力的降低與處理條件直接相關(guān)。PH越低，效力喪失越大（圖IA和表1)。升高 溫度顯著地增強了低PH對降低效力的作用（圖IA和表1)。從最溫和的（pH5. 5和0°C) 到最嚴格的（pH4. 9和37°C)處理條件獲得了全范圍的效力喪失（17. 6% -98. 6% )。圖 2顯示了在pH5.1和不同溫度下處理的HlNlWV抗原以及參考標(biāo)準的效力。在0和4°C之 間沒有觀察到效力喪失的明顯差異。
[0078] 用滅活的H3N2和BWV抗原獲得了類似的結(jié)果，即效力喪失隨著pH降低和溫度升 高而升高。然而，效力喪失的程度在不同抗原中變化。在各種條件下H3N2抗原顯示了與 HlNl抗原相似程度的效力喪失，而B抗原對低pH處理更為敏感得多-在4°C和pH5. 6獲 得了 >50%的效力喪失。
[0079] 在低pH處理后，還使用1 %雞紅細胞（RBC)在96孔V底板中測量了血細胞凝集 活性。在50μIPBS中將抗原一式兩份連續(xù)稀釋2倍，然后與等體積的1 %新鮮雞RBC混 合。將板在室溫下保持lhr，隨后確定血細胞凝集滴度，其為具有完全凝集的最高稀釋度。 結(jié)果顯示，對于HlNlNC抗原，當(dāng)效力已喪失93. 1 %時血細胞凝集活性保持相同，且在最低 的pH(4. 9)和37°C的處理后，具有98. 6%效力喪失，血細胞凝集活性僅下降2倍（表2)。
[0080]
【權(quán)利要求】
1. 一種流感疫苗，所述流感疫苗包括至少一種包含流感血凝素的抗原，其中所述抗原 在合適的低pH或其它合適的條件下經(jīng)受處理以得到合適程度的效力喪失；其中所述疫苗 誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少兩種選自包括A型流感病 毒H1和H3亞型的組的所述抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少三種所述抗原，所述抗原 選自包括來自第一系統(tǒng)發(fā)生組的至少兩個進化枝、及來自第二系統(tǒng)發(fā)生組中的至少一個進 化枝的組，其中每個所述抗原選自獨立的進化枝。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是滅活的或重組的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在所述處理 后被滅活。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述合適的低pH范圍為從3. 0到6. 8,且優(yōu) 選 4. 5 至 6. 5。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中在合適的低pH的所述處理在從0至37°C范 圍的溫度下進行。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中在合適的低pH的所述處理在0-25°C進行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中在所述處理后，所述抗原表現(xiàn)出血細胞凝集 活性中無或小于2倍的降低。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述合適程度的效力喪失的范圍為從1 %至 100%。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述合適程度的效力喪失的范圍為從10% 至 50%。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的流感疫苗，其中在合適的低pH的所述處理在0-25°C進行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述其它合適的條件包括范圍從37到80°C 的合適的高溫。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述效力喪失由對抗原的或結(jié)構(gòu)的改變的 功能等價的替代測量指示。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗誘導(dǎo)針對HA2的增加的免疫應(yīng)答。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗被配制為滿足誘導(dǎo)毒株特異性免 疫應(yīng)答和保護的效力標(biāo)準。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗還包括佐劑。
18. -種用于在人或動物中誘導(dǎo)針對流感病毒的增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護 的方法，所述方法是通過施用有效劑量的權(quán)利要求1所述的流感疫苗。
19. 一種用于在人或動物中誘導(dǎo)針對流感病毒的毒株特異性免疫應(yīng)答和保護及增加 的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護兩者的方法，所述方法是通過施用有效劑量的權(quán)利要求16 所述的流感疫苗。
20. -種用于產(chǎn)生包括至少一種包含流感血凝素的抗原的流感疫苗的方法，其中所述 疫苗誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護；其中所述方法包括： a.調(diào)節(jié)所述抗原的pH至合適的低pH，所述合適的低pH范圍為從3. 0到6. 8,且優(yōu)選 4. 5 至 6. 5， b. 將所述抗原在合適的溫度下保持合適的一段時間，其中所述合適的溫度范圍為從Ο 至37°C，且優(yōu)選0至25°C， c. 調(diào)節(jié)所述抗原的pH回到原始的或生理學(xué)的水平以產(chǎn)生處理的抗原，其中所述處理 的抗原獲得范圍從1%至100%的合適程度的效力喪失， d. 在藥學(xué)上可接受的載體中將所述處理的抗原配制為疫苗。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述疫苗通過合適的配制途徑配制以滿足效力 標(biāo)準，所述配制途徑包括： a. 將合適量的所述處理的抗原摻入所述疫苗， b. 將合適量的未處理的和所述處理的抗原的混合物摻入所述疫苗，和/或 c. 將佐劑摻入所述疫苗， 其中所述疫苗還誘導(dǎo)毒株特異性免疫應(yīng)答和保護。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗原是滅活的或重組的。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在步驟c后被滅 活。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗原是由哺乳類細胞、鳥類細胞、昆蟲細 胞、細菌細胞、植物細胞、雞卵、昆蟲或植物產(chǎn)生的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述處理的抗原表現(xiàn)出血細胞凝集活性中無或 小于2倍的降低。
26. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述合適的溫度為2-8°C。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述合適程度的效力喪失的范圍為從10%至 50%。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述合適的溫度為0-25°C。
29. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述效力喪失由對抗原的或結(jié)構(gòu)的改變的功能 等價的替代測量指示。
30. -種將包括至少一種包含流感血凝素的抗原的流感疫苗施用至人或動物的方法， 其中所述疫苗誘導(dǎo)增加的交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答和交叉保護；其中所述方法包括： a. 向所述疫苗加入酸性溶液，以調(diào)節(jié)所述疫苗的pH至合適的低pH，其中所述合適的低 pH選自3. 0-6. 8、且優(yōu)選4. 5-6. 5的范圍， b. 將所述疫苗在合適的溫度下保持合適的一段時間，其中所述合適的溫度選自0至 37 °C，且優(yōu)選0至25 °C的范圍， c. 任選地向所述疫苗加入堿性溶液，以調(diào)節(jié)所述疫苗的pH回到原始的或生理學(xué)的水 平，及 d. 將所述疫苗施用至人或動物， 其中所述抗原獲得范圍從1%到100%、且優(yōu)選從10%至50%的合適程度的效力喪失。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，還包括試劑盒，所述試劑盒包括 a. 在容器中的酸性溶液，其中所述酸性溶液優(yōu)選為低pH緩沖液，及 b. 在容器中的堿性溶液，其中所述堿性溶液優(yōu)選為在堿性pH的緩沖液。
【文檔編號】A61K39/145GK104302317SQ201380025849
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月16日
【發(fā)明者】倪亞煒, 郭建華 申請人:Kj 生物科學(xué)有限公司, 倪亞煒, 郭建華