專利名稱：文昌魚解偶聯(lián)蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及文昌魚解偶聯(lián)蛋白(uncouplingprotein，UCP)分子克隆及功能研究。
背景技術(shù)：
線粒體的主要功能是參與能量代謝。當(dāng)線粒體進(jìn)行呼吸時(shí)，呼吸鏈傳遞電子的同時(shí)，將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到膜間隙，形成線粒體跨膜電位。質(zhì)子通過驅(qū)動(dòng)ATP合成酶合成ATP，從而回到線粒體基質(zhì)，形成氧化與磷酸化的偶聯(lián)。定位于線粒體內(nèi)膜的UCP能使線粒體膜間隙的質(zhì)子回漏到基質(zhì)中，從而降低線粒體的膜電位，使氧化與磷酸化解偶聯(lián)。目前共發(fā)現(xiàn)5個(gè)UCP家族成員，由于UCP4和UCP5與其余3個(gè)成員同源性較遠(yuǎn)，是否為UCP家族成員仍有爭論。
氧化磷酸化解偶聯(lián)是恒溫動(dòng)物產(chǎn)熱以維持自身體溫的機(jī)理之一。UCP1參與恒溫動(dòng)物的非顫栗性產(chǎn)熱已得到公認(rèn)(Enerback S.et.al.Nature 38790-94，1997)。盡管有許多研究表明，UCP2和UCP3可能參與ATP的合成、調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen spicies，ROS)的生成、參與脂肪酸的代謝等(Vidal-Puig AJ.et.al.J Biol Chem 27516258-16266，2000.ArsenijevicD.et.al.Nat Genet 26435-439，2000.Joseph JW.et.al.J Biol Chem 27951049-51056，2004.Jaburek M.et.al.J Biol Chem 27953097-53102，2004)。但是，目前它們的功能仍有爭論。如果我們能夠?qū)ふ业経CP進(jìn)化的祖先，明確其功能，然后沿動(dòng)物進(jìn)化路線，脊索動(dòng)物-圓口綱動(dòng)物-魚類-兩棲類-爬行類-嚙齒類-人，逐一闡明不同進(jìn)化層次動(dòng)物UCP的功能，對我們了解變溫動(dòng)物向恒溫動(dòng)物進(jìn)化過程中，UCP功能的變化，以及這種變化對變溫動(dòng)物向恒溫動(dòng)物進(jìn)化的影響，無疑是有益的。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等(Zhang CY et al Cell 105745-755，2001.Murrav AJ et al Lancet3641786-1788，2004.Mills EM et al J Biol Chem 27727385-27392，2002)。了解文昌魚UCP的功能有助于我們更深刻理解哺乳類和人的UCP的功能，因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制備治療這些疾病的藥物。
文昌魚屬于脊索動(dòng)物，被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物的祖先，在進(jìn)化過程中占有重要地位。由于對它的研究不夠深入，影響其成為模式動(dòng)物。弄清文昌魚是否具有UCP，以及UCP在文昌魚代謝過程中的作用，將有助于我們理解文昌魚的代謝特點(diǎn)及生理習(xí)性，對文昌魚早日成為模式動(dòng)物是有益的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆文昌魚的UCP并對其功能進(jìn)行研究。文昌魚UCP編碼區(qū)序列atgggcatcg gattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagtgcggggtttg ccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagttcgtctgcaga tccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgaccaccctctgta ccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgccaaacaccggg ggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaaggggctgtacagcg gcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatcggactgtacg actccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggtgcctccatgc cgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgcgcacagccca cagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggcgggaagaagc ggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc
gttaaaggct tgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgccacggagctgg tgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgacagataacctgc cctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtcgcctcacctg tagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacactggtgcactgg actgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaagggtttactc cttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctacgagcagttga agcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaagcacccatgt ga本發(fā)明的技術(shù)解決方案1、文昌魚UCP的分子克隆提取整條文昌魚的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用簡并引物擴(kuò)增UCP片段，測序，經(jīng)同源性、保守序列等分析，以證實(shí)克隆的片段為UCP。然后3’，5’-RACE克隆全長序列，再次同源性、保守序列等分析，以證實(shí)克隆的為UCP。
2、解剖文昌魚，取肌肉、腸道和鰓，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR檢測UCP的表達(dá)。
3、將文昌魚飼養(yǎng)于8℃和10℃，于第3日和第8日取材(每組8例)。另外，饑餓處理文昌魚，在第3日、第8日和15日取材(每組8例)，提取整條文昌魚的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用real-time PCR檢測UCP的變化。
本發(fā)明首次從文昌魚中克隆了UCP基因。它廣泛表達(dá)于肌肉、腸道和鰓等組織。低溫可使UCP表達(dá)增高，表明它參與了低溫條件下的體溫調(diào)節(jié)，饑餓14日UCP表達(dá)明顯降低，表明它參與了能量代謝的調(diào)節(jié)。
UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等。了解文昌魚UCP的功能，將有助于我們更深刻理解哺乳類和人類UCP的功能。因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制備治療這些疾病的藥物。
四

圖1RT-PCR檢測UCP在文昌魚肌肉、鰓和腸道組織中的表達(dá)1肌肉；2鰓；3腸道。上行為UCP；下行為18S rRNA.。
圖2為低溫(8℃和10℃)對UCP表達(dá)的影響。
圖3為饑餓對UCP表達(dá)的影響。
五具體實(shí)施例方式
提取整條文昌魚RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用簡并引物從cDNA擴(kuò)增UCP片段，經(jīng)序列同源性比較后確定后，用3’，5’-RACE擴(kuò)增出UCP全長序列。用RT-PCR方法檢測證明，UCP表達(dá)于文昌魚的肌肉、鰓和腸道。低溫處理3天可誘導(dǎo)UCP的表達(dá)，饑餓處理14天抑制UCP的表達(dá)。這些結(jié)果表明，UCP參與文昌魚的體溫和代謝調(diào)節(jié)。
材料與來源試劑，Trizol購自Invitrogen公司；3’，5’-RACE試劑盒(SMARTMRACEcDNA Amplification Kit)購于Clontech公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶和pMD18-Tvector及應(yīng)用的酶類和試劑盒，除特殊標(biāo)明外，均購于大連寶生物工程有限公司；引物及序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen BiotechnologyCo.，Ltd)完成。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購自江蘇思來科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900勻漿器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR儀；文昌魚由南京大學(xué)北海工作站提供。
實(shí)施例1、不同條件處理文昌魚及組織取材實(shí)驗(yàn)用文昌魚由南京大學(xué)北海工作站提供。將正常飼養(yǎng)的文昌魚放于平皿中用剪刀快速剪碎后放于適量的Trizol中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 將文昌魚分別飼養(yǎng)于8℃和10℃的培養(yǎng)箱中，于第3日和第8日取材，每組8條，方法同上。
饑餓處理文昌魚，分別于第3、8、15天取材，每組8條，方法同上。
以正常飼養(yǎng)(23℃，正常喂食)的文昌魚(8條)，作為兩種不同處理的對照組。
解剖6-8條文昌魚，收集肌肉、鰓和腸道組織，放于適量的Trizol中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄將保存于Trizol中的文昌魚，用Heidolph DIAX900組織勻漿器將其充分勻漿(4檔100秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入潔凈的1.5ml離心管中，室溫放置5分鐘后，12000g，4℃離心5分鐘，取上清，加入200μl氯仿，強(qiáng)烈震蕩混勻，室溫放置5分鐘，12000g，4℃離心15分鐘，小心吸取上清至另一潔凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12000g，4℃離心10分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，適量DEPC水溶解，紫外分光法定量。然后用DNaseI(RNase Free)處理提取的RNA以防止基因組DNA的污染。簡言之，于37℃，用10U DNaseI處理20-50μgRNA30分鐘，然后用酚、氯仿和異戊醇抽提，醋酸鈉和乙醇(pH5.2)沉淀，70％乙醇洗滌，干燥后，用適量DEPC水溶解，紫外分光法定量。
2μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μl，含2μg RNA，1mM dNTP，1U/μl RNA酶抑制劑，2.5pmol/μl Olig(dT)18引物，0.5U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混勻，42℃1小時(shí)，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用于PCR或real-timePCR。
3、文昌魚UCP片段的克隆將人、小鼠、斑馬魚、鯉魚等UCP2氨基酸序列進(jìn)行比對，尋找保守序列為TFPLDTA和MFVTYEQ，設(shè)計(jì)簡并引物，上游引物為5’-ACITTYCCICTIGAYACIGC-3’，下游引物為5’-TGYTCRTAIGTIACRAACAT-3’，其中RA-G；YC-T；I與A、T、C、G均可配對。
PCR為20μl反應(yīng)體系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，2pmol/μl上、下游引物。上游引物5’-ACITTYCCICTIGAYACIGC-3’，下游引物為5’-TGYTCRTAIGTIACRAACAT-3’，反應(yīng)條件95℃5分鐘后，95℃30秒-50℃2分鐘-72℃30秒(30個(gè)循環(huán))，72℃延伸10分鐘。取第一次PCR產(chǎn)物1μl作為模板行第二次PCR，反應(yīng)條件同上，電泳分析。
應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0試劑盒(按說明書操作)切膠回收目的片段，然后與pMD18-T vector連接(應(yīng)用Takara DNA Ligation Kit)，反應(yīng)體系為pMD18-Tvector 1μl，上述PCR產(chǎn)物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說明書操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對序列進(jìn)行測定。對序列進(jìn)行同源性和保守氨基酸等分析證明，我們克隆的片段屬于UCP家族成員。根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)引物，用于3’，5’-RACE，以得到UCP全長序列。
4、3’，5’-RACE(SMARTMRACE cDNA Amplification Kit購于clontech公司)第一鏈cDNA的合成對于5’-RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制1μg總RNA，1μl 5’-CDS primer A，1μl SMART II A oligo，加水至體積為5μl；對于3’-RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制1μg總RNA，1μl 3’-CDSprimer A，加水至體積為5μl；將上述2離心管混勻，70℃處理2分鐘后，冰上放置2分鐘。然后，向兩離心管中分別加入以下試劑，2μl 5×First-StrandBuffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl PowerScriptReverseTranscriptase，總體積為10μl，混勻，42℃孵育1.5小時(shí)，分別加入100μl Tricine-EDTA Buffer，72℃處理7分鐘后，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR41.5μlMaster Mix的配制5μl 10×Advantage 2 PCR Buffer，1μldNTP(10mM)，1μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix，混勻備用。對于5’-RACE，在PCR管中配制2.5μl 5’RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μlGSP(10μM)，序列為5’-CCTTCGGACCCTCCTGCTTCACGAT-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，總體積50μl，混勻。對于3’-RACE，在PCR管中配制2.5μl5’RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μl GSP(10μM)，序列為5’ACGACATGGTGAAGGAGGAGATCC-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，總體積50μl，混勻。PCR反應(yīng)條件95℃5分鐘后，94℃30秒-72℃2分鐘5個(gè)循環(huán)，94℃30秒-70℃30秒-72℃2分鐘5個(gè)循環(huán)，94℃30秒-68℃30秒-72℃2分鐘25個(gè)循環(huán)，然后72℃10分鐘，電泳分析。
應(yīng)用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit(按說明書操作)切膠回收目的片段，然后與pMD18-T vector連接(應(yīng)用TaKaRa DNALigation Kit)，反應(yīng)體系為pMD18-T vector 1μl，上述PCR產(chǎn)物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說明書操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對序列進(jìn)行測定。對序列進(jìn)行同源性和保守氨基酸等分析證明，該基因?qū)儆赨CP家族成員。
5、PCR檢測UCP在不同組織中表達(dá)PCR為20μl反應(yīng)體系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，各0.2pmol/μl上、下游引物，UCP上游引物5’-GTGAAGCAGGAGGGTCCGAAGG-3’，UCP下游引物5’-GAGTCGTACAGTCCGATTCTGATGG-3’；18S rRNA上游引物5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAAG-3’，18S rRNA下游引物5’-TTAAAGTGTACCCATTCCAATTACGG-3’。反應(yīng)條件95℃5分鐘后，95℃30秒-68℃60秒(UCP30個(gè)循環(huán)，18S rRNA25個(gè)循環(huán))72℃延伸10分鐘，電泳分析。
6、real-time PCR檢測UCP在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)PCR為20μl反應(yīng)體系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，0.125pmol/μl上、下游引物，同時(shí)20μl反應(yīng)體系中含有1μlEvaGreenTM(購于上海開發(fā)科技發(fā)展有限公司的美國Biotium公司產(chǎn)品)，UCP上游引物5’-GTGAAGCAGGAGGGTCCGAAGG-3’，下游引物5’-GAGTCGTACAGTCCGATTCTGATGG-3’；18S rRNA上游引物5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAAG-3’，18S rRNA下游引物5’-TTAAAGTGTACCCATTCCAATTACGG-3’。反應(yīng)條件95℃5分鐘后，95℃30秒，68℃60秒(40個(gè)循環(huán))，72℃延伸10分鐘。結(jié)果用ABI Prism 7000SDS Software分析。
文昌魚解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)基因序列<110>南京大學(xué)<120>文昌魚解偶聯(lián)蛋白基因及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>1032<212>DNA<213>文昌魚(Branchiostoma belcheri)<400>1atgggcatcg gattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagt 60gcggggtttg ccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagtt 120cgtctgcaga tccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgacc 180accctctgta ccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgcc 240aaacaccggg ggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaagggg 300ctgtacagcg gcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatc 360ggactgtacg actccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggt 420gcctccatgc cgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgc 480gcacagccca cagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggc 540gggaagaagc ggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc 600gttaaaggct tgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgcc 660acggagctgg tgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgaca 720gataacctgc cctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtc 780gcctcacctg tagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacact 840ggtgcactgg actgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaa 900gggtttactc cttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctac 960gagcagttga agcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaa 1020gcacccatgt ga 103權(quán)利要求
1.一種文昌魚解偶聯(lián)蛋白基因，其特征在于編碼區(qū)序列為atgggcatcggattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagt gcggggtttgccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagtt cgtctgcagatccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgacc accctctgtaccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgcc aaacaccgggggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaagggg ctgtacagcggcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatc ggactgtacgactccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggt gcctccatgccgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgc gcacagcccacagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggc gggaagaagcggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc gttaaaggcttgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgcc acggagctggtgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgaca gataacctgccctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtc gcctcacctgtagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacact ggtgcactggactgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaa gggtttactccttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctac gagcagttgaagcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaa gcacccatgt ga。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述文昌魚解偶聯(lián)蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取整條文昌魚RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已經(jīng)克隆的其它物種解偶聯(lián)蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，從cDNA擴(kuò)增解偶聯(lián)蛋白基因片段，經(jīng)序列同源性比較，確定其為解偶聯(lián)蛋白基因片段后，用3’，5’-RACE擴(kuò)增出解偶聯(lián)蛋白基因的全長序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述文昌魚解偶聯(lián)蛋白基因在制備治療代謝性疾病和其它疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及文昌魚解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)分子克隆及功能研究。本發(fā)明應(yīng)用簡并引物和3’，5’－RACE首次從文昌魚中克隆了解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)基因。它廣泛表達(dá)于肌肉、腸道和鰓等組織。低溫(8℃和10℃)處理第三日可使UCP表達(dá)增高，表明它參與低溫條件下的體溫調(diào)節(jié)；饑餓14日UCP表達(dá)明顯降低，表明它參與能量代謝的調(diào)節(jié)。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等。因此，以UCP作為靶點(diǎn)，可以制備治療這些疾病的藥物。
文檔編號A61K31/7088GK101058810SQ20071002160
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者孫國勛, 王修強(qiáng), 張辰宇, 項(xiàng)陽, 陳均遠(yuǎn), 張俊峰, 張紅杰, 徐威, 鄒季虹 申請人:南京大學(xué)