專利名稱::吸附滅活流感疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及吸附滅活全病毒流感疫苗及其制備方法。
背景技術(shù):
:流感病毒是屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、具有直徑約100nm顆粒大小的RNA有包膜病毒,根據(jù)其內(nèi)部蛋白的抗原性分為A、B和C型。流感病毒含有被具脂雙層結(jié)構(gòu)的病毒包膜包圍的、與內(nèi)部核殼或核蛋白締合的核糖核酸(RNA)的芯,以及外部糖蛋白。病毒包膜的內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白構(gòu)成,外層大部分由來自宿主的脂類物質(zhì)構(gòu)成。流感病毒的RNA具有分節(jié)結(jié)構(gòu)。目前在世界大流行的流感由A型流感病毒引起。A型具有血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種包膜糖蛋白,根據(jù)其抗原性的不同,HA分為16種亞型,NA分為9種亞型。對于A型流感病毒目前對其了解到在人以外的鳥、豬、馬等動物間分布,因此人與動物的病毒之間發(fā)生基因重組,結(jié)果出現(xiàn)具有新抗原性的亞型病毒(新型病毒),并且該新型病毒在不具有免疫的人群中大流行。目前,已知有西班牙流感(HswlNl)、亞洲流感(H2N2)、香港流感(H3N2)流行。近年來以東南亞為中心,觀測到H5N1亞型高病原性禽流感的發(fā)生、流行,目前有1.5億只以上的大量家禽死亡或被淘汰。并且也有人被感染的例子,僅至2006年9月可確診的就已經(jīng)達(dá)到246人。另人感到威脅的是其死亡率,246人中有144人死亡。通常,禽流感病毒并不容易感染人,其性質(zhì)基本上不發(fā)生變化。但是,由于病毒的變異,獲得了對人的易感染性,在人群中大流行時,則可能發(fā)生前所未有的慘劇。鑒于其大流行,新型流感疫苗的開發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急。但是,1997年在香港首次報道了人的感染病例以來,雖然疫苗開發(fā)被認(rèn)為是當(dāng)務(wù)之急,但是并不容易進(jìn)展。其最大原因是H5N1亞型禽流感病毒的免疫原性低,因此以往的禽流感疫苗存在難以將足夠的疫苗效果賦予接種者的問題。因此,提高免疫原性的一些對策是很重要的。流感疫苗大致分為兩種。一種是目前所使用的流感疫苗,是含有亞病毒體的片段疫苗,該亞病毒體是將純化病毒顆粒用有機(jī)溶劑/表面活性劑或其它試劑分解、使脂包膜溶解而形成;或者是含有純化HA和NA的亞單位疫苗。主要給予肌內(nèi)或皮下。另一種是將純化的病毒顆粒用福爾馬林等試劑進(jìn)行化學(xué)滅活的疫苗,也稱為全病毒疫苗。這種情況下,病毒基因或病毒蛋白被化學(xué)改性,只是使感染性消失,因此病毒以保持顆粒形狀的狀態(tài)形成疫苗抗原。全病毒疫苗與片段疫苗相比,免疫原性高,特別是對于尚未有感染經(jīng)歷、即不具有免疫記憶的初次個體可引發(fā)良好的免疫應(yīng)答。人對于新型流感不具有免疫記憶,因此,從有效性角度考慮,優(yōu)選全病毒疫苗的該特征。但是,全病毒疫苗的免疫性高的特性意味著其生物活性高,與接種時的局部腫脹、紅腫、或發(fā)熱等副反應(yīng)密切相關(guān)。即,如果可以確立全病毒疫苗在產(chǎn)生高免疫原性的同時可以降低其副反應(yīng)的一些方法,則可以開發(fā)有效且安全性高的疫苗。新型流感疫苗的劑型有望是具有高免疫原性的全病毒疫苗。但是,當(dāng)為H5N1亞型時,有即使通過該全病毒疫苗也難以在人體內(nèi)激發(fā)良好的免疫應(yīng)答的報道,因此必須考慮進(jìn)一步提高免疫原性的方案。佐劑是為了提高抗原的免疫原性而添加到疫苗中的免疫增強(qiáng)劑,目前探討了很多物質(zhì)。例如,為了提高流感疫苗的有效性,還研究了結(jié)合使用鋁佐劑(專利文獻(xiàn)7)。還已知使用聚氧乙烯醚(Tween(注冊商標(biāo)))等非離子表面活性劑作為粘膜給予用疫苗的佐劑(專利文獻(xiàn)8)。有幾種侯選佐劑,可以添加到DPT疫苗或乙型肝炎疫苗中、長期、廣泛的安全性已得到確認(rèn)的鋁佐劑得到最廣泛的探討。鋁佐劑具有免疫活化作用,同時通過吸附抗原可以將少量的抗原保留在局部,具有所謂的貯庫效應(yīng)(depositeffect),因此具有可降〗氐疫苗的抗原水平的優(yōu)異特性。對于以全人類為接種對象的大流行疫苗,如何將疫苗供給更多的人是一個大的課題,該特性在疫苗設(shè)計上有較大優(yōu)勢。因此,如果使用鋁佐劑作為疫苗,則抗原與鋁凝膠的吸附性成為極重要的因素。專利文獻(xiàn)1WO91/03552專利文獻(xiàn)2WO01/004333專利文獻(xiàn)3WO00/060050專利文獻(xiàn)4WO2001/083794專利文獻(xiàn)5WO2002/067983專利文獻(xiàn)6WO2002/074336專利文獻(xiàn)7WO00/015251專利文獻(xiàn)8WQ99/52549
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供對于新型流感病毒、特別是免疫原性低的新型病毒,以低的抗原水平即可有效、且引起副作用反應(yīng)少的吸附滅活全病毒流感疫苗及其制備方法。解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明人等對上述問題進(jìn)行了深入的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將提高對人的免疫原性、引起副作用少的佐劑與滅活全病毒體病毒組合,可實現(xiàn)上述目的,從而完成了本發(fā)明。即,本發(fā)明如下所示。吸附滅活流感疫苗,該流感疫苗含有由碳酸鈉和碌u酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠、以及全病毒體流感病毒作為有效成分。[l]所述的疫苗,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。[1]或[2]所述的疫苗,其中,該疫苗具有以下性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上,以及(2)全病毒體流感病毒的血凝素活性為總血凝素活性的80%以上。[1]~[3]中任一項所述的疫苗,其中,鋁濃度為0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4~100pgHA/mL。[1]~[4]中任一項所述的疫苗,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中,以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色譜時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。[6][1][5]中任一項所述的疫苗,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000~30000倍倍率的電子顯孩支鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80%以上保持全病毒體形態(tài)。[1][6]中任一項所述的疫苗,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。吸附滅活流感疫苗的制備方法,該吸附滅活流感疫苗含有全病毒體流感病毒作為有效成分,制備方法的特征在于使用不含有表面活性劑和醚類的溶劑進(jìn)行下述(1)(5)的步驟(1)培養(yǎng)流感病毒以制備病毒懸浮液的步驟;(2)通過過濾或離心純化上述病毒懸浮液的步驟;(3)用福爾馬林使上述純化的病毒液滅活的步驟;(4)將上述滅活的病毒液過濾,制備病毒原液的步驟;以及(5)將上述病毒原液中的流感病毒吸附于氫氧化鋁凝膠上的步驟。[8]所述的制備方法,其中,氫氧化鋁凝膠由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備而成。[10][8]或[9]中任一項所述的制備方法,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。預(yù)防或減輕流感的方法,該方法包含將有效量的吸附滅活流感疫苗給予對象,其中,所述淀滅活流感疫苗含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠、以及全病毒體流感病毒作為有效成分。[ll]所述的方法,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。[11]或[12]所述的方法,其中,該方法具有下述性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上;以及(2)總血凝素活性為80%以上。[11]~[13]中任一項所述的方法,其中,鋁濃度為0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4-100pgHA/mL。[11]-[14]中任一項所述的方法,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中;以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色語時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。[11]~[15]中任一項所述的方法,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000~30000倍倍率的電子顯樣史鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80%以上保持全病毒體形態(tài)。[11]-[16]中任一項所述的方法,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。由碳酸鈉和碌u酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠以及全病毒體流感病毒在吸附滅活流感疫苗的制備中的應(yīng)用。[18]中所述的應(yīng)用,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。[20][18]或[19]中所述的應(yīng)用,其中,該應(yīng)用具有下述性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上;以及(2)總血凝素活性為80%以上。[18][20]中任一項所述的應(yīng)用,其中,鋁濃度為0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4-100//gHA/mL。[18]~[21]中任一項所述的應(yīng)用,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中;以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色鐠時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。[18]~[22]中任一項所述的應(yīng)用,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000-30000倍倍率的電子顯微鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80°/。以上保持全病毒體形態(tài)。[18]~[23]中任一項所述的應(yīng)用,其中,流感病毒是由選自H2和H4-H16型以及選自Nl~N9型的組合而形成的亞型。商業(yè)包裝,該商業(yè)包裝包含上述[1][7]中任一項所述的吸附滅活流感疫苗、以及記載了可將或應(yīng)將該疫苗用于預(yù)防或減輕流感的說明。發(fā)明效果才艮據(jù)本發(fā)明,可以提供以全病毒體流感病毒為有效成分、可以以少的抗原水平誘導(dǎo)對人的有效的免疫應(yīng)答、且引起副反應(yīng)少的新型流感疫苗、吸附滅活全病毒流感疫苗,可以確實地應(yīng)對新型流感的世界性流行。本發(fā)明的疫苗含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠(鹽)作為佐劑,因此可以以少的抗原水平誘導(dǎo)對人的有效的免疫應(yīng)答,可充分確保流感疫苗的供應(yīng)量。根據(jù)本發(fā)明的吸附滅活全病毒流感疫苗的制備方法,通過良好保持病毒顆粒的抗原性,可以提供誘導(dǎo)有效10的免疫應(yīng)答、且引起副反應(yīng)少的新型流感疫苗。附圖簡述圖l表示本發(fā)明的病毒原液和疫苗的制備步驟的概略圖。圖2表示比較例的病毒原液和疫苗的制備步驟的概略圖。圖3是表示使用實施例2和比較例2的凝膠制備的疫苗在動物中的免疫原性的圖表。圖4是表示使用通過B法制備的吸附滅活新型流感疫苗、以20歲-40歲健康成年男性為對象實施I期試驗的結(jié)果的圖表。圖5是由實施例1(A法)、比較例1(B法)分別制備的病毒原液的電子顯微鏡照片。圖6是表示對于由實施例1(A法)、比較例1(B法)分別制備的病毒原液進(jìn)行解析性蔗糖密度梯度離心的分析結(jié)果的圖表。圖7A和圖7B是分別表示對于由實施例1(A法)和比較例1(B法)制備的病毒原液進(jìn)行凝膠過濾HPLC分析的結(jié)果的圖表。圖8是表示I期臨床試驗中、疫苗接種后中和抗體效價的圖表。圖9是表示接種疫苗的小鼠的HI抗體生成的圖表。圖IO是表示豚鼠的異常毒性試驗結(jié)果的圖表。圖11是表示使用實施例2和比較例2的凝膠制備的疫苗中病毒的吸附率的圖表。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供吸附滅活流感疫苗,該疫苗含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠、以及全病毒體流感病毒作為有效成分。本發(fā)明的疫苗的特征在于含有由碳酸鈉和^5克酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠作為佐劑。使用所述凝膠,則可以顯著提高全病毒體病毒的吸附率,提高疫苗對人的免疫原性。作為佐劑的原料的碳酸鈉和硫酸鋁鉀可以無限定地使用通常用于制備氫氧化鋁凝膠而使用的試劑。硫酸鋁鉀優(yōu)選使用被稱為鉀明礬的辟u酸鋁鉀12水合物A1K(S04)2.12H20。氬氧化鋁凝膠的制備方法如后所述。本發(fā)明的疫苗的特征在于含有全病毒體流感病毒作為抗原。本發(fā)明中,流感病毒包含目前已知的所有亞型、以及將來可分離、鑒定的亞型。從目前未見在人群中流行、有效防止今后對人的感染的角度考慮,流感病毒優(yōu)選為由選自除HI和H3之外的HI~H16(即H2和H4-H16)型和選自NlN9型的組合而形成的亞型。這些亞型也被稱為新型流感病毒。上述亞型更優(yōu)選選自H5、H7和H9型與選自Nl~N9型的組合。流感病毒可以是屬于同一亞型的一種病毒林,也可以是屬于同一亞型的2種以上的病毒抹,還可以是屬于不同亞型的2種以上的病毒才朱。本發(fā)明中,全病毒體流感病毒是指保持病毒的形態(tài),從培養(yǎng)流感病毒得到的病毒懸浮液中純化而成的病毒顆粒。因此,本發(fā)明的流感疫苗是指除去含有亞病毒體的片段疫苗、以及含有純化HA或NA的亞單位疫苗之外的疫苗,也稱為全病毒疫苗。如上所述,本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過對上述全病毒疫苗使用具有高吸附率的佐劑,可以獲得以低的抗原水平即可有效且引起副作用反應(yīng)少的疫苗,特別是與其它疫苗比較時,即使在人以外的哺乳動物中未見免疫原性的差別,對人的免疫應(yīng)答也產(chǎn)生很大的差異,從而完成了本發(fā)明。上述全病毒體流感病毒優(yōu)選在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。將為了供給與氫氧化鋁凝膠的吸附而純化或濃縮的、含有全病毒體流感病毒的病毒液稱為"病毒原液"。流感病毒的純化或濃縮方法如后所述。為了制成以低的抗原水平即可有效且引起副反應(yīng)少的疫苗,本發(fā)明的疫苗優(yōu)選具有以下的(1)和(2)的性狀。(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上。該吸附率超過90%,則與上述全病毒體病毒的協(xié)同效果增大。其中,吸附率是指將氫氧化鋁凝膠和全病毒體流感病毒在生理鹽水中、在4-8。C下混合過夜,然后回收上清,測定上清的血凝素(HA)效價或蛋白質(zhì)量,或者測定吸附在凝膠上的蛋白質(zhì)量而求出的值。吸附率的詳細(xì)測定方法在實施例中有記載。吸附率更優(yōu)選95%以上,進(jìn)一步優(yōu)選97%以上。在全病毒體病毒相對于凝膠為過飽和的條件下混合時,吸附率可能低于90%,因此本發(fā)明中,在獲得了低于90。/。吸附率時,可以適當(dāng)減少抗原水平以達(dá)到90%以上。(2)全病毒體流感病毒的血凝素活性相對于總血凝素活性為80%以上。更優(yōu)選85%以上,進(jìn)一步優(yōu)選90%以上。該比例通過以下的操作進(jìn)行測定。在吸附到凝膠上之前,將滅活的病毒液通過嚴(yán)糖密度梯度離心等進(jìn)行分級。通常,全病毒體病毒聚集在40%左右的蔗糖濃度中,因此,所述比率可通過用該組分中的血凝素量除以所有組分的血凝素量來求出。另外,血凝素量可以以紅血球聚集能力為指標(biāo)、以HA效價的形式測定??傃氐?0%以上存在于全病毒體流感病毒中,這成為疫苗中的病毒顆粒幾乎保持完整形態(tài)的指標(biāo)。本發(fā)明的疫苗中,上述良好的全病毒體性在獲得上述協(xié)同效果方面是很重要的。對于病毒體的形態(tài),可通過下述方法確認(rèn)。i)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色語時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。吸收波語是否為沒有肩的單一峰,這可通過肉眼觀察由該高效液相色譜得到的語圖,按照該領(lǐng)域的常規(guī)判斷標(biāo)準(zhǔn)來確認(rèn)。ii)將病毒原液在20000~30000倍倍率的電子顯微鏡下觀察時,病毒的80%以上保持完整的顆粒形態(tài)。病毒的完整的顆粒形態(tài)是以在病毒體周圍觀察到HA和NA的突起為指標(biāo),觀察20~30個左右的病毒,求出完整的顆粒形態(tài)的病毒比例。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選鋁濃度為0.1mg/mL以上且〗氐于0.8mg/mL,更優(yōu)選0.2mg/mL以上且低于0.8mg/mL。上述濃度是由作為原料的鉀明礬的用量計算而得到的值?;蛘撸X的濃度也可通過原子吸光分13析求出。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選全病毒體流感病毒的濃度為3.4~100//gHA/mL,更優(yōu)選10~30//gHA/mL。上述濃度是通過測定全病毒體病毒蛋白的HA濃度而得到的值。蛋白質(zhì)的測定方法在實施例中有記載。本發(fā)明的疫苗除全病毒體流感病毒和氫氧化鋁凝膠之外,可以進(jìn)一步含有作為藥物可接受的載體。上述載體可使用在疫苗制備中通常使用的載體,具體可例舉鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、等滲性緩沖液以及它們的組合。還可以向其中適當(dāng)配合防腐劑(例如^5危柳汞)、等滲劑、pH調(diào)節(jié)劑和滅活劑(例如福爾馬林)等。本發(fā)明的疫苗可以全身給予,也可以局部給予。全身給予時,可以注射到肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等。局部給予時,可以給予鼻腔內(nèi)、咽頭部。給予方法例如有噴霧、涂布等。對本發(fā)明的疫苗的給予對象沒有特別限定,例如有包含人類的哺乳類、鳥類等。使用本發(fā)明的疫苗可以預(yù)防流感或減輕其癥狀。本發(fā)明^提供預(yù)防或減輕流感的方法,該方法包含將有效免疫致敏量的本發(fā)明的疫苗給予對象的步驟。疫苗的給予方法如上述例舉所示。給予量可考慮對象的年齡、性別、體重等來確定,作為抗原,通??梢詫?.750^gHA、優(yōu)選5~15^gHA給予1次或2次以上。優(yōu)選給予多次,這種情況下優(yōu)選間隔1~4周進(jìn)行給予。本發(fā)明提供上述吸附滅活流感疫苗的制備方法。本發(fā)明的制備方法的特征在于在制備全病毒體流感病毒作為抗原、將該病毒體吸附到作為佐劑的氫氧化鋁凝膠上的整個步驟中,使用不含有表面活性劑和醚類的溶劑。其中,表面活性劑是指在疫苗的制備領(lǐng)域中通常使用的所有的表面活性劑,例如有陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑等。為了不降低疫苗的免疫原性,大多使用非離子性表面活性劑,例如常用聚氧乙烯醚(Tween(注冊商標(biāo)))等。本發(fā)明的制備方法中不使用這些表面活性劑。另外,醚類是指在疫苗的制備領(lǐng)域中通常使用的所有的醚,例如有二乙醚等。本發(fā)明的制備方法中不使用這些醚類。(1)培養(yǎng)流感病毒以制備病毒懸浮液的步驟流感病毒可以是由感染動物或患者分離的病毒抹,也可以是在基因工程中由培養(yǎng)細(xì)胞建立的重組病毒。流感病毒的培養(yǎng)方法可以是將病毒接種到雞胚的尿嚢腔內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),也可以用病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞并對該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。采用雞胚時,培養(yǎng)條件是在3037。C下培養(yǎng)1-7天左右;采用培養(yǎng)細(xì)胞時,根據(jù)所使用的細(xì)胞設(shè)定培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)時間。培養(yǎng)結(jié)束后通過常規(guī)方法回收病毒懸浮液。(2)通過過濾或離心來純化上述病毒懸浮液的步驟對所得病毒懸浮液進(jìn)行離心或過濾以得到澄清的溶液。根據(jù)需要為了濃縮還可進(jìn)行超濾。之后,為了純化病毒進(jìn)行蔗糖密度梯度離心等超離心,由此獲得純化病毒液。(3)用福爾馬林滅活上述純化的病毒液的步驟對純化病毒液進(jìn)行滅活處理。病毒的滅活方法例如有福爾馬林處理、紫外線照射、P-丙內(nèi)酯等,優(yōu)選用福爾馬林進(jìn)行處理。福爾馬林處理的條件可適當(dāng)設(shè)定,例如使用0.02。/()(v/v)的福爾馬林溶液,在低溫下對病毒進(jìn)行數(shù)周的溫育處理。(4)過濾上述滅活的病毒液以制備病毒原液的步驟本步驟中,過濾病毒液以制備病毒原液。根據(jù)需要在過濾的同時還可以對病毒進(jìn)行濃縮。所述過濾包括超濾等。超濾可按照常規(guī)方法進(jìn)行。(5)使上述病毒原液中的流感病毒吸附在氫氧化鋁凝膠上的步驟流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附可以是將調(diào)節(jié)成規(guī)定的蛋白質(zhì)濃度的病毒原液與氫氧化鋁凝膠的懸浮液在4~8°C左右的低溫下混合數(shù)小時至一晚。氫氧化鋁凝膠可使用公知的物質(zhì),如上所述,優(yōu)選由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠。實施例以下,通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明,但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。實施例1病毒原液的制備和試制疫苗的制備(步驟A法)按照細(xì)菌制劑協(xié)會共通的方法制備病毒原液和試制疫苗,其概略如圖1所示。比較例1病毒原液的制備和試制疫苗的制備(步驟B法)在實施例1和圖1中,在病毒懸浮液的純化步驟中使用Tween(注冊商標(biāo))80,除此之外與實施例1同樣,制備病毒原液和試制疫苗。其概略如圖2所示。實施例2氫氧化鋁凝膠的制備將143.1g碳酸鈉溶解于9L生理鹽水中,過濾以制備碳酸鈉溶液。將316.0g硫酸鋁鉀12水合物(鉀明礬)溶解于9L生理鹽水中,過濾以制備轎u酸鋁鉀溶液。將所得碳酸鈉溶液和碌^酸鋁鉀溶液混合并攪拌。洗涂所得氫氧化鋁凝膠,作為本發(fā)明的佐劑使用。比較例2氫氧化鋁凝膠的制備在室溫下,邊攪拌邊向50.0mL0.21M氯化鋁水溶液(pH2.95)中緩慢滴加63.1mL0.50MNaOH水溶液,添加時間為55分鐘。添加完成時的pH為9.00。將上述溶液在室溫下進(jìn)一步攪拌30分鐘。此時的pH為9.00。將攪拌后的溶液在4X:下靜置21.5小時,得到113mL氫氧化鋁凝膠(pH8.4)。將所得氬氧化鋁凝膠在4。C下以2000rpm的轉(zhuǎn)數(shù)離心IO分鐘,通過過濾收集沉淀物。向12.5mL上述沉淀物中加入29.25mL0.01MPBS(pH7.1),確認(rèn)pH升高至9.4,在121。C下高壓滅菌20分鐘。高壓滅菌后的氬氧化鋁凝膠的pH為8.4。實施例3吸附滅活全病毒疫苗的制備將實施例1所得的病毒原液和實施例2所得的氫氧化鋁凝膠混合,得到吸附滅活全病毒疫苗。比較例3吸附滅活全病毒疫苗的制備將比較例1所得的病毒原液和比較例2所得的氫氧化鋁凝膠混合,獲得吸附滅活全病毒疫苗。試驗例1病毒對凝膠的吸附率接著,使用新型流感病毒(NIBRG-14抹)的滅活全病毒體研究抗原對各種鋁凝膠的抗原吸附率。除鉀明礬制氫氧化鋁凝膠(實施例2)、氯化鋁制氫氧化鋁凝膠(比較例2)之外,對于下述市售氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠也進(jìn)行測定,比較抗原吸附率。(試驗材料)(1)鋁凝膠1)氫氧化鋁凝膠"AluminumHydroxideGel(A-8222)"(SIGMA制備)13mg-Al/mL2)氫氧化鋁凝膠"Alhydrogel(2%),,(BrenntagBiosector制備)10.8mg-Al/mL3)磷酸鋁凝膠"Adju-Phos"(SuperfosBiosector制備)4.4mg-Al/mL(2)病毒懸浮液NIBRG-144朱滅活全病毒體流感病毒疫苗原液(FPBMZ0401,按照實施例1所述的方法制備)。(3)稀釋液1)0.01MPBS(-)2)生理鹽水(試馬全方法)將上述鋁凝膠與上述病毒懸浮液混合,回收上清。測定上清的蛋白質(zhì)含量和HA效價,分別計算吸附率。(抗原對鋁凝膠的吸附率的測定方法)(1)凝膠與抗原的混合在鋁凝膠懸浮液(相當(dāng)于0.3mg-Al的量)、病毒懸浮液(相當(dāng)于11.7、33.3或100yWg-蛋白的量)中加入稀釋液,使總液量為lmL,在冷室(48。C)中混合過夜。(2)上清回收離心混合液(TOMY微量高速離心機(jī)MC-150,1000rpm,5分鐘),回收上清?;厥盏纳锨遄鳛榈鞍踪|(zhì)含量測定用材料或HA效價測定用材料。(3)蛋白質(zhì)含量測定使用MicroBCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(PierceBiotechnology公司)測定上清的蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用試劑盒所附的BSA溶液。(4)HA效價測定上清的HA效價是按照日本國立感染癥研究所"病原體檢測手冊,,的"流感HA效價的測定"的項目進(jìn)行測定的。血細(xì)胞懸浮液使用0.5%雞紅細(xì)胞懸浮液。(5)吸附率計算用各檢樣的上清中的抗原含量除以不含有凝膠的對照檢樣的上清中的抗原含量,來計算吸附率(%)。(結(jié)果)使用0.01M-PBS作為稀釋液時的蛋白質(zhì)含量、由HA含量計算出的與各種市售鋁凝膠的吸附率的結(jié)果如表i所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>對滅活的NIBRG-14(H5N1亞型抹)或A/Wyoming/3/2003(H3N2亞型林)與氯化鋁制氫氧化鋁凝膠(比較例2中制備)和鉀明礬制氫氧化鋁凝膠(實施例2中制備)的吸附率進(jìn)行比較。使滅活的兩種病毒的終蛋白質(zhì)濃度為100^g/mL、鋁的終濃度為0.3mg/mL進(jìn)行混合,在室溫下溫育15分鐘。通過離心分離凝膠組分和上清,測定殘留在上清中的蛋白質(zhì)量,由此計算吸附率。結(jié)果如圖11所示。AAVyoming/3/2003與各種氫氧化鋁凝膠均良好地吸附,但是NIBRG-14與氯化鋁制氫氧化鋁凝膠的吸附性差,只與鉀明礬制氬氧化鋁凝膠顯示良好的吸附。由此顯示,當(dāng)H5N1亞型抹為抗原時,優(yōu)選使用鉀明礬制氫氧化鋁凝膠。試驗例2疫苗在動物中的免疫原性為了比較評價制備方法不同的氫氧化鋁鹽帶來的佐劑效果,制備添加了以氫氧化鋁凝膠(比較例2中制備)和鉀明礬作為原料的氫氧化鋁凝膠(實施例2中制備)2種鋁凝膠的滅活病毒抗原。將這些抗原按照每只ddY小鼠0.5、0.05,g(蛋白質(zhì)量)的量、間隔3周免疫2次。二次免疫2周后采血,使用所得血清測定ffl抗體效價(圖3)。由圖3顯示,在任何的給予組中,使用鉀明礬制氫氧化鋁凝膠作為佐劑的均顯示高抗體應(yīng)答。參者例1疫苗對人的有效性使用比較例3(B法)中制備的吸附新型流感疫苗試驗藥物,以20歲~40歲的健康成人男性為對象實施I期試驗。將該疫苗以3周的間隔皮下接種2次。按照每次接種1,7;/gHA(低用量)、5//gHA(中用量)和15HA(高用量)的三種抗原量進(jìn)行比較。按照疫苗接種前后對強(qiáng)烈反映病毒感染防御能力的中和抗體效價進(jìn)行比較,以此作為指標(biāo)。其結(jié)果如圖4所示,給予2次15//gHA的疫苗后,抗體效價為1:40以上的轉(zhuǎn)陽率為40%以下,并不另人滿意。參者例2疫苗對動物的有效性以HA抗體效價作為指標(biāo),對實施例3(A法)和比較例3(B法)中分別制備的新型流感疫苗對小鼠和兔的免疫原性進(jìn)行評價。使用小鼠的試驗中,對每組8~10只BLAB/c小鼠以3周的間隔下月支肌內(nèi)4妄19種2次含有滅活病毒抗原的氫氧化鋁凝膠(明礬)佐劑疫苗,濃度為0.04~3HA/只。二次免疫14天后測定小鼠血清的HI抗體效價,各組10只的平均ffl抗體效價顯示在表中。使用兔的試驗中,對每組3只的白色家兔肌內(nèi)分別給予15//gHA疫苗。結(jié)果如表2所示,試驗動物中,無法區(qū)分由A法、B法制備的疫苗的免疫原性的差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>試驗例3電子顯微鏡觀察將實施例1(A法)、比較例1(B法)中分別制備的原液置于鋪有Formvar膜的電子顯微鏡觀察用栽網(wǎng)(grid)上,用2%磷鵠酸染色后,以加速電壓120KV進(jìn)行觀察(圖5)。結(jié)果,以病毒體周圍觀察到HA和NA突起的病毒體作為完整病毒體時,在用A法制備的原液中,80%以上為完全病毒體,而用B法制備的原液中,幾乎未見完整病毒體。試驗例4蔗糖密度梯度離心對于由實施例1(A法)、比較例1(B法)分別制備的原液實施解析性蔗糖密度梯度離心。在15~60。/。的蔗糖密度梯度上鋪設(shè)(layer)1mL180^g/mL蛋白質(zhì)濃度的原液,在4。C下、以18000rpm離心約16小時。按照每種組分約0.5mL進(jìn)行分級,測定各組分的蔗糖濃度、HA活性和蛋白質(zhì)濃度。HA效價是使用雞紅細(xì)胞測定3次,將其幾何平均值制表。對于蛋白質(zhì)濃度,在將50/zL各組分轉(zhuǎn)印至PVDF膜后,用考馬斯亮藍(lán)染色,進(jìn)行密度分析(圖6)。在各原液中,蔗糖濃度約為40。/。的組分中可見HA活性和蛋白質(zhì)的峰。在A法中使用的HA活性的80%以上聚集在病毒峰中,在B法中,聚集率停留在50%以下。另外,B法中,在蔗糖濃度約17%的組分中也可見蛋白質(zhì)的峰,但未見HA活性。試驗例5凝力交過濾HPLC對于由實施例1(A法)、比較例1(B法)中分別制備的原液實施凝膠過濾HPLC。將原液用流動相(PBS)稀釋,使蛋白質(zhì)濃度為100^g/mL,以此作為試樣,對于A法、B法中分別制備的原液,按照以下條件、通過液相色譜法進(jìn)行分析。檢測器紫外吸光光度計(測定波長210,280nm)柱Tosoh制備的HPLC分析柱TSKgelG3000PWXL柱溫25。C附近的恒溫流動相0.01mol/L磷酸鈉緩沖溶液(注1)PBS(pH7.4)流量每分鐘約0.5mL(注1)0.01mol/L磷酸鈉緩沖溶液將0.238g磷酸二氫鉀、2.955g磷酸氫二鈉十二水合鹽溶解于水中,制成1000mL。附圖表示原液的凝膠過濾色i普(圖7A和圖7B,上部分210nm,下部分280nm)。圖7中,保留時間9.9分鐘觀察到預(yù)想為病毒體病毒的峰。在B法中,在保留時間10.9分鐘時觀察到肩。試驗例6臨床試驗的免疫原性制備添加了實施例1中制備的氫氧化鋁凝膠的吸附新型流感疫苗試驗藥物,以20~40歲的健康成人男性為對象實施I期試驗(圖8)。將該疫苗以3周的間隔皮下或肌內(nèi)接種2次。以每次接種1.7HA(低用量)、5^gHA(中用量)和15^gHA(高用量)三種抗原量進(jìn)行比較。在疫苗接種前后對強(qiáng)烈反映出病毒感染防御能力的中和抗體效價進(jìn)行比較,以此作為指標(biāo)。高用量接種群中,皮下接種群為73%,肌內(nèi)接種群中,所有例子中抗體效價升高4倍以上。中用量接種群中,皮下接種群為58%,肌內(nèi)接腫群中可見抗體效價升高至75%。由此可以確認(rèn),添加了氬氧化鋁凝膠的吸附流感疫苗在很多情況下對人也會引發(fā)免疫應(yīng)答。試驗例7小鼠HI抗體的生成以ffl抗體效價作為指標(biāo),對于添加實施例1中制備的氬氧化鋁凝膠(明礬)作為佐劑的新型流感疫苗對小鼠的免疫原性進(jìn)行評價。小鼠每組10只,以3周的間隔于下肢皮下或肌內(nèi)2次接種含有0.04~3//gHA/只滅活病毒抗原的有明礬制劑和無明礬制劑。二次免疫14天后測定小鼠血清的HI抗體效價,各組10只的平均ffl抗體效價如圖9所示。圖9中,在皮下和肌內(nèi)給予的任何組中,與無明礬制劑相比,有明礬制劑給予組的HI抗體效價高。由此可知,通過添加明礬,與未添加組相比,可引發(fā)高的抗體效價。試驗例8疫苗的安全性異常毒性試馬全在豚鼠中進(jìn)行添加實施例1中制備的氫氧化鋁凝膠(明礬)作為佐劑的新型流感疫苗的異常毒性試驗。檢樣是HA/mL滅活病毒抗原+0.3mg/mL明礬、30,gHA/mL滅活病毒抗原、0.3mg/mL明礬和生理鹽水。將5mL各檢樣分別接種給各3只豚鼠,觀察體重變化。各組3只的體重變化的平均值如圖IO所示。接種后第1天,在有明礬、無明礬制劑接種組中均見體重減少,有明礬制劑中,自第2天起體重增加,第7天升高至生理鹽水接種組。在無明鞏接種組中,至第7天均未升高至生理鹽水接種組。由此可認(rèn)為,抗原與明礬結(jié)合可抑制其副反應(yīng)。產(chǎn)業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明,可以提供以低的抗原水平即可對人誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答、且引起副反應(yīng)少的新型流感疫苗,可以確實地應(yīng)對新型流感的世界性流行。本申請是以在日本申請的日本特愿2006-271295(申請日2006年10月2日)為&出,其全部內(nèi)容均包含在本說明書中。權(quán)利要求1.吸附滅活流感疫苗,該流感疫苗含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠、以及全病毒體流感病毒作為有效成分。2.權(quán)利要求1所述的疫苗,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。3.權(quán)利要求1或2所述的疫苗,其中,該疫苗具有以下性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上,以及(2)全病毒體流感病毒的血凝素活性為總血凝素活性的80°/。以上。4.權(quán)利要求1~3中任一項所述的疫苗,其中,鋁濃度為0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4~100〃gHA/mL。5.權(quán)利要求1~4中任一項所述的疫苗,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中,以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色鐠時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。6.權(quán)利要求1~5中任一項所述的疫苗,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000~30000倍倍率的電子顯微鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80%以上保持全病毒體形態(tài)。7.權(quán)利要求1~6中任一項所述的疫苗,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。8.吸附滅活流感疫苗的制備方法,該吸附滅活流感疫苗含有全病毒體流感病毒作為有效成分,制備方法的特征在于使用不含有表面活性劑和醚類的溶劑進(jìn)行下述(1)(5)的步驟(1)培養(yǎng)流感病毒以制備病毒懸浮液的步驟;(2)通過過濾或離心純化上述病毒懸浮液的步驟;(3)用福爾馬林使上述純化的病毒液滅活的步驟;(4)將上述滅活的病毒液過濾,制備病毒原液的步驟;以及(5)將上述病毒原液中的流感病毒吸附于氫氧化鋁凝膠上的步驟。9.權(quán)利要求8所述的制備方法,其中,氳氧化鋁凝膠由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備而成。10.權(quán)利要求8或9中任一項所述的制備方法,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。11.預(yù)防或減輕流感的方法,該方法包含將有效量的吸附滅活流感疫苗給予對象,其中,所述吸附滅活流感疫苗含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠、以及全病毒體流感病毒作為有效成分。12.權(quán)利要求11所述的方法,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。13.權(quán)利要求11或12所述的方法,其中,該方法具有下述性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90°/。以上;以及(2)總血凝素活性為80%以上。14.權(quán)利要求11~13中任一項所述的方法,其中,鋁濃度為0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4~100//gHA/mL。15.權(quán)利要求11-14中任一項所述的方法,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中;以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色i普時,280nm的吸收波i普為沒有肩的單一的峰。16.權(quán)利要求11~15中任一項所述的方法,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000~30000倍倍率的電子顯微鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80%以上保持全病毒體形態(tài)。17.權(quán)利要求11~16中任一項所述的方法,其中,流感病毒是由選自H2和H4H16型以及選自Nl-N9型的組合而形成的亞型。18.由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠以及全病毒體流感病毒在吸附滅活流感疫苗的制備中的應(yīng)用。19.權(quán)利要求18中所述的應(yīng)用,其中,全病毒體流感病毒是在表面活性劑和醚類的非存在下,由病毒懸浮液純化而成。20.權(quán)利要求18或19中所述的應(yīng)用,其中,該應(yīng)用具有下述性狀(1)全病毒體流感病毒與氫氧化鋁凝膠的吸附率為90%以上;以及(2)總血凝素活性為80%以上。21.權(quán)利要求18~20中任一項所述的應(yīng)用,其中,鋁濃度為O.lmg/mL以上且低于0.8mg/mL,全病毒體流感病毒的濃度為3.4~100〃gHA/mL。22.權(quán)利要求18~21中任一項所述的應(yīng)用,其中,與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性狀(i)通過解析性蔗糖密度梯度離心法分析病毒原液時,總血凝素活性的80%以上聚集在病毒顆粒組分中;以及(ii)將病毒原液供給凝膠過濾高效液相色i普時,280nm的吸收波譜為沒有肩的單一的峰。23.權(quán)利要求18-22中任一項所述的應(yīng)用,其中,在將與氫氧化鋁凝膠混合前的病毒原液用20000~30000倍倍率的電子顯微鏡觀察時,病毒原液中的流感病毒中,病毒的80%以上保持全病毒體形態(tài)。24.權(quán)利要求18~23中任一項所述的應(yīng)用,其中,流感病毒是由選自H2和H4-H16型以及選自NlN9型的組合而形成的亞型。25.商業(yè)包裝,該商業(yè)包裝包含上述權(quán)利要求1~7中任一項所述的吸附滅活流感疫苗、以及記載了可將或應(yīng)將該疫苗用于預(yù)防或減輕流感的說明。全文摘要本發(fā)明公開對于新型流感病毒、特別是免疫原性低的新型病毒,以低的抗原水平即可有效且引起副作用反應(yīng)少的吸附滅活全病毒流感疫苗及其制備方法。本發(fā)明尤其公開含有由碳酸鈉和硫酸鋁鉀制備的氫氧化鋁凝膠以及分離的全病毒體流感病毒作為有效成分的吸附滅活流感疫苗、以及上述吸附滅活流感疫苗的制備方法,該方法的特征在于使用不含有表面活性劑和醚類的溶劑進(jìn)行各步驟。文檔編號A61K39/145GK101594881SQ20078004442公開日2009年12月2日申請日期2007年10月2日優(yōu)先權(quán)日2006年10月2日發(fā)明者五反田亨,后藤修郎,城野洋一郎,多田善一,瀧澤和幸,福家功,細(xì)井和男,荒井節(jié)夫申請人:財團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所;社團(tuán)法人北里研究所;電化生研株式會社;財團(tuán)法人阪大微生物病研究會