流感疫苗和治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明總體披露了M1多肽，所述M1多肽可用作疫苗和/或抗原，用于產(chǎn)生抗M1多肽抗體，用于預防性治療易受流感病毒感染的個體。本發(fā)明的抗M1多肽抗體可用于治療感染了流感病毒的個體，或可用于預防性治療易受流感病毒感染的個體，或用于不能產(chǎn)生有效抗體反應的免疫受抑制的個體。
【專利說明】流感疫苗和治療

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及Ml多肽類，包含Ml多肽類的疫苗，結合至Ml多肽類的抗體，以及使用 所述抗體的流感治療。本發(fā)明的抗體和多肽類還可用于診斷。

【背景技術】
[0002] 流感是由通過呼吸道飛沫傳播而擴散的流感病毒引起的一種急性、呼吸道傳染性 疾病。無并發(fā)癥的流感表征為突然發(fā)生的全身和呼吸道癥狀，所述癥狀通常在一周內(nèi)消除。 在某些人中，流感可能加重現(xiàn)有的身體狀況并可能導致危及生命的并發(fā)癥。流感病毒是世 界上最普遍存在的一種病毒，影響人類、犬類、鳥類和家畜。流感還對老年人和非常小的孩 子有重大影響。流感導致經(jīng)濟上的負擔、發(fā)病甚至死亡，是值得注意的。
[0003] 流感病毒是包膜、負義/負鏈RNA病毒，具有節(jié)段基因組屬于正粘病毒科。它們 根據(jù)其核心蛋白被分類為三種不同的類型：A、B和C (甲型、乙型、丙型）[Cox NJ，F(xiàn)ukudaK. Influenza. Infect. Dis. Clin. NorthAm. 1998; 12:27-38]。甲型流感病毒可以感染一定范圍 的哺乳動物和鳥類，而乙型（宿主范圍人類和海豹）和丙型基本上限于人類。甲型和乙型 流感病毒對人類患病負主要責任，其中甲型是最致病的。甲型和乙型流感病毒的主要抗原 決定簇是兩種表面糖蛋白：神經(jīng)氨酸酶（NA)和血凝素（HA)，兩者均能夠誘發(fā)人類的免疫應 答。HA參與受體結合和膜融合。NA促進子代病毒從受感染細胞的分裂、阻止病毒聚集、并 輔助運動通過粘膜呼吸道上皮細胞。
[0004] 目前已知三種類型的流感病毒（甲型、乙型和丙型)，甲型病毒對動物和人類狀況 負責，而乙型和丙型病毒尤其對人類是致病的。甲型病毒根據(jù)血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)(病毒包膜的主要糖蛋白）的抗原結構被細分成亞型。顯示出16種亞型的HA(H1-H16) 和9種亞型的NA(N1-N9)。甲型病毒的亞型因而由存在于病毒包膜中的HA亞型和NA亞型 來限定。野鳥構成所有甲型流感病毒亞型的儲存宿主。甲型流感病毒的某些亞型地方性地 或流行性地(年度流行疾病)感染家禽(不同的亞型包括H5N1和H9N2)，馬（主要是H3N8)，豬 (主要是H1N1，H3N2和H1N2)以及還有人類(主要是HlNl和H3N2)。狗、貓和其它野生物種 也可能偶爾被某些亞型(對于狗是H3N8和H5N1 ;對于貓是H5N1)感染。
[0005] 流行病兩次暴發(fā)之間的流感疫苗目前主要由在受精雞蛋中生長的病毒制備或 者是滅活流感疫苗或活流感疫苗。滅活流感疫苗由三種可能形式的抗原制劑組成：全滅 活病毒，亞病毒粒子，其中純化的病毒粒子用洗滌劑或其它試劑破壞以使脂質包膜(所謂 的"裂解"疫苗）或純化的HA和NA (亞單元疫苗）溶解。這些滅活疫苗目前可以進行肌 內(nèi)給藥（i.m.)，皮下給藥（s.c)，或者鼻內(nèi)給藥（i.n.)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)的建議， 季節(jié)性流感疫苗通常包含45ug的來自三種同時流行的人菌株的HA抗原(通過單向放射 免疫擴散（SRD)測量）（J. M. Wood 等人：An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand.5(1977)237_247;J.M.Wood 等人！International collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330))。它們 一般包含源自兩種甲型流感病毒株和一種乙型流感菌株(例如HlNl，H3N2和B)的抗原。標 準的0. 5ml可注射劑量在大多數(shù)情況包含(至少）15 μ g的來自各菌株的血凝素抗原成分。 疫苗接種在控制年度流感流行中起關鍵性作用。此外，在大流行期間，抗病毒藥可能不足以 或不能有效覆蓋需求，并且處于流感風險的個人數(shù)量要大于流行病兩次暴發(fā)之間期間的人 數(shù)。開發(fā)可能大量生產(chǎn)并具有有效分配和管理潛能的長效、廣泛保護性的疫苗是本發(fā)明的 一個目的。
[0006] 流感病毒每年影響數(shù)百萬人，在美國導致超過20萬人住院和2萬人死亡。此外， 流感的致命菌株間或出現(xiàn)(例如，1918年的西班牙流感)，幾乎沒有有效的治療方式。季節(jié)性 流感疫苗提供了某些保護，前提是致病株自疫苗配方時起沒有發(fā)生變化。血凝素和神經(jīng)氨 酸酶的表面表達的病毒蛋白的高變異性要求每年重新配方。種群/人類每年應進行再免疫 以便有效保護。這種必要性意味著生產(chǎn)成本高，并且可用性取決于對疫苗的每種病毒成分 的滴定度(可達到四種不同的病毒構成目前的疫苗)。
[0007] 目前已采用重組細胞培養(yǎng)方法而非雞蛋來生產(chǎn)抗原并且兩種疫苗產(chǎn)品最近已 被FDA批準。Flucelvax是通過哺乳動物細胞培養(yǎng)制成的重組病毒制劑（3種滅活病毒)。 Flubloc:?:是通過昆蟲細胞培養(yǎng)制成的重組HA疫苗（3種不同的HA蛋白）。這些產(chǎn)品尋求解 決疫苗供應的問題，但是沒有解決與基于HA的疫苗相關的抗原性漂移問題。
[0008] 本發(fā)明的一個目的是通過提供會年年保持效力的一種新的流感疫苗來克服每年 流感疫苗開發(fā)的需要和成本。本發(fā)明的另一目的是提供會不受新的流感（病毒）菌株感染 的流感疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供一種流感治療方法，以便治療已受流感感染的個體 或對個體進行預防性治療。
[0009] 本發(fā)明的一個目的是利用包括結合至Ml多肽的抗體或抗體片段的組合物減輕受 感染患者的流感病毒感染的嚴重程度，和/或縮短受流感病毒感染的患者的流感癥狀的持 續(xù)時間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及對應一部分的流感Ml蛋白的多肽。這些多肽對應來自蛋白的C-末端 區(qū)的Ml序列。在一個實施例中，至少一部分的Ml多肽序列已被發(fā)現(xiàn)對流感病毒是表面暴 露的，并因而是免疫防護的目標。在一個實施例中，多肽跨氨基酸殘基215-252。在一個實 施例中，多肽跨氨基酸殘基215-241。在另一個實施例中，Ml多肽跨氨基酸殘基220-236。 在一個實施例中，Ml多肽跨在殘基215-252找到的Ml多肽的7-37連續(xù)的氨基酸。在一個 實施例中，Ml多肽包括至少15-50個氨基酸。在一個實施例中，Ml多肽包括7,8,9,10,11， 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21，22,23,24, 25, 26,27,28,29,30,31，32, 33,34, 35,36， 37,38,39,40,41，42,43,44,45,46,47,48,49，和/或50個氨基酸。在一個實施例中^1多 肽用于在易患流感的生物體中產(chǎn)生保護性/治療性免疫應答。在一個實施例中，生物體是 人、犬、或商業(yè)上有價值的家畜。在一個實施例中，Ml多肽組合物能夠引起下述中的至少一 個：對所述Ml多肽的體液免疫反應、T-細胞免疫反應例如CD4T-細胞免疫反應和B細胞記 憶反應。
[0011] 本發(fā)明還涉及針對本發(fā)明的Ml多肽序列的抗體。在一個實施例中，抗Ml多肽抗 體用于治療受流感病毒感染的生物體。在一個實施例中，生物體是人、犬、或商業(yè)上有價值 的家畜。在一個實施例中，用抗Ml多肽抗體治療生物體減輕了流感癥狀的嚴重性和/或縮 短了流感癥狀的持續(xù)時間。
[0012] 在一個實施例中，抗Ml多肽抗體用于治療生物體以預防感染流感，或者改善未來 可能感染流感。在一個實施例中，生物體是人、犬、或商業(yè)上有價值的家畜。在一個實施例 中，抗Ml多肽抗體預防性地用于在生物體中產(chǎn)生被動免疫。在一個實施例中，生物體是人、 犬、或商業(yè)上有價值的家畜。
[0013] 在一個實施例中，抗Ml多肽抗體在生物體中具有1-4周的半衰期。在一個實施例 中，抗Ml多肽抗體在生物體中具有2周的半衰期。在一個實施例中，在生物體中產(chǎn)生的被 動免疫持續(xù)2-3個半衰期。
[0014] 在一個實施例中，抗Ml多肽抗體被工程設計為具有4-12周的半衰期。在一個實 施例中，抗Ml多肽抗體是嵌合的、人化的、或人工程化的、或是完全的人型抗體。在一個實 施例中，抗Ml多肽抗體與增大生物體中半衰期的分子結合。在一個實施例中，抗Ml多肽抗 體與聚乙二醇結合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1示出了被2B-B10-G9抑制的PR/8的蝕斑抑制試驗。
[0016] 圖2示出了被2B-B10-G9抑制的其它流感菌株的蝕斑抑制試驗。

【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明通過示例的方式而非限制的方式進行發(fā)明。
[0018] 如本文所用，"抗體"是指蛋白，所述蛋白在功能上定義為結合蛋白質，而在結構上 定義為包括被識別為源自免疫球蛋白編碼基因的框架區(qū)的氨基酸序列?？贵w可以包括一 個或多個多肽，所述多肽基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼。識別的免 疫球蛋白基因包括 κ (kappa)、λ (lambda)、a (alpha)、Y (gamma)、δ (delta)、ε (epsilon)和μ (mu)恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為κ (kappa)或 λ (lambda)。重鏈被分類為 Y (gamma)、y (mu)、a (alpha)、5 (delta)、或 ε (印silon)，依次定義免疫球蛋白類別，分別為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
[0019] 已知的通常免疫球蛋白（抗體)結構單元包括四聚物。每個四聚物由兩對相同對的 多肽鏈組成，每對具有一個"輕"鏈(約25kD)和一個"重"鏈(約50-70kD)。每個鏈的N-端 定義主要負責抗原識別的約100-110或更多的氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈（')和可變 重鏈（V h)分別是指這些輕鏈和重鏈。
[0020] 抗體作為完整的免疫球蛋白或作為多個良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白 酶消化鉸鏈區(qū)內(nèi)二硫鍵下面的抗體以產(chǎn)生F(ab)' 2, Fab'的二聚物本身天然是通過二硫鍵 鏈接至VH-CHl-鉸鏈的輕鏈。F(ab) ' 2可以在溫和的條件下被還原以斷開鉸鏈區(qū)中的二硫 鍵，從而將F(ab) ' 2二聚物轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區(qū)的部分的Fab (見，F(xiàn)undamental Immunology，W. E. Paul, ed.，RavenPress, N. Y. (1993)，更詳細的描述其 它抗體片段)。盡管不同的抗體片段根據(jù)完整抗體的消化來定義，本領域普通技術人員會理 解可通過化學方法或者通過利用重組DNA方法從頭合成片段。因此，術語抗體如本文所用 還包括通過修飾整個抗體產(chǎn)生或利用重組DNA方法合成的抗體片段。優(yōu)選的抗體包括V h-' 二聚物，包括單鏈抗體(作為單個多肽鏈存在的抗體)，例如單鏈Fv抗體（sFv或scFv)，其中 可變重區(qū)和可變輕區(qū)連在一起(直接或通過肽鏈接）以形成連續(xù)的多肽。單鏈Fv抗體是共 價連接的V h-'異源二聚體，可由包括直接連接或通過肽編碼連接肽連接的Vh-和 編碼 序列的核酸表達，（例如，Huston 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。盡 管Vh和 '被連接成各自為單個多肽鏈，Vh和 '域非共價關聯(lián)?？商鎿Q地，抗體可以是另一 片段。還可以產(chǎn)生其它片段，包括使用重組技術。例如Fab分子可以展示在噬菌體上，如果 鏈(重鏈或輕鏈)中的一個融合至g3衣殼蛋白，并且互補鏈輸出至周質作為可溶分子。兩個 鏈可以在相同或不同的復制子上編碼；每個Fab分子中的兩個抗體鏈翻譯后組裝并且二聚 物經(jīng)由將鏈中的一個鏈接至g3p被結合入噬菌體顆粒(見，例如，美國專利號5, 733, 743)。 scFv抗體和多個其它結構將自然聚集但化學上分開的輕多肽鏈和重多肽鏈從抗體V區(qū)轉 換成基本類似于抗原結合部位/位點的結構的折疊成三維結構的分子對于本領域技術人 員來說是已知的(見，例如，美國專利號5, 091，513, 5, 132, 405,和4, 956, 778)。尤其優(yōu)選的 抗體包括所有那些在噬菌體上展示的或利用載體通過重組技術產(chǎn)生的抗體，其中鏈在載體 上作為可溶性蛋白質分泌，例如scFv, Fv，F(xiàn)ab, (Fab'）2?？贵w還可包括雙鏈抗體和微型抗 體。
[0021] 本發(fā)明的抗體還包括重鏈二聚物，例如來自駱駝科動物的抗體。由于駱駝科動物 中的重鏈二聚物IgG的V h區(qū)不必要與輕鏈發(fā)生疏水性相互作用，重鏈中通常接觸輕鏈的區(qū) 在駱駝科動物中被變成親水性氨基酸殘基。重鏈二聚物IgG的V h域被稱為Vhh域。
[0022] 駱駝科動物中，抗體譜的多樣性由Vh或Vhh區(qū)中的互補決定區(qū)（⑶R) 1，2和3確 定。胳中的⑶R3通過其平均16個氨基酸的相對較長長度表征（Muyldermans等人， 1994, Protein Engineering? (9) :1129)。這與許多其它物種的抗體的CDR3區(qū)形成對照。 例如，小鼠 Vh的CDR3平均為9個氨基酸。
[0023] 駱駝科動物衍生的抗體可變區(qū)的庫（保持駱駝科動物的可變區(qū)的體內(nèi)多樣性）可 例如通過
【公開日】為2005年2月17日的美國專利申請序列號20050037421所披露的方法制 得。
[0024] 如本文所用，術語"自然發(fā)生（naturallyoccurring) "表示組分被單個基因編碼， 所述基因沒有被重組方式改變并且預先存在于生物體中，例如由初始細胞或暴露于抗原的 細胞形成的抗體庫中。
[0025] 如本文所用，術語"抗原"是指在適當條件下能夠引起特定免疫應答并與該應答的 產(chǎn)物反應的物質，例如與特定抗體或特別致敏T-淋巴細胞或兩者?？乖梢允强扇苄晕?質，例如毒素和異種蛋白，或微粒，例如細菌和組織細胞；不過，只有已知為抗原決定簇(表 位）的蛋白質或多糖分子的部分與抗體或淋巴細胞上的特定受體組合。更廣泛來說，術語 "抗原"可用于指抗體所結合的任何物質，或者抗體希望的任何物質，不管該物質是否產(chǎn)生 免疫性。對于所述抗原，抗體可通過重組的方法識別，不依賴于任何免疫應答。
[0026] 如本文所用，術語"表位"是指特定B細胞和/或T細胞應答的抗原或半抗原上的 位點。該術語也可與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點"互換使用。表位包括能夠形成與 抗體的可變區(qū)結合口袋相互作用的結合作用的抗原或其它高分子的那部分。
[0027] 如本文所用，術語抗體的"結合專一性"是指抗體所結合的抗原的身份，優(yōu)選指抗 體結合的表位的身份。
[0028] 如本文所用，術語"嵌合多核苷酸"表示多核苷酸包括野生型區(qū)域和突變區(qū)域。它 還可表示多核苷酸包括來自一個多核苷酸的野生型區(qū)域和來自另一相關多核苷酸的野生 型區(qū)域。
[0029] 如本文所用，術語"互補性決定區(qū)"或"⑶R"是指本領域認可的術語，如由Kabat 和Chothia不例。CDR還一般被稱為高變區(qū)或高變環(huán)（Chothia和1^81^(1987)】]\1〇1· Biol.196:901 ;Chothia 等人（1989) Nature342:877 ;Ε·Α· Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987);和 Tramontane)等人（1990) JMoh Biol. 215 :175)。"框架區(qū)"或"FR" 是指側 翼于CDR的V域的區(qū)。CDR和框架區(qū)的位置可利用本領域各種公知的定義來確定，例 如 Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT),和 AbM (見， 例 如，Johnson 等人，supra ;Chothia&Lesk，1987，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.J.MoI.Biol. 196,901-917;Chothia C.等人，1989,Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature342,877-883 ;ChothiaC.等人，1992，structural repertoire of the human VH segmentsj. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani 等人，J. Mol. Bioll997, 273 (4))?？?原結合部位/位點的定義在下述文獻也有描述：Ruiz等人，IMGT, the international ImMunoGeneTics database, Nucleic Acids Res.，28, 219-221 (2000);和 Lefranc, Μ· _Ρ· IMGT, the international ImMunoGeneTics database,Nucleic Acids Res. , Janl ；29 (I)： 207-9 (2001);MacCallum 等人,Antibody-antigen interactions ：Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol.，262 (5)，732-745 (1996);和 Martin 等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989) ; Martin 等人，Methods Enzymol·，203, 121-153， (1991) ;Pedersen 等人，Immunomethods，l, 126,（1992);和 Rees 等人，In Sternberg M. J.E. (ed. ), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-1721996)。
[0030] 如本文所用，術語"半抗原"是小分子，當連接至較大載體例如蛋白質時，所述小分 子可引起生物體內(nèi)的免疫應答，例如產(chǎn)生特定與之結合的抗體(游離態(tài)或者結合態(tài))。"半抗 原"能夠結合至預成抗體，但是可能自身不能刺激抗體生成。在本發(fā)明的上下文中，術語"半 抗原"包括改性的氨基酸，自然發(fā)生或者非自然發(fā)生。因此，例如，術語"半抗原"包括自然 發(fā)生的改性氨基酸，例如磷酸酪氨酸，磷酸蘇氨酸，磷酸絲氨酸，或硫酸化殘基，例如硫酸化 酪氨酸(硫化酪氨酸)，硫酸化絲氨酸(硫化絲氨酸)，或硫酸化蘇氨酸(硫化蘇氨酸）；并且還 包括非自然發(fā)生的改性的氨基酸，例如P-硝基-苯丙氨酸。
[0031] 如本文所用，術語"宿主細胞"是指原核或真核細胞，其中可引入、表達和/或繁殖 本發(fā)明的載體。微生物的宿主細胞是原核或真核微生物的細胞，包括細菌、酵母、微觀真菌 以及真菌和黏菌的生命周期中的微觀相。通常的原核宿主細胞包括大腸桿菌的各種菌株。 通常的真核宿主細胞是酵母或絲狀真菌，或哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞，鼠科動 物NIH3T3成纖維細胞，人胚胎腎193細胞，或嚙齒動物骨髓瘤或雜交瘤細胞。
[0032] 如本文所用，術語對組合物或疫苗的"免疫應答"是在宿主中形成對關注的組合物 或疫苗的細胞和/或抗體介導的免疫應答/反應。通常，"免疫應答"包括但不限于一種或 多種下述效應：產(chǎn)生抗體、B細胞、輔助性T細胞、和/或細胞毒性T (淋巴）細胞，特定指向 包括在關注的組合物或疫苗中的抗原。優(yōu)選地，宿主會展示治療性或保護性免疫反應，使得 對新感染的抵抗力會增強和/或疾病的臨床嚴重程度會降低。所述保護將通過減少或缺少 通常由受感染宿主展示的癥狀、更快的恢復時間和/或受感染宿主內(nèi)降低的病毒滴度來展 /Jn 〇
[0033] 如本文所用，術語"隔離的/分離的（isolated) "是指不僅從存在于核酸或多肽的 自然源的其它核酸或多肽分離而且還從多肽并優(yōu)選是指發(fā)現(xiàn)僅在溶劑、緩沖液、離子、或其 它通常存在于上述的溶液中的組分中存在的(如果有的話）核酸或多肽分離的核酸或多肽。 術語"隔離/分離的"和"純化的"不包括以其自然來源存在的核酸或多肽。
[0034] 如本文所用，術語"純化的"表示所述核酸或多肽以基本上沒有其它生物大分子例 如多核苷酸、蛋白質等等而存在。在一個實施例中，多核苷酸或多肽被純化，以便它構成至 少按重量計95%，更優(yōu)選至少按重量計99. 8%的所述生物大分子存在(但可以存在水、緩沖 液、和其它小分子尤其是分子量小于1000道爾頓的的分子)。
[0035] 如本文所用，術語"重組核酸"是指在自然界通常不能找到的形式的核酸。也就是 說，重組核酸側翼是非天然側翼于核酸的核苷酸序列或者該重組核酸具有的序列通常不能 在自然界中找到。重組核酸可以最初通過用限制性核酸內(nèi)切酶處理核酸在體外形成，或者 可替換地使用例如聚合酶鏈反應的技術。應當理解，一旦重組核酸被制成并被再次引入宿 主細胞或生物體，它會非重組地復制，即，利用宿主細胞的體內(nèi)細胞機制而非體外處理；不 過，所述核酸一旦重組產(chǎn)生，盡管隨后非重組地復制，仍然被認為是為本發(fā)明的目的的重組 體。
[0036] 如本文所用，術語"重組多肽"是指由重組核酸表達的多肽，或者在體外化學合成 的多肽。
[0037] 如本文所用，術語"重組變異"是指利用重組DNA技術產(chǎn)生的通過氨基酸插入、刪 除和置換不同于自然發(fā)生的多肽的任何多肽?？梢酝ㄟ^比較具體多肽的序列與同源肽的序 列并且使高同源性區(qū)中所做的氨基酸序列變更的數(shù)量最小化找到確定哪些氨基酸殘基可 以被置換、添加或刪除而不破壞關注的活性例如酶活性或結合活性的引導。
[0038] 優(yōu)選地，氨基酸"置換"是用具有相似結構和/或化學性質的另一氨基酸置換一氨 基酸的結果，即，保守氨基酸置換。氨基酸置換可根據(jù)所涉及殘基在極性、電荷、溶解度、疏 水性、親水性、和/或兩親性的相似性進行。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯（基）丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、和谷氨酰胺；正電荷(堿性）氨基酸包 括精氨酸、賴氨酸、和組氨酸；以及負電荷(酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0039] 如本文所用，術語"組庫（repertoire)"或"庫（library) "是指編碼抗體或抗體 片段例如？&13、8(^1?(1、^：、￥ 11、或八，或由自然系綜獲得的可變區(qū)的亞片段(例如交換盒）的 基因庫，或者存在的抗體基因（例如在人類供體）的"組庫"，并主要從外周血和脾臟的細胞 獲得。在一些實施例中，人類供體是"非免疫性的"，即，不存在感染的癥狀。在當前的發(fā)明 中，庫或組庫通常包括V區(qū)的給定部分的交換盒的成員。
[0040] 如本文所用，術語"合成抗體庫"是指編碼一個或多個抗體或抗體片段(例如Fab， scFv，F(xiàn)d，LC，Vh，或'，或可變區(qū)的亞片段例如交換盒）的基因庫，其中一個或多個互補決定 區(qū)（CDR)已部分或全部被例如寡核苷酸定點誘變而改變。"隨機化"表示編碼CDR的序列的 部分或全部已被隨機編碼所有二十個氨基酸或一些氨基酸子集的序列置換。
[0041] 如本文所用，術語"多價"表示疫苗包含來自具有不同氨基酸序列的至少兩種流感 病毒分離（物）的Ml多肽，或者疫苗包含來自一種流感病毒分離（物）的Ml多肽和來自 不同于Ml多肽分離物的另一流感病毒分離物的抗原制劑。
[0042] 如本文所用，術語"哺乳動物"是指溫血脊椎動物，所有這些動物具有毛發(fā)并且哺 乳自己的幼子。
[0043] 如本文所用，術語"蛋白（質）"、"肽"，"多肽"和"多肽片段"在本文中可互換使 用，表示任何長度的氨基酸殘基的聚合物。聚合物可以是線性或分支的，它可包括改性的氨 基酸或氨基酸類似物，并且它可被不同于氨基酸的化學組成部分中斷。所述術語還涵蓋已 經(jīng)自然或通過干預而得以改性的氨基酸聚合物，例如，二硫鍵形成、糖化、脂化、乙?；⒘?酸化、或任何其它的處理或修飾（改性），如與標記或生物活性成分相共軛。
[0044] 如本文所用，術語"異源性"當用于指多核苷酸的部分時表示核酸包括兩個或更多 個子序列，所述子序列通常在自然界不能找到彼此相同的關系。例如，核酸通常重組產(chǎn)生， 具有兩個或更多個序列，例如由不相關的基因排列以形成新的功能性核酸。相似地，"異源 性"多肽或蛋白質是指兩個或更多個在自然界不能找到彼此相同關系的子序列。
[0045] 單數(shù)術語"一（a) "，"一（an)"，和"所述（the)"包括多數(shù)對象，除非上下文明確另 外指出。相似地，單詞"或（or)"旨在包括"和（and)"，除非上下文明確另外指出。關于物 質例如抗原的濃度或程度的給定的數(shù)值限制旨在表示近似值。因此，當濃度表示為至少(例 如）200 μ g時，它旨在表示濃度應被理解為至少近似"大約"或"約" 200 μ g。 Ml多狀
[0046] 本發(fā)明涉及在人體或人群中引起免疫應答尤其是初次免疫應答來抵抗流感病毒 的一種方法，所述方法包括管理Ml多肽組合物，所述Ml多肽組合物包括本發(fā)明的Ml多肽 或其抗原制劑。在一個實施例中，免疫應答在初始的（nai've)、免疫妥協(xié)的、或先前受感染的 人體或人群中獲得。
[0047] M-蛋白質或基質蛋白Ml是流感病毒的主要結構成分。M基因編碼兩種蛋白質，Ml 和M2。Ml蛋白在所有甲型流感病毒的亞型中是高度保守的，其很大程度上是更為臨床相關 的流感亞型。我們的數(shù)據(jù)顯示一部分的Ml蛋白質被暴露，并考慮到其高序列保守性，表示 通用亞單位疫苗免疫原的極佳目標，前提是可以引起針對表面暴露區(qū)的適當?shù)拿庖邞稹?br> [0048] 在一個實施例中，目標Ml多肽跨Ml蛋白質的C-末端的氨基酸殘基，尤其是 Ml蛋白質的氨基酸殘基215-252,或215-240,或220-236。在一個實施例中，Ml多肽 是 GTHPSSSAGLKNDLLEN, AMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK，或是由來自該序列 的 7,8, 9,10,11，12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21，22,23,24, 25,26,27,28, 29,30,31， 32, 33, 34, 35, 36, 37和/或38個氨基酸的連續(xù)氨基酸構成的多肽。在一個實施例中， 本發(fā)明的Ml多肽包括自然發(fā)生的菌株變體，例如，A/Bangkok/163/2000(GTHPSSSTGLKN DLLEN) ；A/PR/8/34(GTHPSSSAGLKNDLLEN) ；A/AA/Huston/1945(GTHPSSSAGLKDDLLEN) ；A/ Berlin/6/2006(GTHPSSSTGLKNDLLDN) ；A/Brandenburg/l/2006(GTHPNSSTGLKNDLLEN) ；A/ BrevigMission/1/1918(GTHPSSSAGLKDDLIEN) ；A/Chile/8885/2001(GTHPSSSTGLKDDLLE N) ；A/DaNang/DN3I1/2008(GTHPSSSTGLRDDLLEN) ；A/FLff/1951(GTRPSSSAGLKDDLLEN) ；A/ Fff/1/1950(GTHPRSSAGLKDDLLEN) ；A/Fiji/15899/83(GTHPSSSAGLKNDLFEN) ；A/Fort Mon mouth/l-MA/1947(GTHPSSSAGLKDNLLEN) ；A/HaNoi/TX233/2008(GTHPSSSTGLKSDLLEN) ；A/ Iowa/CEID23/2005(GTHPNSSTGLKDDLLEN) ；A/Malaysia/35164/2006(GTHPSSSTGLKKDLLD N) ；A/Managua/4086. 04/2008(GTHPSSSNGLKNDLLEN) ；A/Texas/VR06-0502/2007(GTHPSSS TGLRNDLLEN) ；A/WSN/1933(GTHPSSSAGLKSDLLEN) ；A/Colorado/18/201I(GTHPSSSAGLRDDL LEN) ；A/Kentucky/04/2010(GTHPNSSAGLKDDLLEN) ；A/Maryland/28/2009(GTHPSSSAGLKD DLLGN) ；A/New Mexico/05/2012(GTHPSSSSGLRNDLLEN) ；A/Phillipines/TMC10-135/2010 (GTHPSSSAGLRDDLLDN) ；A/Singapore/GP4307/2010(GTHPSSSAGLKDDLLDN) ；A/Singapore/ GP489/2010(GTHPSSSAGLKDALLEN) ；A/Boston/14/2007(GTHPSSSTGLRDDLLEK) ；A/Brisban e/09/2006(GTHPSSSTGLRDNLLEN) ；A/Hong Kong/CUH34175/2002(GTHPSSSNGLRDDLLEN) ；A/ Kyrgyzstan/WRAIR1256P/2008(GTHPSSSTGLRDDLLGN) ；A/Malaysia/12550/1997(GTHPSSSTG LRDDLLDN) ；A/Nanjing/1663/2010 (GTHPSSSTGLRGDLLEN) ；A/ffyoming/08/2010(GTHPSSSTGL RDDLLIN) ；A/Berkeley/1/1968 (GTPPSSSAGLKNDLLEN) ；A/Korea/426/1968(GTPPSSSAGLKDDL LEN)。
[0049] 在一個實施例中，本發(fā)明的Ml多肽包括來自220-238, GTHPSSSAGLKNDLLENLQ的序 列，或具有下述置換的一個或多個的變體：在222處的H變成R或N，在224處的S變成R或 N，在227處的A變成T或N，在230處的K變成R，在231處的N變成D，S，或K，在232處的 D變成N或G，在234處的L變成F或I，在235處的E變成D，H，或K，在236處的N變成H 或K。 220 238 GTHPSSSAGLKNDLLENLQ RR T RDNFDH NN N SG I H IC K K
[0050] 在一個實施例中，本發(fā)明的Ml多肽涵蓋下述序列變體： 220 238 GTXPXSSXGLXXXLXXXLQ 其中X=任何氨基酸。
[0051] 本發(fā)明的Ml多肽能夠預防流感。也就是說，它們能夠刺激動物中的免疫應答。抗 原可包括單獨或與載體共軛（結合）或存在于支架的Ml多肽；包含具有免疫原性的插入的 重組載體；表位、半抗原、或者它們的任何組合。
[0052] 本發(fā)明的Ml多肽涵蓋Ml多肽的免疫原性片段和變體。因此，術語"免疫原性或 抗原性的多肽"還考慮到對序列的刪除、添加和置換，只要多肽起到產(chǎn)生本文所定義的免疫 應答的作用。術語"保守變化"表示用另一生物學上相似的殘基置換氨基酸殘基，或者置換 核酸序列中的核苷酸以便編碼的氨基酸殘基不改變或者是另一結構上、化學上或其它方面 功能上相似的殘基。在這點上，尤其優(yōu)選的置換一般會是性質上保守的，即，在氨基酸族內(nèi) 發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸一般被分為四個族：（I)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；（2)堿 性-賴氨酸，精氨酸，組氨酸；（3)非極性-丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙 氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和（4)不帶電荷的極性-甘氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸， 絲氨酸，蘇氨酸，和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸有時被分類為芳香族氨基酸。保守 變體的示例包括用一個疏水殘基，例如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個疏 水殘基，或者用一個極性殘基置換另一個極性殘基，例如用精氨酸置換賴氨酸，谷氨酸置換 天冬氨酸，或者谷氨酰胺置換天冬酰胺，等等；或者用結構上相關的不會對生物活性具有大 影響的氨基酸類似保守的置換氨基酸。因此，具有與參照分子基本上相同的氨基酸序列但 具有基本不影響蛋白質的免疫原性的較小的氨基酸置換的蛋白質在參照多肽的定義之內(nèi)。 通過這些修飾產(chǎn)生的所有多肽都包括在此。術語"保守變化"還包括使用置換的氨基酸代 替未置換的母氨基酸，假如對置換的多肽引起的抗體同樣與未置換的多肽進行免疫反應。
[0053] "變體"Ml多肽旨在表示基本上類似的序列。對于多核苷酸，變體包括在天然多核 苷酸內(nèi)的一個或多個位點/部位刪除和/或添加一個或多個核苷酸和/或在天然多核苷酸 的一個或多個位點/部位置換一個或多個核苷酸。如本文所用，"天然/自然（native)"多 核苷酸或多肽分別包括自然形成的核苷酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的具體多核苷酸的變 體（即參照多核苷酸）還可通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參照多核苷酸編碼的 多肽之間的序列一致性的百分比來進行評價。"變體"蛋白質旨在表示通過在天然蛋白質的 一個或多個位點/部位刪除或添加一個或多個氨基酸和/或在天然蛋白質的一個或多個位 點/部位置換一個或多個氨基酸而由天然蛋白質獲得的蛋白質。本發(fā)明涵蓋的變體蛋白質 是生物活性的，也就是說，它們具有引起免疫應答的能力。
[0054] 來自其它流感菌株和亞型的Ml多肽的同系物旨在包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本 文所用，術語"同系物"包括類似物和橫向（旁系）同源物。術語"類似物"指的是具有相同 或相似功能但在不相關的宿主生物體內(nèi)單獨演化的兩種多核苷酸或多肽。術語"橫向（旁 系）同源物"指的是通過在基因組內(nèi)復制而相關的兩種多核苷酸或多肽。橫向（旁系）同 源物通常具有不同的功能，但是這些功能可能相關。野生型流感多肽的類似物和橫向（旁 系）同源物可通過轉譯后修飾、氨基酸序列差異或兩者不同于野生型流感多肽。具體的 說，本發(fā)明的同系物一般表現(xiàn)為與野生型流感多肽或多核苷酸序列至少80%-85%，85%-90%， 90%-95%，或95%，96%，97%，98%，99%的序列一致性，并且會表現(xiàn)相似的功能。變體包括等位 基因變異體。術語"等位基因變異體"指的是包含多態(tài)性的多核苷酸或多肽，所述多態(tài)性導 致蛋白質的氨基酸序列中的變化并存在于天然群體內(nèi)（例如病毒種類或變種)。所述天然等 位基因變異可通常導致多核苷酸或多肽中的1%_5%的變化。等位基因變異體可通過排序多 個不同種類中的關注的核酸序列來識別，這可通過利用雜交探針以識別在這些種類中的相 同基因位點來容易地進行。任何和所有所述核酸變化和所得到的氨基酸多態(tài)性或變化旨在 包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述多態(tài)性或變化為天然等位基因變異的結果并且不改變關注基 因的功能活性。
[0055] 如本文所用，術語"衍生物"或"變體"指的是Ml多肽或編碼Ml多肽的核酸，其具 有一個或多個保守氨基酸變化或其它微小修飾，使得（1)當與野生型多肽比較時相應的多 肽具有基本上等同的功能，或者（2)針對多肽引起的抗體與野生型多肽進行免疫反應。這些 變體或衍生物包括具有流感多肽一級氨基酸序列的微小修飾/改性的多肽，可導致與未修 飾/改性的對應多肽相比具有基本上等同的活性的肽。所述修飾/改性可以是故意的，例 如通過定點誘變，或者可以是自發(fā)的。術語"變體"還考慮到對該序列的刪除、添加和置換， 只要多肽起到產(chǎn)生如本文所定義的免疫應答的作用。術語"變體"還包括多肽的修飾/改 性，其中天然信號肽被置換為異源信號肽，以促進自宿主種的多肽的表達或分泌。術語"變 體"還可包括"模擬表位（mimitopes) "，其是完全不同的蛋白質序列但結構相似，也引起交 叉免疫反應。
[0056] 本發(fā)明的Ml多肽還可包括氨基酸序列，用于引入糖基化位點或其它位點以便修 飾/改性或衍生Ml多肽。在一個實施例中，上述本發(fā)明的Ml多肽可包括氨基酸序列N-X-S 或N-X-T，可充當糖基化位點。在糖基化過程中，低聚糖鏈連接至在三肽序列N-X-S或N-X-T 中出現(xiàn)的天冬酰胺酸（N)，其中X可以是除Pro (脯氨酸）外的任何氨基酸。該序列被稱為 糖基化序列子。該糖基化位點可以位于N-端，C-端，或者在用于Ml多肽的Ml蛋白質序列 的內(nèi)部序列內(nèi)。
[0057] 本發(fā)明的任何Ml多肽還可用于半抗原共軛物/結合物中。所述共軛物/結合物 可以使用合適的載體多肽和/或支架多肽以便向生物體免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)Ml多肽表位。例如， Ml-多肽可被插入單克隆抗體的⑶R3或完全置換⑶R3。在這種情況，最大的佐劑效應會通 過使用與免疫主體不同物種/種類的單克隆抗體支架獲得。這些Ml-多肽半抗原可以增加 或形成對Ml多肽的免疫應答。合適的載體分子在本領域是公知的并且包括，例如，KLMP 白蛋白，霍亂毒素，白喉毒素和破傷風毒素。
[0058] 用于制備和純化DNA構建體的分子生物學的標準技術能夠制備用本發(fā)明的Ml多 肽的半抗原共軛物/結合物。這些分子生物學技術可用于制得編碼半抗原共軛物/結合物 的基因構建體，并且制得表達構建體以便在合適的宿主細胞中制造半抗原?？商鎿Q地，本發(fā) 明的半抗原可利用標準多肽技術將本發(fā)明的Ml多肽與載體或支架多肽共軛/結合來制得。 盡管分子生物學的標準技術因而足以用于生產(chǎn)本發(fā)明的半抗原，但所披露的特定半抗原提 供了新型的治療。
[0059] 在本發(fā)明的一個方面，提供了單價或多價例如二價、三價或四價組合物，所述組合 物包括Ml多肽并且還可包括滅活流感病毒或減毒流感病毒或其抗原制劑，用于降低由流 感病毒株引起的流感感染的嚴重性或預防由流感病毒株引起的流感感染，所述流感病毒株 是存在于所述一級（主要）免疫原組合物中的菌株的抗原變體。在本發(fā)明的一個實施例中， 多價組合物的滅活或減毒流感病毒用于血清B型流感。 免疫應答和功效
[0060] 在一個實施例中，本發(fā)明的Ml多肽疫苗能夠就中和抗流感的抗體引起體液反應， 如通過中和抗體滴度和血清轉換率（SCR)以便中和抗體應答的幾何平均滴度（GMT)(定義 為疫苗的百分比，在第〇天沒有可檢測到的抗體，而疫苗接種后在中和抗體滴度增加至滴 度1:28或者具有4-倍或更大的增加）來測量。
[0061] 在另一具體實施例中，所述接種疫苗還或另外產(chǎn)生針對流感的CD4T細胞免疫應 答和/或B細胞記憶應答。在一個特定的實施例中，病人是血清反應陰性的或對疫苗株是 無免疫的（即，不具有預先存在的免疫性)。在一個實施例中，施行所述Ml多肽組合物可替 換地或額外地引起B(yǎng)-記憶細胞反應，如通過在遇到抗原后能夠分化成分泌抗體的漿細胞 的外周血B淋巴細胞的頻率來測量。
[0062] 本發(fā)明的流感藥劑/藥物恰當?shù)貪M足疫苗的某些國際標準。國際上適用標準來 測量流感疫苗的功效。根據(jù)歐洲藥物檢驗局（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)對人用藥的標準來評價血清學變量（CHMP/BWP/214/96，Committee for Proprietary Medicinal Products(CPMP)0Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997.(注意對流感疫苗的要求的協(xié)調，1997。）CHMP/BWP/214/ 96circularN° 96-0666:1-22)，以便進行與流感疫苗的年度許可程序相關的臨床試驗(表 1A)。對于成年人人群（18-60歲）和老年人群（>60歲）的要求是不同的(表1A)。對于流行 病兩次暴發(fā)之間的流感疫苗，針對包括在疫苗內(nèi)的所有流感株，至少一個評價(血清轉化因 子，血清轉化率，血清保護率)應滿足歐洲要求。等于或大于1:40滴度的比例被認為最相關， 因為這些滴度預期是最佳當前可得到的相關保護[Beyer W等人，1998. Clin Drug Invest，； 15:1-12]。
[0063] 由歐洲健康管理當局定義的70%血清保護率（CHMP-Committee for Medicinal Products for Human Use,人用藥品委員會）是年度季節(jié)性流感疫苗通常要求滿足的三個 標準之一并且CHMP也希望大流行候選疫苗要滿足。
[0064] 不過，數(shù)學模型表明在群體水平，僅30%對抗原飄移的一種或多種異株有效的疫 苗也可能在幫助降低大流行的程度上是有益的，并且使用對大流行株具有30%功效（30%的 交叉保護）的(先前大流行的）疫苗的大流行疫苗接種活動可有效降低臨床發(fā)病率達75%并 因此在群體中降低發(fā)病率/死亡率。因此，本發(fā)明的加速的初次免疫是用于實現(xiàn)流感流行 的早期緩解或在源頭抑制出現(xiàn)流感株。
[0065] FDA已經(jīng)發(fā)布了對支持流行性流感疫苗的許可證所需的臨床數(shù)據(jù)的指南草案 (CBER 草案標準）（可從 the Office of Communication, Training and Manufacturers Assistance (HFM-40)，1401Rockville Pike，Suite200N，Rockville，Md. 20852-1448 獲得， 或者通過撥打電話1-800-835-4709或301-827-1800獲得，或者從網(wǎng)頁http：//www. fda. gov/cber/guidelines. htm獲得)，并且所提議的標準也是基于CHMP標準。FDA使用了稍微 不同的年齡分界點。適當?shù)亩它c類似地包括：1)獲得HI抗體滴度1:40的主體的百分比， 和2)血清轉化率，定義為接種疫苗后HI抗體滴度四倍的上升。幾何平均滴度（GMT)應該 被包括在結果中，但是數(shù)據(jù)應該不僅包括點估計，還要包括血清轉化發(fā)生率的95%置信區(qū) 間的下界，并且第42天1:40的HI滴度的發(fā)生率必須滿足或超過目標值。因此應提供這些 數(shù)據(jù)和這些評估的點估計的95%置信區(qū)間（Cl)。FDA指南草案要求兩個目標都要滿足。 [0066] 因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了本發(fā)明所要求保護的組合物、方法或用途，其 中通過施行Ml多肽組合物引起的免疫應答或保護滿足流感疫苗功效的所有三個EU監(jiān)管標 準。下述標準的適當?shù)闹辽僖粋€、適當?shù)膬蓚€或者三個滿足于組合物的流感菌株：[0119] 在血清陰性人群中血清轉化率為>30%，>40%，>50%; [0120]在血清陰性人群中血清保護率 為>60%，>70%，>80% ; [0121]在血清陰性人群中血清轉化因子為>2. 0, >2. 5, >3. 0, >4. 0。 流感病毒
[0067] 甲型流感病毒連續(xù)地演化，結果發(fā)生抗原變異（Johnson NP, Mueller J. Updating the accounts ：global mortality of thel918_1920" Spanish''influenza pandemic. Bull. Hist. Med. 2006;76:105-115)。在流行病兩次暴發(fā)之間的期間，傳播的流感病毒與以前流行 的那些病毒相關。病毒在人群中傳播，與早期生活的感染具有不同程度的免疫性。所述傳 播在通常2-3年的時間段并缺乏病毒RNA聚合酶的有效校對，導致高轉錄錯誤率，可導致表 面糖蛋白的氨基酸替換，并且促進選擇新菌株，所述新菌株已經(jīng)足夠改變來引起普通人群 中的再次流行；該過程被稱為'抗原（性）漂移'。
[0068] 分段的病毒基因組允許第二種類型的抗原變異。在不可預知的間隔中，如果兩種 或更多種流感病毒同時感染宿主細胞，基因重配會導致新型流感病毒。這里，所得到的抗原 可與先前在人群中傳播的菌株的相應蛋白質有20%-50%的變化。該現(xiàn)象（稱作"抗原轉變 (antigenic shift)"）可能產(chǎn)生具有新表面或內(nèi)部蛋白質的新型病毒，其逃脫'群體免疫' 并形成流感大流行。
[0069] 這些抗原變化（'漂移'和'轉變'）是不可預知的并且從免疫學角度可具有巨大 影響，因為它們最終導致出現(xiàn)新的流感菌株并且使得病毒能夠逃脫免疫系統(tǒng)引起公知的幾 乎每年的流行病。
[0070] 除了每年的流行病，新出現(xiàn)的能夠有效人對人傳播的流感病毒在過去已經(jīng)引起了 疾病大流行，即，突然的全球性的流行疾病在所有年齡組具有較高的傳染性和死亡率。上世 紀已經(jīng)見證了三次流感大暴發(fā)流行，1918-1919年的"西班牙流感（Spanish Flu) "，全球死 亡2000萬至5000萬人，1957年的"亞洲流感（Asian Flu) "和1968年的"香港流感（Hong Kong Flu)"。
[0071] 流感大流行的流感病毒株的特征是：與當前傳播株中的血凝素相比它包含新的血 凝素，可能伴隨有或不伴隨有神經(jīng)氨酸酶亞型的變化；它能夠在人群中橫向傳播；并且它 對人類是致病的。新的血凝素可以是在較長的一段時間在人群中不明顯的血凝素，可能至 少十年，例如H2上一次傳播是在1957年，或者它可以是之前從未在人群中傳播的血凝素， 例如H5, H9, H7或H6,它們通常在鳥類中發(fā)現(xiàn)。在這些情況下，大比例(例如H2的情況）或 整個（H5, H7, H6或H9的情況）群體對流感大流行的流感病毒株是無免疫的。目前，被WHO 認定為可能在人類引起流感流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，根據(jù) 本發(fā)明所用的流感流行疫苗會適當?shù)匕℉5N1病毒。其它包括在所要求保護的組合物中 的合適的菌株是H9N2, H7N1，H7N7或H2N2。
[0072] 本發(fā)明的Ml多肽不易受所述抗原變異的影響，因為（1)編碼本發(fā)明Ml多肽的選定 的區(qū)域流感病毒基因組還編碼M2蛋白質的一部分；和（2)流感的Ml和M2蛋白質是主要嵌 入在病毒顆粒中的結構蛋白。由于這兩個理由，Ml蛋白在流感株中具有較少的序列變異，并 且有可能具有較小的能力來支持在表面暴露的抗原例如血凝素中看到的快速的抗原（性） 漂移。 DNA疫苗
[0073] 本發(fā)明的Ml多肽還可作為DNA疫苗引入生物體。本發(fā)明的DNA疫苗會編碼本發(fā) 明的Ml多肽。這些編碼的Ml多肽可能存在于具有載體多肽的編碼的融合蛋白或融合入支 架多肽。
[0074] 用于制備和純化DNA構建體的分子生物學的標準技術能夠制備本發(fā)明的DNA治療 齊U。盡管分子生物學的標準技術足以生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)品，本文所披露的特定構建體提供了 新型治療劑。
[0075] 待被引向疫苗受體的可表達DNA的量取決于用于DNA構建體的轉錄和翻譯啟動子 的強度，以及表達的基因產(chǎn)品的免疫原性。一般，約1 μ g-lmg的免疫或預防性有效劑量(并 優(yōu)選為大約l〇yg-3〇〇yg)被直接施加入肌肉組織。還可以考慮皮下注射，皮內(nèi)引入，通過 皮膚壓印，以及其它施加（給藥）模式，例如腹膜內(nèi)，靜脈，或吸入給藥。還可以考慮提供加 強疫苗接種。
[0076] DNA可以是裸露的，也就是說，不與任何蛋白質、佐劑或影響受體的免疫系統(tǒng)的其 它制劑相關聯(lián)。在這種情況，希望DNA在生理學上可接受的溶液，例如但不限于無菌鹽水或 無菌緩沖鹽水?？商娲?，DNA可與脂質體類相關聯(lián)，例如卵磷脂脂質體或其它本領域已知 的脂質體，為DNA-脂質體混合物，（例如參見W093/24640)或者DNA可與本領域已知的佐劑 相關聯(lián)以促進免疫應答，例如蛋白質或其它載體。還可使用幫助細胞攝取DNA的制劑，例如 但不限于，鈣離子、病毒蛋白質和其它轉染促進劑，以使優(yōu)點突出。這些制劑一般稱為轉染 促進劑和藥學上可接受的載體。如本文所用，術語基因指的是編碼離散的多肽的核酸的片 段。術語藥物和疫苗可以互換使用，以表示可用于引起免疫應答的組合物。術語構建體和 質粒/質體可以互換地使用。術語載體用于表示DNA，其中根據(jù)本發(fā)明的方法基因可被克隆 入DNA以供使用。
[0077] DNA疫苗配方包括脫金屬化的溶液，該溶液包含生理學上可接受的緩沖液（pH范 圍從至少大于約8. 0至約至少9. 5)，可達到約300mM的范圍的鹽(包括但不限于NaCl，KCl 或LiCl )，和金屬離子螯合劑EDTA (可達到約5mM的范圍）與自由基清除劑乙醇(可達到約 3%的范圍)組合，以及無菌玻璃瓶中最恰當?shù)腄NA濃度，包裝以保護高度純化的無核酸酶的 DNA不受光照并在生理學上可接受的緩沖液中。在本發(fā)明的一個特定方面，DNA疫苗配方包 括EDTA和乙醇的組合，NaCl的濃度在從約IOOmM至約200mM，EDTA的范圍從約1 μ M至約 1禮，乙醇存在的量可達到大約2%，所有都在無菌玻璃瓶中最恰當?shù)腄NA濃度，包裝以保護 高度純化的無核酸酶的DNA不受光照并在生理學上可接受的緩沖液中。
[0078] 本發(fā)明的DNA疫苗包括由于遺傳密碼而簡并的序列，例如，用于特定宿主的優(yōu)化 密碼子。如本文所用，"優(yōu)化"指的是遺傳工程以增加其在給定物種中的表達的多核苷酸。 為了提供編碼流感病毒多肽的優(yōu)化的多核苷酸，流感蛋白基因的DNA序列可以被修飾/改 性以1)包括被具體物種中高度表達的基因優(yōu)選的密碼子；2)包括在所述物種中實質發(fā)現(xiàn) 的核苷酸堿基組合物中的A+T或G+C含量；3)形成所述物種的初始序列；或者4)消除引起 RNA的脫穩(wěn)定化、不適當?shù)亩嗑巯佘账峄?、降解和終止，或者形成二級發(fā)夾結構或者RNA剪 接位點。流感病毒蛋白在所述物種的增加的表達可以通過利用在真核細胞和原核細胞中的 密碼子使用的分布頻率或者在具體物種中獲得。術語"優(yōu)選的密碼子使用的頻率"指的是 在使用核苷酸密碼子中由特定宿主細胞表現(xiàn)的優(yōu)選（偏好）以指定給定的氨基酸。有20 種天然氨基酸，大部分被一種以上的密碼子規(guī)定。因此，所有簡并核苷酸序列被包括在本發(fā) 明中，只要由核苷酸序列編碼的流感多肽的氨基酸序列在功能上不改變。
[0079] 雜交反應可以在不同的"嚴謹"條件下進行。增加雜交反應嚴謹性的條件是公 知的。請見，例如 "Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，第二版（Sambrook 等人， 1989)。
[0080] 制成和實施本發(fā)明的DNA疫苗的其它細節(jié)可在美國專利號7, 927, 870中找到，該 專利文獻在此被援引入本文。 疫苗制各
[0081] 制備Ml多肽在本領域是公知的。希望純度和足夠濃度以誘導免疫應答的Ml多肽 與生理學上可接受的載體混合。生理學上可接受的載體在疫苗所用的劑量和濃度下對受體 是無毒的。一般，疫苗被制成用于注射，通常為肌肉注射或皮下注射。用于注射的合適的載 體包括無菌水，但優(yōu)選是生理鹽水溶液，例如生理鹽水或緩沖鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水 或者林格乳酸鹽。疫苗一般包含佐劑?？捎玫淖魟┌≦S21(皂皮樹，商用可從Cambridge Biotech，Worcester，Mass.獲得)，其刺激細胞毒T-細胞，和明研X氫氧化錯佐劑)。還可使 用能增強細胞或局部免疫的不同佐劑的配方。尤其是，免疫增強劑例如細胞因子類可被包 括在疫苗中。合適的免疫增強細胞因子的示例包括白細胞介素，例如白細胞介素-2(IL-2) 和白細胞介素-12 (IL-12),以及腫瘤壞死因子-a (TNF-a)。
[0082] 可存在于疫苗的其它賦形劑包括低分子量多肽(小于約10個殘基)，蛋白質，氨基 酸，碳水化合物包括葡萄糖或葡聚糖，螯合劑例如EDTA，以及穩(wěn)定蛋白質或抑制微生物生長 的其它賦形劑。
[0083] 本發(fā)明的疫苗還可包含特定設計以表達誘導細胞毒T-細胞反應的蛋白質的一種 或多種工程病毒。合適的工程病毒源自例如金絲雀痘病毒，牛痘病毒，腺病毒，減毒的人類 皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒)，和水痘帶狀皰疹。示例性工程病毒被修飾/改性以表達能 夠誘導細胞毒T-細胞反應的Ml多肽。通過實施一個或多個劑量的Ml多肽序列以促進免 疫應答可跟隨Ml多肽疫苗的免疫。
[0084] 在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的以供使用的初級組合物被佐劑化。在一個特定實 施例中，佐劑是水包油乳液佐劑或佐劑體系。在一個實施例中，水包油乳液包括可代謝油和 乳化劑，以及可選的留醇和/或母育酚例如a-生育酚。在另一個特定實施例中，所述水包 油乳液佐劑包括至少一種可代謝油，量為總容量的〇. 5%_20%，并具有油滴，其中按強度至少 70%具有小于Iym的直徑。
[0085] 術語可代謝油的含義在本領域中是公知的?？纱x可被定義為'能夠通過代 謝轉化'（Dorland，s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，25th edition (1974))。油可以是任何植物油、魚油，動物油或合成油，對受體無毒并且能夠 通過代謝轉化。堅果、種子、和谷物是植物油的通常來源。合成油也是本發(fā)明的一部分， 可包括市場上可得的油，例如ΝΕ0ΒΕΕ?和其它油。尤其合適的代謝油是角鯊烯。角鯊烯 (2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四己烯）是不飽和油，在鯊魚肝油 中大量發(fā)現(xiàn)，在橄欖油、麥胚芽油、米糠油、和酵母中量較低，并是一種尤其適合本發(fā)明使 用的油。由于角鯊烯在膽固醇的生物合成的過程中被酶轉化的事實，角鯊烯是可代謝油 (Merck index, 10th Edition, entry no. 8619)。在一個實施例中，可代謝油存在的量為免 疫原性組合物的總量的〇. 5%-20% (最終濃度)，合適的量是總量的1. 0%-10%，合適的量是總 量的2. 0%-6. 0%。在一個特定實施例中，可代謝油存在的量是免疫原性組合物的總量的約 0. 25%-1.25°/〇 (v/v)〇
[0086] 合適的，本發(fā)明的水包油乳液體系具有在亞微米范圍的小油滴粒徑。合適的，油滴 粒徑在直徑為120-750nm的范圍內(nèi)，合適的尺寸在直徑為120-600nm。通常，水包油乳液包 含的油滴按強度至少70%為直徑小于500nm，尤其按強度至少80%直徑小于300nm，合適地 按強度至少90%直徑在120-200nm的范圍內(nèi)。
[0087] 本發(fā)明的水包油乳液還可包括甾醇和/或母生育酚例如生育酚，尤其是α -生 育酚。留醇在本領域是公知的，例如膽固醇是公知的并且例如披露于Merck Index, IIth Edn.，page341，為在動物脂肪中找到的自然存在的甾醇。其它合適的甾醇包括β-谷甾醇， 豆甾醇，麥角固醇和麥角鈣化醇。所述留醇合適存在的量為免疫原性組合物的總量的約 0. 01%-約20% (w/v)，合適的量在約0. 1%-約5% (w/v)。合適地，當甾醇是膽固醇時，其存 在的量在免疫原性組合物的總量的約〇. 02%和約0. 2% (w/v)之間，通常在0. 5ml疫苗劑量 容積中的量為約0.02% (w/v)。
[0088] 母生育酚(例如維生素 E)也經(jīng)常用于油乳佐劑（ΕΡ0 382 271 BI ;美國專利號 5,667,784 ;W095/17210)。用于本發(fā)明的油乳液中的母生育酚(可選的水包油乳液/乳劑） 可按EPO 382 271B1所述配制，其中母生育酚可以是母生育酚液滴的分散液，可選地包括 乳化劑，可選的直徑小于1微米?？商鎿Q地，母生育酚可以與另一種油結合使用，以形成油 相的油乳劑/乳液。本文披露了可與母生育酚結合使用的油乳劑/乳液的示例，例如上文 所述的可代謝油。
[0089] 水包油乳劑/乳液包括乳化劑。乳化劑可存在的量為免疫原性組合物的按重量計 約0. 01-約5. 0% (w/w)，合適地存在的量為按重量計約0. 1-約2. 0% (w/w)。合適的濃度 為總組合物的按重量計約〇. 5-約I. 5% (w/w)。
[0090] 乳化劑可以合適地是聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(聚山梨醇酯80或吐溫 80(Tween80))。在一個特定實施例中，0. 5ml疫苗劑量容積包含1% (w/w)吐溫80,而0. 7ml 疫苗劑量容積包含大約〇. 7% (w/w)吐溫80。在另一個特定實施例中，吐溫80的濃度是大 約0. 1%或大約0. 2% (w/w)。在一個方面，聚山梨醇酯80的量為每疫苗劑量大約4. 9mg，合 適地每疫苗劑量從約4. 6mg至約5. 2mg。在另一方面，聚山梨醇酯80的量為每疫苗劑量大 約2. 4mg，合適地每疫苗劑量從約2. 0至約2. 8mg。在另一方面，聚山梨醇酯80的量為每疫 苗劑量大約I. 2mg,合適地每疫苗劑量從約I. 0至約I. 5mg。在另一方面,聚山梨醇酯80的 量為每疫苗劑量大約〇. 6mg，合適地每疫苗劑量約0. 4-0. 8mg。
[0091] 水包油乳液佐劑可以與其它佐劑或免疫刺激劑一起使用，因此本發(fā)明的一個重要 實施例是水包油配方，包括角鯊烯或另一可代謝油，生育酚，例如α -生育酚，和吐溫80。水 包油乳劑/乳液還可包含司盤85 (Span85)(聚氧乙烯失水山梨醇油酸酯）和/或卵磷脂。 通常，水包油（乳劑）會包括免疫原性組合物的總量的約2-約10%的角鯊烯，2%-10%的 α -生育酚和約0. 3-約3%的吐溫80,并且可按照W095/17210中所述的步驟生產(chǎn)。合適的 角鯊烯：α -生育酚的比率等于或小于1，因為這提供了更為穩(wěn)定的乳劑/乳液。司盤85也 可以存在，例如約1%的水平。
[0092] 流感疫苗制劑可以在存在防腐劑例如硫柳汞下制備。合適地，防腐劑尤其是硫柳 汞存在的濃度為大約100 μ g/ml?？商鎿Q地，流感疫苗制劑在存在低水平的防腐劑例如硫柳 萊下制備，例如濃度不超過20 μ g/ml或合適地小于5 μ g/ml。在另一合適的可替換實施例 中，流感疫苗制劑在沒有硫柳汞的情況下制備。合適地，所得到的流感疫苗制劑在沒有有機 汞防腐劑的存在下是穩(wěn)定的；尤其是制劑不包含殘余硫柳汞。尤其是，流感疫苗制劑包括在 缺少硫柳汞下或在較低水平的硫柳汞(一般5 μ g/ml或更低）下穩(wěn)定的Ml多肽抗原。具體 地說，乙型（B型）流感菌株的穩(wěn)定由α-生育酚例如α-生育酚琥珀酸鹽(也被稱為維生 素 E琥珀酸鹽，即VES)的衍生物完成。所述制劑和制備它們的方法披露于W002/097072。
[0093] 一個劑量的佐劑的Ml多肽疫苗的容積可以在大約0. 25-lml之間，并通常對應于 成人配方的大約0. 5ml。合適地，0. 5ml的成人劑量對應于大約0. 25ml佐劑加上大約0. 25ml 抗原。每個疫苗劑量可包含大約15 μ gMl多肽。在可替換的實施例中，每個疫苗劑量包含較 低量的Ml多肽,例如小于大約15 μ g的量,合適地小于大約10 μ g。合適的量為大約2 μ g, 大約4 μ g，大約5 μ g，大約7. 5 μ g，或大約10 μ g的Ml多肽或者Ml多肽低于大約15 μ g的 任何合適量，確定所述量使得疫苗組合物滿足本文所定義的至少一個療效標準。有利地，可 使用大約1 μ g或者甚至更低例如約〇. 5 μ g的Ml多肽劑量，使得滿足上文所定義的監(jiān)管標 準。大約Iml的疫苗劑量(大約0. 5ml佐劑加上大約0. 5ml抗原制劑）也是合適的。大約 0. 25ml的疫苗劑量(例如，大約0. 125ml佐劑加上大約0. 125ml抗原制劑）也是合適的，特 別是對于兒科人群。一個劑量的Ml多肽疫苗的容積可以在大約0. 25-lml之間，并通常對 應于成人配方的大約0. 5ml。合適地，0. 5ml的成人劑量對應于大約0. 25ml佐劑加上大約 0. 25ml抗原。大約Iml的疫苗劑量(大約0. 5ml佐劑加上大約0. 5ml抗原制劑）也是合適 的。大約0. 25ml的疫苗劑量(例如，大約0. 125ml佐劑加上大約0. 125ml抗原制劑)也是合 適的，尤其是兒科人群。 免疫刺激劑
[0094] 在另一個實施例中，組合物可包括其它佐劑，尤其是TLR-4配體佐劑，合適地脂質 A的無毒衍生物。合適的TLR-4配體是3-de-O-?；膯瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)。其它合適 的TLR-4配體是脂多糖（LPS)和衍生物，MDP (胞壁酰二肽）和RSV的F蛋白質。
[0095] 在一個實施例中，組合物可另外包括Toll樣受體（TLR)4配體，例如脂質A的無毒 衍生物，尤其是單磷酸類脂A或更具體地是3-脫酰基單磷酰脂A (3D-MPL)。
[0096] 所述脂多糖（優(yōu)選是3D-MPL)可使用的量在1和50 μ g之間（免疫原性組合物 的每人劑量）。有利地，3D-MPL使用的水平為約25 μ g，例如在20-30 μ g之間，合適地在 21-29μ g之間或在22-28μ g之間或者在23-27μ g之間或在24-26μ g之間，或25μ g。在另 一個實施例中，免疫原性組合物的人劑量包括在大約10 μ g水平的3D-MPL，例如在5-15 μ g 之間，合適地在6-14 μ g之間，例如在7-13 μ g之間或者在8-12 μ g之間或者在9-11 μ g 之間，或1〇μ g。在另一個實施例中，免疫原性組合物的人劑量包括在大約5μ g水平的 3D-MPL，例如在1-9 μ g之間，或者在2-8 μ g之間或合適地在3-7 μ g之間或者4-6 μ g之間， 或 5μ g。
[0097] MPL的劑量合適地能夠增強人類中對抗原的免疫應答。尤其是，合適的MPL量是與 無佐劑的組合物相比或者與用另一 MPL量佐劑的組合物相比改善了組合物的免疫潛力，同 時反應性譜可接受。
[0098] 脂質A的合成衍生物是已知的，一些被描述為TLR-4激動劑，包括但不 限于：[0181] 0M174 (2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧四-癸酰氨 基]-4-0-磷-phono-, β . -D-批喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠-.a . -D-批 喃葡萄糖基磷酸二氫鹽)，（W095/14026) [0182]0M294DP(3S，9R)-3-[(R)_十二烷酰氧四癸 酰氨基]-4-氧-5-氮雜-9 (R)-[(R)-3-h-氫氧四癸酰氨基]decan-1，10-二醇，1，10-雙 (二氫磷酸酯）（W099/64301 和 W000/0462) [0183]0M197MP-AcDP(3S-，9R)-3-[(R)-十二 烷酰氧四癸酰氨基]-4-氧基-5-氮雜-9-[(R)-3-氫氧基四癸酰氨基]decan-1，10-二 醇，1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯）（W001/46127)。
[0099] 可用的其它TLR4配體是烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯類（AGP)，例如披露于 W09850399或美國專利號6, 303, 347 (還披露了 AGP的制備方法)，或者藥學上可接受的AGP 類的鹽，如美國專利號6, 764, 840中所披露的。一些AGP是TLR4激動劑，而一些是TLR4拮 抗劑。二者都被認為可以用作佐劑。
[0100] 其它合適的TLR-4配體(能夠通過TLR-4引起信號應答（Sabroe等人， JI2003pl630-5)是例如來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，尤其是LPS 的無毒衍生物(例如3D-MPL)。其它合適的TLR激動劑是：熱激蛋白質（HSP)IO, 60, 65, 70, 75 或90 ;表面活性蛋白A，透明質酸寡糖類，硫酸肝素片段，纖維連接蛋白片段，纖維蛋白原肽 類和b-防御素-2,胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F蛋白質。在一個實施例中，TLR 激動劑是HSP60,70或90。
[0101] Toll-樣受體（TLR)是I型跨膜受體，在昆蟲類和人類之間進化上保守。十個TLR 至此已經(jīng)建立（TLR1-10) (Sabroe等人，JI2003pl630-5)。TLR族的成員具有相似的胞外和 胞內(nèi)域；它們的胞外域已經(jīng)顯示具有富含亮氨酸重復序列，而它們的胞內(nèi)域類似于白細胞 介素-1受體（IL-IR)的胞內(nèi)區(qū)域。TLR細胞在免疫細胞和其它細胞(包括血管上皮細胞，月旨 肪細胞，心肌細胞和腸上皮細胞)間差異表達。TLR的胞內(nèi)域可以與銜接蛋白Myd88相互作 用，Myd88在其胞質區(qū)內(nèi)也具有IL-IR域，導致細胞因子類的NF-KB活化；該Myd88路徑是 細胞因子釋放受TLR活化影響的一個路徑。TLR的主要表達是在細胞類型例如抗原呈遞細 胞(例如樹突細胞，巨噬細胞等等)。
[0102] 在另一個實施例中，佐劑和免疫原性組合物還包括皂苷佐劑。用于本發(fā)明的尤 其合適的阜苷是QuilA及其衍生物。QuilA是從南美樹阜樹莫麗娜（Quillaja Saponaria Molina)分離出來的阜苷制劑，被Dalsgaard等人于1974年首次披露("Saponin adjuvants"，Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)，具有佐劑活性。QuilA的純化片段已經(jīng)被HPLC分離，其保留佐劑活性而 沒有與QuilA相關的毒性（EP0 362 278)，例如QS7和QS21(也被稱為QA7和QA21)。QS-21 是源自阜樹莫麗娜（Quillaja Saponaria Molina)的樹皮的天然阜苷，其誘導CD8+細胞毒 性T細胞（CTL)，Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答并且是本發(fā)明上下文中的優(yōu)選的皂苷。 在本發(fā)明的一個合適的形式中，免疫原性組合物內(nèi)的阜苷佐劑是saponaria molina quil A的衍生物，優(yōu)選Quil A的免疫活性部分，例如QS-17或QS-21，合適地QS-21。在一個實 施例中，本發(fā)明的組合物包含基本純化形式的免疫活性皂苷部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物 包含基本純化形式的QS21，也就是說，QS21為至少90%純化，例如至少95%純化，或者至少 98%純化。
[0103] 其它可用的阜苷類源自植物馬栗樹（Aesculus hippocastanum)或Gyophilla struthium。文獻中已披露過的其它阜苷類包括七葉樹（Escin),已披露于Merck index (12. sup. thed:entry3737)為出現(xiàn)在七葉樹，Aesculus hippocastanum種子中的阜苷的混 合物。其分離通過色譜法和純化進行描述（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953) )，以及通過離子交換樹脂（Erbring等人,美國專利號3, 238, 190)。接穗的部分已被純化 并且顯不出生物活性（Yoshikawa M 等人（Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 年 8 月；44(8): 1454-1464))。來自 Gypsophilla struthium 的 Sapoalbin(R. Vochten 等人，1968, J. Pharm. Belg.，42, 213-226)也是一個選擇。
[0104] 3D-MPL和/或QS21的劑量合適地能夠提高人類中對抗原的免疫應答。尤其是，合 適的3D-MPL和/或QS21的量是與無佐劑的組合物相比或與用另一 3D-MPL或QS21量佐劑 的組合物相比改善了組合物的免疫潛力，同時反應性譜可接受。通常，對于人實施，皂苷(例 如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人劑量的免疫原性組合物中存在的量的范圍 是每劑量 1 μ g-200 μ g，例如 10-50 μ g，或者 1 μ g-25 μ g。
[0105] 其中可選地包括其它免疫刺激劑的佐劑特別適于嬰兒和/或老年疫苗配方。 接種疫苗
[0106] 本發(fā)明的組合物可以通過任何合適的給藥途徑實施，例如皮內(nèi)、粘膜例如鼻內(nèi)、口 月艮、肌肉或皮下給藥。其他給藥途徑在本領域是公知的。
[0107] 肌肉給藥途徑特別適合本發(fā)明的Ml多肽組合物。本發(fā)明的組合物能夠以單一 劑量容器或可替換地多劑量容器存在，特別適合大流行性疫苗。在這種情況，通常存在抗 菌性防腐劑例如硫柳汞以防止在使用過程中受污染。硫柳汞濃度可以在25 μ g/0. 5ml劑 量（即50μ g/mL)。5μ g/0. 5ml劑量的硫柳汞濃度（即10μ g/ml)或10μ g/0. 5ml劑量 (即20yg/ml)合適地存在?？梢允褂煤线m的IM輸送設備，例如無針噴液注射裝置，例如 Biojector2000 (Bioject，Portland，Oregon)?？商鎿Q地，可以使用筆式注射器裝置。使用 所述輸送裝置可以尤其順應大規(guī)模免疫接種活動，例如在大流行中會需要。
[0108] 皮內(nèi)輸送是另一合適的途徑。任何合適的設備可用于皮內(nèi)輸送，例如無針或 短針裝置，例如限制針進入皮膚內(nèi)的有效穿透長度的裝置，例如披露于W099/34850和 EP1092444,所述文獻在此被援引入本文，以及其功能等值。另外合適的是噴射注射裝置，其 通過液體噴射注射器或者通過針刺穿角質層并產(chǎn)生到達真皮的噴射向真皮輸送液體疫苗。 另外合適的是彈道式粉末/顆粒輸送裝置，其使用壓縮氣體使粉末形式的疫苗加速通過皮 膚外層到真皮。另外，傳統(tǒng)的注射器可用于皮內(nèi)實施的經(jīng)典曼托方法（mantoux method)。
[0109] 另一合適的給藥途徑是皮下途徑。任何合適的裝置可用于皮下輸送，例如經(jīng)典的 針或無針噴射注射器裝置。合適的，所述裝置預裝有液體疫苗制劑。
[0110] 可替換地，疫苗鼻內(nèi)給藥。通常，疫苗局部給藥至鼻咽區(qū)，合適地不會被吸入肺。希 望使用鼻內(nèi)輸送裝置，所述裝置將疫苗制劑輸送至鼻咽區(qū)，而不會或基本不會進入肺部。用 于本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)給藥的合適裝置是噴霧裝置，其在本領域是公知的。
[0111] 可替換地，表皮或經(jīng)皮接種途徑也是本發(fā)明所考慮的。 抗體
[0112] 本發(fā)明的抗體對一種或多種本發(fā)明的Ml多肽會具有結合專一性。本發(fā)明的抗體 涵蓋上文所述的所有形式。在一個實施例中，抗體會針對具體的生物體進行工程設計。生 物體可以是人，犬，或商業(yè)上有價值的家畜，例如，豬、馬、狗、貓、雞、或其它鳥類?？贵w的所 述工程設計包括例如人化、人源化改造（humaneering)，制成嵌合抗體，或者利用本領域已 知的任何組庫技術或單克隆技術分離全人(或者其它生物體）抗體。
[0113] 分離抗原特異性人抗體的已有方法包括篩選小鼠的雜交瘤，所述小鼠對于人免疫 球蛋白位點是轉基因的（例如Jakobacits, 1998，Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42)，和體外 方法，其中展示并編碼在絲狀噬菌體(例如McCafferty等人，1990, Nature348:552-554)， 酵母細胞（例如 Boder 和 Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15:553-557)，和核糖體（例如 Hanes 和 Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA94:4937_4942)的人抗體片段的重組 庫對固定化抗原進行淘選。這些方法產(chǎn)生了許多有用的人抗體。但是，對于具有希望的治 療特性的很多非人類抗體，具有等價生物活性的人抗體還未使用這些方法分離。
[0114] 針對人免疫球蛋白位點轉基因的小鼠一般不表達人多樣性的完全補體，并且親和 力成熟效率較低。因此，希望的親和力和特異性的成功率傾向低于傳統(tǒng)的小鼠。展示技術 的主要限制源于抗體組庫的傾向性表達，和天然組庫的特異性和親和力限制。來自天然庫 的抗原結合抗體通常要求額外的親和力成熟。
[0115] 最小化非人類抗體的免疫原性同時保留盡可能多的初始特異性和親和力的最廣 泛應用的方法涉及將非人類抗體的CDR移植到人框架上，通常選擇與非人類框架結構同 源的那些（Jones等人，1986, Nature321:522-5 ;美國專利號5, 225, 539)。最初這些方法 導致親和力急劇損失。不過，然后顯示一些親和力可以通過在框架的關鍵位置恢復非人 類殘基來恢復，這要求保持非人類⑶Rl和2的正則結構（Bajorath等人，1995, J Biol Chem270:22081-4 ;Martin 等人，1991, Methods Enzymol. 203:121-53 ;Al_Lazikani, 1997, J Mol Bi〇1273:927-48)。恢復⑶R3的天然構象是非常不確定的事情，因為它們的結構更 加多變。因此確定恢復哪些非人類殘基來恢復功能性CDR3構象很大程度上是模型，其中可 能結合有試驗和錯誤。結果，在很多情況，初始非人類抗體的完全親和力沒有被恢復。通過 CDR移植人化抗體的示例性方法披露于例如美國專利號6, 180, 370。
[0116] 為了減輕傳統(tǒng)CDR-移植方法的缺點，已嘗試了不同的雜交選擇方法，其中非人類 抗體的部分已經(jīng)在連續(xù)輪的抗原結合選擇中與互補人抗體序列的庫相結合，在這個過程中 大部分非人類序列逐漸被人序列置換。不過，這些方法一般不表現(xiàn)地比CDR-移植好。例如， 在鏈替換技術中（Marks等人，1992, BiotechnologylO:779-83),非人類抗體的一個鏈與另 一個鏈的天然人組庫結合，根據(jù)是非人類鏈的親和力會足以將人伙伴的選擇限制在抗原上 的相同表位。選定的人伙伴隨后用于指導對余下非人類鏈的人對應物的選擇。
[0117] 其它方法包括鏈置換技術，其中非人類CDR3被保留，而僅僅V-區(qū)的剩余部分 包括框架和⑶Rl和2按序列進行的步驟分別置換(例如美國專利申請?zhí)?0030166871 ; Rader 等人，Proc Natl Acad Sci USA95:8910-15, 1998 ;Steinberger 等人，J. Biol. Chem. 275:36073-37078, 2000 ;Rader 等人，J. Biol. Chem. 275:13668-13676, 2000)。不過， 該策略仍具有缺陷，可選擇的人V-區(qū)必須不僅與非人類CDR3而且與非人類伴隨V-區(qū)相 容。該種間相容性對所選定的人V-區(qū)的結構同源性提出了高要求，使得那些與非人類V-區(qū) 最同源的一般被選擇。在這點上，結果與CDR移植方法非常相似，除了 CDRl和2在所選的 V-區(qū)最初是人的。
[0118] 在一個實施例中，本發(fā)明的抗Ml多肽抗體用增強生物體中抗體的半衰期的分子 來修飾/改性。所述修飾/改性包括，例如，聚乙二醇化（PEGylation)，或者通過其它親水 聚合物例如葡聚糖衍生，或者其它聚碳水化合物，PVP (聚維酮)，PVA (聚乙烯醇）等等。用 于所述衍生的聚合物在本領域是公知的。
[0119] 在一個實施例中，本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體2B-B10-G9,其結合至跨氨基酸 220-236的流感病毒基質（Ml)蛋白的C-端區(qū)。針對PR/8M蛋白質引起雜交瘤并且其結合 被定位到序列GHTPSSSAGLKNDLLEN。 制造多月太
[0120] 制造本發(fā)明的Ml多肽和/或抗體的重組技術在本領域是公知的。本發(fā)明的Ml多 肽或抗體可制造在任何宿主細胞中，例如在哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、 昆蟲細胞等等。制造重組表達構建體或載體用于某些宿主細胞例如酵母或絲狀真菌，或者 哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞，鼠科NIH3T3成纖維細胞，人胚胎腎193細胞，或者 嚙齒類骨髓瘤或雜交瘤細胞，大腸桿菌，某些昆蟲細胞，和其它市場上可得的宿主細胞體系 的技術在本領域是公知的。在這些宿主細胞中表達重組多肽并從這些宿主細胞獲得重組多 肽在本領域也是公知的。在一個實施例中，本發(fā)明的全長抗體將在能夠糖基化抗體的宿主 細胞體系中制得。在一個實施例中，糖基化將是用抗體治療的靶標生物體的糖基化。在一 個實施例中，糖基化將類似于待用抗體治療的生物體的糖基化。在一個可替換的實施例中， 糖基化不同于待被治療的生物體，以便糖基化提供佐劑效應，但并不實質損害抗體的效應 子作用。
[0121] 本發(fā)明的Ml多肽還可利用多肽合成裝置(例如在試管中）通過化學合成制得。
[0122] 在本說明書中所援引的所有公開出版物和專利在此被援引入本申請，如同每篇單 獨的公開出版物或專利專門和單獨地表示被援引并且在此被援引以披露和描述所引用公 開出版物的方法和/或材料。 示例 示例1.通討抗Ml多狀抗體抑制流感病毒感染
[0123] 研究了單克隆抗體2B-B10-G9,用于結合至流感菌株庫和用于在蝕斑抑制試驗中 和活性。單克隆抗體2B-B10-G9結合至跨氨基酸220-236的流感病毒基質（Ml)蛋白的C-端 區(qū)域。2B-B10-G9 還可結合至跨 220-237, 220-238, 220-239, 220-240,或 220-241 的氨基酸 處的Ml蛋白質。
[0124] 2B-B10-G9以瓊脂覆層被添加至部分感染的MDCK細胞的菌苔并且在37°C用0)2孵 化3天（圖1)。結果顯示15ug的抗體完全抑制了蝕斑形成。由于2B-B10-G9僅接觸（進入） 病毒或感染的細胞上M蛋白質的暴露部分，阻止蝕斑表示來自PR/8的基質蛋白質的C-端 區(qū)必須是表面可接觸的。抑制MDCK細胞的菌苔上的病毒蝕斑通過兩種單獨的方法進一步 分析。在添加含有2B-B10-G9抗體的瓊脂覆層之前細胞被病毒感染并且孵化30分鐘?？商?換地，在感染細胞之前病毒和抗體混合并孵化30分鐘。在感染和另外的30分鐘孵化之后， 添加沒有抗體的瓊脂覆層。結果表明在被抑制的總蝕斑中兩個實驗之間沒有差異。這些結 果暗示病毒感染的抑制是由2B-B10-G9結合至病毒引起的并且不阻止病毒從感染的細胞 芽殖。其它測試顯示菌斑試驗中2B-B10-G9抑制了 A/South Dakota (南達科他）（HlNl)的 菌斑形成并且部分抑制了 A/Uruguay(烏拉圭）（H3N2)(圖2)。位置231處的氨基酸變化 可能對降低的抗體功效負責。不過，即使部分抑制表明M蛋白的擴展的C-末端(在氨基酸殘 基215-252)是表面暴露的并且是針對免疫的可行靶標。進行了在位置231處的用天門冬 素或天冬氨酸的病毒的其它測試。來自PR/8和A/South Dakota的M蛋白在位置231處包 含天門冬素，而A/Uruguay在該位置包含天冬氨酸。另外，PR/8和South Dakota具有HlNl 表面糖蛋白，而Uruguay具有H3N2表面糖蛋白。為了確定2B-B10-G9是否具有廣泛的中和 活性，進行了一系列的中和實驗，來針對在HlNl設置的位置231處的天門冬素和天冬氨酸 變化以及針對H3N2設置的天冬氨酸設置測試有效性。在H3N2病毒中不能測試在位置231 含有天門冬素的M蛋白，因為該變化在野生型病毒中沒有出現(xiàn)。兩種病毒（A/WSN/33和A/ Port Chalmers/1/73)在菌斑抑制試驗中進行測試。A/WSN/33是HlNl病毒但不同于PR/8， 在Ml蛋白的位置231包含天冬氨酸。A/Port Chalmers/1/73是H3N2病毒，在位置231包 含天冬氨酸。同時，還測試了兩種對照病毒：A/PR/8和A/USSR/90/77。PR/8和USSR/90具 有相同的氨基酸序列從AA220至AA236,但具有不同的HlNl蛋白質。結果顯示所有的病毒 被2B-B10-G9以劑量依賴的方式抑制（圖2)。通過2B-B10-G9抑制菌斑形成不受位置231 處的氨基酸變化的影響，并且不受H3N2或HlNl糖蛋白的影響。結合上面的數(shù)據(jù)和包含在 NCBI數(shù)據(jù)庫中的野生型M蛋白質的序列分析，可以合理地得出結論：2B-B10-G9結合所有已 知的Ml變體。在疫苗設置中呈現(xiàn)C-端肽215-252會產(chǎn)生多克?。贵w）反應，利用了希 望的抗體應答賦予的良好記錄的效力，導致與單克隆抗體相對的由疫苗賦予的保護的非線 性增長。該多克隆抗體應答能夠提供針對具有A型基質蛋白的任何流感的接種疫苗生物體 通用保護。 示例2.新的抗Ml多狀抗體
[0125] 包括來自A/PR/8/38流感病毒的Ml蛋白質的氨基酸序列從220-236的Ml多肽被 結合至免疫原性載體蛋白（KLH，卵白蛋白，和BSA)并且注射入10-12周大的雌性BALB/c小 鼠。該Ml多肽具有氨基酸序列GHTPSSSAGLKNDLLEN。在最初注射之后又給予了兩次隨后的 追加，一次在第14天，一次在第28天。正好在接種之前和在三次注射的每一次之后7天采 集血清血液。分析所采集的血清表明在第二次追加之后對Ml多肽和對整個Ml蛋白質本身 有強反應/應答。
[0126] 肽GHTPSSSAGLKNDLLEN包括A/PR/8基質蛋白的氨基酸序列從220-236。肽化學共 軛（結合）至KLH、卵白蛋白和BSA。
[0127] 10-12周大的雌性BALB/c小鼠被隨機分成三組進行接種：A組-對照（小鼠 77-81 )，B組-肽共軛物(小鼠82-86)，C組-僅肽(小鼠87-91 )。所有的小鼠在第1天、第 15天和第29天被注射。第1天注射包括Freund完整佐劑，并且隨后的追加包含F(xiàn)reund不 完整佐劑。A組小鼠(對照)最初被注射50ugKLH，并用50ug卵白蛋白追加兩次(第15和29 天)。B組小鼠用50ugKLH-肽共軛物接種（第1天）并用50ug卵白蛋白-肽共軛物追加兩 次(第15和29天)。C組小鼠用肽(沒有共軛物）注射和追加，使用的量與B組摩爾當量。
[0128] 三組小鼠通過僅用BSA( A組，小鼠77-81 )、M1多肽-BSA共軛物（B組，小鼠82-86)、 或者僅用Ml多肽（C組，小鼠87-91)接種。小鼠通過僅BSA (A組)、Ml多肽共軛物（B組） 或僅Ml多肽（C組）追加兩次。從A組采集的血清顯示與BSA、Ml多肽-BSA共軛物、和Ml 蛋白質沒有結合（圖1)。從B組采集的血清（Ml多肽-BSA共軛物）顯示與Ml多肽-BSA共 軛物結合以及與M蛋白質結合。觀察到?jīng)]有與BSA結合表明結合至Ml多肽是特異性的。從 僅Ml多肽（C組）采集的血清顯示沒有與BSA、Ml多肽-BSA共軛物、或M蛋白質結合。 TK例3.具有塘某化白勺Ml多月太
[0129] 在小鼠模型中評估了利用Ml多肽的糖基化和a-糖基化形式的免疫應答和保護的 比較。在位置231的主要變異可能影響抗體結合至該抗原位點，還會測試對在位置231具 有突變的Ml多肽的血清學反應。
[0130] 純化的a-糖基化的Ml多肽和突變的231M1多肽以等比例組合，50ug(帶Freunds 佐劑）給藥入一組小鼠（10只小鼠/組)。同時，糖基化的Ml多肽（帶Freunds佐劑）被 給藥至另一組小鼠。每組在兩周后用IOug的各自的Ml多肽進行追加。在最初注射之前一 天、追加前一天以及追加后七天從每個小鼠采集大致100 μ 1的血液。針對結合至Ml多肽 (加上和減去糖基化)、Ml蛋白質、和針對對照非特異性肽來分析每只小鼠的血清。兩周之 后，進行另一次追加并且在追加后七天采集血清。血清對Ml多肽變體的反應使得能夠量化 對糖基化和a-糖基化形式的反應，并且還可確定對病毒攻擊實驗的免疫接種程序。
[0131] 六組小鼠（10只小鼠/組)進行免疫，并用Ml多肽和突變的231M1多肽追加。三組 會接收到組合的糖基化Ml多肽(組1-3)，并且3組會接收到具有佐劑的a-糖基化形式(組 4-6)。在最終追加后三天用致命劑量的流感病毒攻擊小鼠。各組用代表三種識別的M蛋白 的變體的病毒進行攻擊：A/PR/8 (組1，4)，A/WSN或等同物(組2,5)，和A/South Dakota或 等同物(組3,6)。另三組用每種病毒作為非免疫對照進行攻擊。7天后測量體溫和存活率。
[0132] 本說明書中引用的所有公開出版物和專利在此被援引入本發(fā)明，如同每篇單獨的 公開出版物或專利專門和單獨地表明被援引入本發(fā)明并且在此被援引入本文以披露和描 述結合所引用公開出版物的方法和/或材料。
[0133] 本領域的普通技術人員會認識到或使用不超出常規(guī)實驗能夠確定本文所述的特 定實施例的許多等同物。所述等同物旨在涵蓋于所附權利要求書。
【權利要求】
1. 一種甲型流感疫苗，所述甲型流感疫苗包括Ml多肽。
2. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其中Ml多肽包括Ml蛋白的氨基酸殘基220-236。
3. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其中Ml多肽包括Ml蛋白的氨基酸殘基215-241之間 的至少7個連續(xù)的氨基酸。
4. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其中Ml多肽由Ml蛋白的氨基酸殘基220-252組成。
5. 根據(jù)權利要求3所述的疫苗，其中Ml多肽結合至載體。
6. 根據(jù)權利要求3所述的疫苗，其中Ml多肽存在于支架。
7. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗,還包括佐劑。
8. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其中Ml多肽還包括糖基化的氨基酸。
9. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗,其中疫苗引起人中的B-細胞應答。
10. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其中疫苗引起哺乳動物中的B-細胞應答。
11. 一種治療哺乳動物的方法，包含以下步驟：將Ml多肽組合物給藥入哺乳動物，其中 Ml多肽組合物誘導哺乳動物中的免疫應答。
12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中免疫應答保護哺乳動物抵抗流感病毒。
13. 根據(jù)權利要求12所述的方法，其中哺乳動物是人。
14. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中免疫應答是B-細胞應答。
15. 根據(jù)權利要求14所述的方法，其中免疫應答還在哺乳動物中產(chǎn)生記憶免疫應答。
16. -種組合物，包括針對來自多種不同的甲型流感病毒的多個Ml多肽的抗體，其中 被所述抗體結合的表位在Ml多肽的氨基酸序列215-241中找到。
【文檔編號】A61K38/08GK104436157SQ201410022230
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2013年9月23日
【發(fā)明者】M·奧福尼特, D·布赫, M·霸爾 申請人:恩金生物有限公司