專利名稱：黃芪提取物在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種黃芪提取物在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
疲勞(Fatigue)是當(dāng)今社會(huì)中工作時(shí)間長、節(jié)奏快、睡眠不足等因素引起的亞健康狀態(tài)的信號，也是誘發(fā)各種疾病(心腦疾病、胃腸疾病、神經(jīng)內(nèi)分泌疾病)的主要潛在因素。另外，在世界競技體育運(yùn)動(dòng)飛速發(fā)展的今天，運(yùn)動(dòng)員超負(fù)荷的訓(xùn)練和競賽，產(chǎn)生耐力下降、運(yùn)動(dòng)能力不足，達(dá)不到原有的競技狀態(tài)和水平，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞?？梢哉f疲勞是現(xiàn)代人的百病之源，是危害人體健康的重要隱患。長期疲勞會(huì)導(dǎo)致慢性疲勞綜合征，并嚴(yán)重地影響生活質(zhì)量，這已成為21世紀(jì)人類健康的主要問題之一。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對疲勞的研究已經(jīng)過了100多年的歷程，對疲勞產(chǎn)生的機(jī)制有了較為深入的認(rèn)識(shí)，提出運(yùn)動(dòng)性疲勞可分為外周性的與中樞性的，認(rèn)為產(chǎn)生疲勞的位點(diǎn)主要有1)興奮性傳入至高級運(yùn)動(dòng)中樞、2)興奮性傳至低級運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、3)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性、4)神經(jīng)-肌肉接頭傳遞、5)肌纖維的興奮性、6)興奮-收縮藕聯(lián)、7)收縮機(jī)制、8)代謝能的供給和代謝產(chǎn)物的累積。上述1)-4)位點(diǎn)是中樞性的，5)-8)位點(diǎn)是與外周發(fā)生聯(lián)系的。目前大量的研究成果證明產(chǎn)生疲勞的位點(diǎn)主要在外周，即上述5)-8)位點(diǎn)。此外，體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的改變、激素的調(diào)節(jié)、免疫功能的變化對疲勞的產(chǎn)生起到了重要的作用。
1.Fitts，R.H.Cellular mechanisms of muscle fatigue.Physiol Rev 1994；7449-812.Westerblad，H，Lee，J.A，Lannergren，J，and Allen，D.G.Cellular mechanisms of fatigue inskeletal muscle.Am J Physiol 1991；261C195-C209近年來，中國在應(yīng)用中醫(yī)藥治療疲勞已作了大量的研究工作，證明中醫(yī)藥抗疲勞的作用是肯定的，有進(jìn)一步挖掘、研究和開發(fā)的價(jià)值。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疲勞與脾、腎相關(guān)。脾為后天之本，氣血生化之源。脾主肌肉，脾氣盛，則肌肉豐滿而充實(shí)。腎藏精，主骨髓，為先天之本，是體內(nèi)產(chǎn)生的原動(dòng)力和源泉。應(yīng)用補(bǔ)腎益脾(補(bǔ)氣填精)的中藥能夠提高人體的運(yùn)動(dòng)能力、改善能量代謝、促進(jìn)疲勞的恢復(fù)。見文獻(xiàn)報(bào)道1.劉雁峰，等.慢性疲勞綜合征中西醫(yī)研究概況(綜述).北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，20(5)48-502.陳家旭，等.中醫(yī)藥抗運(yùn)動(dòng)性疲勞研究概況與展望(綜述).中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，1997，16(1)50-543.解麗芳，等.中醫(yī)藥抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究展望(綜述).中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，1998，17(1)67-69。
從目前中醫(yī)藥抗疲勞的研究中可以看到存在以下幾個(gè)方面的問題1)整體方面的研究比較多，細(xì)胞水平方面的研究很少；2)偏重于藥效學(xué)的研究，其作用機(jī)制的研究不夠詳細(xì)；3)中藥中抗疲勞的藥物種類繁多，如何在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，從作用機(jī)制著手進(jìn)行篩選；4)應(yīng)建立能夠真正評價(jià)疲勞的整體、離體和細(xì)胞水平的模型，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和造模的標(biāo)準(zhǔn)化，使抗疲勞藥物的篩選能夠提高到一個(gè)新的水平。鑒于以上原因，本發(fā)明人認(rèn)為研究中藥的抗疲勞作用，應(yīng)在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，從其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理兩個(gè)方面著手研究。挖掘、研究和開發(fā)出具有真正抗疲勞的新型藥物，這將會(huì)產(chǎn)生重大的社會(huì)意義和社會(huì)價(jià)值。
黃芪(Astragalus membranaceus)屬豆科植物，性味甘、微溫，歸脾、肺經(jīng)，主要功效為補(bǔ)氣固表，利尿托毒、排膿，斂瘡生肌，是中藥補(bǔ)氣藥中最重要的藥物之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明黃芪具有調(diào)節(jié)免疫功能、延緩衰老、促進(jìn)骨髓造血和血細(xì)胞生成。目前，對黃芪研究最多、最廣泛和最深入的是在心血管效應(yīng)方面。眾多的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究表明黃芪對心臟具有良好的保護(hù)作用，在臨床上能用于治療冠心病心絞痛、高血壓、低血壓、病毒性心肌炎、心律失常等。
黃芪的化學(xué)研究表明黃芪中主要的活性成分為黃酮類、皂甙類、多糖類以及氨基酸、磷脂及微量元素。黃芪中的主要黃酮有芒柄花素、毛蕊異黃酮、黃芪異黃烷甙等近20種。黃酮類化合物的主要功效很可能在于抗自由基損傷。皂甙類以三萜類為主，主要有大豆類皂甙、胡蘿卜甙、黃芪皂甙。黃芪皂甙是主要的活性成分，據(jù)報(bào)道黃芪皂甙具有較廣泛的藥理作用，是正性肌力和降壓的主要有效成分。多糖類，目前已分離得到的主要有三種，分別是黃芪多糖I、黃芪多糖II和黃芪多糖III，前兩種為葡聚糖，其主要藥理活性是免疫調(diào)節(jié)功能。
黃芪在心血管藥理效應(yīng)方面的研究證明單味藥黃芪在治療心肌梗塞方面能夠限制和縮小心肌梗塞的面積，提高心肌梗塞患者紅細(xì)胞超氧化物岐化酶活性，降低血漿過氧化脂質(zhì)含量，其機(jī)制可能為黃芪能夠穩(wěn)定缺血、缺氧心肌細(xì)胞膜，保護(hù)線粒體和溶酶體，調(diào)節(jié)cAMP/cGMP比例，增加抗缺氧能力，抑制氧自由基產(chǎn)生，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕細(xì)胞的損傷程度。在心肌缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)單味黃芪能升高再灌注損傷心肌組織中SOD及GSH-Px活性，降低MDA及胞內(nèi)Ca2+含量，維持心肌細(xì)胞氧化和抗氧化平衡，干預(yù)氧自由基的產(chǎn)生并增強(qiáng)清除氧自由基的功能；并能使內(nèi)源性腺苷釋放增加和肌鈣蛋白-T釋放減少。以上結(jié)果表明增加心肌抗缺氧及抗再灌注損傷的作用，黃芪對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)在于清除氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并能抑制Ca2+內(nèi)流，減輕Ca2+超載，提高心肌組織內(nèi)cAMP含量等，起到保護(hù)心肌的作用。黃芪具有較明顯的強(qiáng)心作用，有人報(bào)道，其作用與Na+-K+-ATPase活性無關(guān)，可能與抑制磷酸二酯酶活性有關(guān)，磷酸二酯酶是cAMP的分解酶，磷酸二酯酶活性被抑制后，cAMP的分解減少，心肌組織中cAMP的濃度升高，激活cAMP依賴性蛋白激酶，導(dǎo)致心肌細(xì)胞興奮-收縮藕聯(lián)加強(qiáng)，此即黃芪的強(qiáng)心機(jī)制。另外，黃芪能增加心肌細(xì)胞膜上受體的數(shù)目，其增加可能是使心肌細(xì)胞受體外移或增加受體合成，這也可能是黃芪強(qiáng)心的機(jī)制之一。
有效部位或有效成分的研究表明黃芪中具有正性肌力作用的主要成分是黃芪總皂甙，在整體心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪皂甙具有較明顯的強(qiáng)心作用。在實(shí)驗(yàn)性心力衰竭的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪皂甙的正性肌力具有濃度依賴性。在離體乳頭肌標(biāo)本實(shí)驗(yàn)中觀察到黃芪皂甙的正性肌力與磷酸二酯酶活性的抑制有關(guān)；在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪皂甙的強(qiáng)心作用可能與Na+-K+-ATPase的抑制有關(guān)。也有人認(rèn)為黃芪皂甙的正性肌力與哇巴因不同，可能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子有關(guān)。黃芪中黃酮的作用很可能在改善心肌缺血缺氧和保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷中起著很重要的作用。在整體心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮對心臟有較明顯的保護(hù)作用。在對由黃嘌呤-黃嘌呤氧合酶誘導(dǎo)的卵磷脂過氧化抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有明顯的抑制脂質(zhì)過氧化作用。應(yīng)用Langendorff法和電子自旋共振波譜儀觀察到黃芪總黃酮能減少大鼠心肌缺血再灌注損傷氧自由基的生成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于在中醫(yī)“脾主肌肉”理論為指導(dǎo)，進(jìn)一步研究開發(fā)黃芪的抗疲勞作用的藥效。
目前的研究表明產(chǎn)生疲勞的主要位點(diǎn)在于外周肌纖維，肌纖維發(fā)生疲勞后，將會(huì)引起能量代謝障礙、有氧代謝減少、無氧代謝增加、造成細(xì)胞內(nèi)ATP、磷酸肌醇、糖元含量降低、乳酸堆積、無機(jī)磷含量升高。細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)Na+和H+離子活度增加，K+離子活度減少，造成細(xì)胞腫脹和壞死。離子環(huán)境的變化和能量代謝的障礙將進(jìn)一步直接造成肌纖維橫橋活動(dòng)和間接造成興奮-收縮藕聯(lián)活動(dòng)的異常，最終導(dǎo)致疲勞程度進(jìn)一步加劇。
本發(fā)明基于上述疲勞的細(xì)胞機(jī)制，采用以下方案來研究中藥黃芪的抗疲勞作用。
1.應(yīng)用超強(qiáng)低頻電刺激脈沖造成小鼠趾長伸肌(EDL)的離體疲勞模型。低頻電刺激引起的疲勞比高頻電刺激更符合人體的疲勞狀況，所以選擇低頻電刺激造成離體肌肉疲勞模型2.通過測定離體肌纖維等長性張力，分析肌纖維疲勞后的機(jī)械特性變化，說明肌纖維發(fā)生疲勞后橫橋和興奮-收縮藕聯(lián)活動(dòng)的變化，以及黃芪對橫橋和興奮-收縮藕聯(lián)活動(dòng)改變的作用。
3.通過生物化學(xué)的方法，測定肌纖維中糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和無機(jī)磷(Pi)的含量，觀察肌纖維疲勞后細(xì)胞能量代謝的變化和黃芪對疲勞后肌纖維能量代謝障礙的改善作用。說明黃芪在抗疲勞過程中，改善能量代謝、促進(jìn)酸堿平衡和內(nèi)環(huán)境的恒定的作用。
通過上述試驗(yàn)證實(shí)了中藥黃芪提取物具有顯著的抗疲勞作用。
本發(fā)明提供了黃芪提取物在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的黃芪提取物是通過下述方法制備的1)原料黃芪藥材(飲片)藥材為山西省渾源產(chǎn)的膜莢黃芪。
2)二次醇沉法提取黃芪浸膏黃芪藥材(飲片)加水(第一次為黃芪藥材重量的5倍量，第二、三次3倍量)煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小時(shí)，合并三次煎液，濃縮至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量為70％，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至浸膏。加無水乙醇使浸膏含醇量為85％，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至浸膏，與黃芪藥材重量比較，濃縮100倍；3)提取黃芪提取物用相當(dāng)于步驟(2)制得的黃芪浸膏重量4倍量的60％乙醇加入黃芪浸膏中，進(jìn)行沉淀，去沉淀物(多糖部分)，濃縮乙醇部分，濃縮部分再用相當(dāng)于該濃縮物重量的80％乙醇沉淀，去沉淀部分(單糖部分、小分子)，濃縮乙醇部分得黃芪提取物，與步驟(2)所得黃芪浸膏重量比較，濃縮5倍，呈微黃色的粉末狀。
上述提取物經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)研究室HPLC測試，該提取物含有的主要成份有皂甙IV、皂甙II、毛芯異黃酮、毛芯異黃酮糖甙和多糖(見圖5)等。
本發(fā)明對中藥黃芪提取物在離體小鼠趾長伸肌的實(shí)驗(yàn)中揭示了黃芪提取物具有明顯促進(jìn)低頻疲勞恢復(fù)的作用，因而可用于制備抗疲勞藥物。


圖1.黃芪提取物對低頻電刺激造成肌肉疲勞后的強(qiáng)直收縮力(P0)恢復(fù)的作用。應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體小鼠趾長伸肌疲勞模型。疲勞后張力恢復(fù)的觀察時(shí)間分別為0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。(A)強(qiáng)直收縮(P0)，(B)P0/+dT/dt，(C)P0/-dT/dt。
圖2.黃芪提取物對低頻電刺激造成肌肉疲勞后的單收縮力(Pt)恢復(fù)的作用。應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體小鼠趾長伸肌疲勞模型。疲勞后張力恢復(fù)的觀察時(shí)間分別為0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。(A)Pt，(B)Pt/+dT/dt，(C)Pt/-dT/dt，(D)CT，(E)1/2RT。
圖3說明疲勞組(■)、黃芪提取物(○)和咖啡因組(△)小鼠在經(jīng)低頻電刺激造成肌肉疲勞后60min趾長伸肌單收縮恢復(fù)過程中的Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt、CT及1/2RT(X±SE)的變化。
圖4說明疲勞組(■)、黃芪提取物(○)和咖啡因(△)組小鼠在經(jīng)低頻電刺激造成肌肉疲勞后60min趾長伸肌強(qiáng)直收縮恢復(fù)過程中的P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt(X±SE)的變化。
圖5本發(fā)明的黃芪提取物HPLC測試圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過下列方案的具體實(shí)驗(yàn)，說明黃芪的抗疲勞作用。
一、材料與方法1、離體小鼠趾長伸肌疲勞模型制作Babl/C種小鼠，體重18-20克，雄性，經(jīng)麻醉后，仔細(xì)分離出趾長伸肌，置入容積約10ml的浴槽內(nèi)，浴槽中營養(yǎng)液(mmol/L)的組成為NaCl 115、NaHCO3 25、KCl 5.0、CaCl2 2.5、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.0、glucose 5.0，該溶液的pH調(diào)節(jié)至7.35-7.40之間，溫度保持在25℃，并持續(xù)充灌100％氧氣。肌纖維的一側(cè)固定在浴槽低部，另一側(cè)連接張力換能器，待肌纖維在浴槽內(nèi)平衡40分鐘到1小時(shí)后，應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體肌纖維的疲勞模型。
2.肌纖維收縮性能的測定對每條肌肉在其整個(gè)長度范圍內(nèi)經(jīng)鉑金絲電極進(jìn)行電場刺激。每條趾長伸肌標(biāo)本都被調(diào)節(jié)至最佳(適宜)長度(optimal length)，然后引出最大單收縮。通過應(yīng)用超強(qiáng)的波寬0.5ms的電脈沖刺激引出等長性單收縮(isometric twitch contraction)，通過應(yīng)用超強(qiáng)的波寬0.1ms、頻率為50Hz的電脈沖刺激引出最大強(qiáng)直收縮(peaktetanic contraction)。所測的收縮力經(jīng)張力換能器輸出和橋式放大器放大后，輸至四通道高速記錄儀記錄，并通過PowerLab/4SP生物信號處理和分析系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計(jì)。進(jìn)一步分析單收縮的時(shí)間(CT，即經(jīng)刺激后收縮力達(dá)到最大值所需的時(shí)間)1/2的松弛時(shí)間(1/2RT，即最大收縮力下降到50％所需的時(shí)間)，最大單收縮力及其上升與下降速率(Pt、Pt/±dp/dt)以及最大強(qiáng)直收縮力及其上升與下降速率(P0、P0/±dp/dt)。
3.生化指標(biāo)和能量代謝測定動(dòng)物的離體肌纖維在收縮性能測試完畢后，用0.9％NaCl沖洗后，將水分用濾紙吸干，快速置入液氮冷凍，并保存在-70℃低溫冰箱中。在測試生化指標(biāo)過程中，骨骼肌經(jīng)復(fù)溫后，將其分離成1-2mm長的纖維束。經(jīng)稱重后，根據(jù)酶學(xué)方法測定糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和無機(jī)磷(Pi)的生化和能量代謝指標(biāo)。
4.中藥黃芪提取物提取的制備和主要成分提取黃芪提取物(黃芪提取物)1)原料黃芪藥材(飲片)藥材為山西省渾源產(chǎn)的膜莢黃芪。
2)二次醇沉法提取黃芪浸膏黃芪藥材(飲片)加水(第一次用相當(dāng)于黃芪重量的5倍量，第二、三次3倍量)煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小時(shí)，合并三次煎液，濃縮至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量為70％，冷藏過夜，過濾，濾液濃縮至浸膏。加無水乙醇使浸膏含醇量為85％，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至浸膏，與黃芪藥材重量比較，濃縮100倍；3)提取黃芪提取物用相當(dāng)于步驟(2)制得的黃芪浸膏重量4倍量的60％7醇加入黃芪浸膏中，進(jìn)行沉淀，去沉淀物，濃縮乙醇部分，濃縮部分用相當(dāng)于該濃縮物重量4倍量的80％乙醇沉淀，去沉淀部分，濃縮乙醇部分得黃芪提取，與步驟(2)制得的黃芪浸膏重量比較，濃縮5倍，呈微黃色的粉末狀。
黃芪中主要成分經(jīng)HPLC測試的黃芪主要成分有皂甙IV、皂甙II、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮糖甙、多糖等，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)研究室提供(見圖5)。由于上述成分對低頻電刺激造成的疲勞均無明顯效果。為此，重點(diǎn)研究黃芪富集物對低頻電刺激造成小鼠趾長伸肌疲勞的作用。黃芪富集物的用量為0.1mg/ml，對照藥咖啡因的用量為1mmol/L。
5.統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果除圖中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其它以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)表示。用students t-檢驗(yàn)或one way ANOVA比較組間數(shù)據(jù)的顯著性，P值小于0.05，表示具有顯著性意義。在疲勞后的恢復(fù)過程中，各項(xiàng)肌力恢復(fù)率(P0、P0/±dp/dt、Pt、Pt/±dp/dt)的百分比根據(jù)以下公式計(jì)算肌力恢復(fù)率＝(恢復(fù)值-最低恢復(fù)值)/(對照值-最低恢復(fù)值)×100％。
二、結(jié)果1.離體小鼠趾長伸肌的收縮特性本實(shí)驗(yàn)選用的動(dòng)物為BALB/C純系雄性小鼠，體重18-20g。通過對12個(gè)動(dòng)物的體重，趾長伸肌最大長度和肌肉濕重的測定，表明平均體重為19.3±0.8g，肌肉的最大長度為11.18±0.37mm，肌肉濕重為7.12±0.6lmg。根據(jù)肌肉截面積＝濕重/(長度×1.05)的公式換算得出小鼠趾長伸肌的截面積，此處的1.05是骨骼肌的密度，根據(jù)公式計(jì)算出小鼠趾長伸肌的截面積為7.12/(11.18×1.05)＝0.57mm2。在實(shí)驗(yàn)中將所得的實(shí)測值，按照上述截面積換算成標(biāo)準(zhǔn)的肌肉張力單位(mN/mm2)。
通過給予波寬0.5ms、電壓40V的電脈沖經(jīng)電場刺激引出離體小鼠趾長伸肌等長性單收縮(isometric twitch contraction)，95標(biāo)本的測試表明最大單收縮力(Pt)為33.4±3.3mN/mm2，最大單收縮力上升速率(Pt/+dT/dt)為1819.9±137.1mN/mm2/sec，最大單收縮力下降速率(Pt/-dT/dt)為1497.4±246.7mN/mm2/sec，CT為20.9±3.0ms，1/2RT為15.9±11.0ms。通過給予波寬0.1ms、頻率50Hz、電壓40V的電脈沖經(jīng)電場刺激引出最大強(qiáng)直收縮(peak tetanic contraction)。95個(gè)標(biāo)本的測試表明最大強(qiáng)直收縮力(P0)為101.9±17.4mN/mm2，最大強(qiáng)直收縮力上升速率(P0/+dT/dt)為1754.5±268.9mN/mm2/sec，最大強(qiáng)直收縮力下降速率(P0/-dT/dt)為3797.4±119.6mN/mm2/sec。
黃芪提取物對低頻電刺激造成小鼠趾長伸肌疲勞恢復(fù)過程收縮性能的影響應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體小鼠趾長伸肌疲勞模型。經(jīng)測試，黃芪主要成分皂甙IV、皂甙II、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮糖甙、多糖等對低頻電刺激造成的疲勞均無明顯效果。為此，重點(diǎn)研究黃芪提取物對低頻電刺激造成小鼠趾長伸肌疲勞恢復(fù)的作用。黃芪提取物的用量為0.1mg/ml，陽性對照藥選擇咖啡因(Sigma)，其用量為1mmol/L。當(dāng)5分鐘持續(xù)低頻電刺激造成趾長伸肌疲勞后，用藥組立即加入0.1mg/ml黃芪提取物或1mmol/L咖啡因，觀察黃芪提取物和咖啡因?qū)ζ诨謴?fù)的作用。圖1為應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體小鼠趾長伸肌疲勞模型后的張力恢復(fù)曲線，疲勞后張力恢復(fù)的觀察時(shí)間分別為0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。圖中的A、B、C分別代表單純疲勞的、應(yīng)用黃芪提取物和咖啡因的張力恢復(fù)曲線。圖2為應(yīng)用頻率50Hz，波寬0.1ms的超強(qiáng)直流電串脈沖，以1次/秒速率刺激肌纖維標(biāo)本5分鐘(共300次)，造成離體小鼠趾長伸肌疲勞模型以及疲勞后的P0/±dT/dt恢復(fù)曲線，疲勞后P0/±dT/dt恢復(fù)的觀察時(shí)間同上。圖中的A、B、C分別代表單純疲勞的、應(yīng)用黃芪提取物和咖啡因的P0/±dT/dt恢復(fù)曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明疲勞組(n＝32)小鼠趾長伸肌在造模前Pt為32.7±3.4mN/mm2，Pt/+dT/dt為1769.6±119.9mN/mm2/sec，Pt/-dT/dt為1459.2±294.6mN/mm2/sec，CT為21.8±3.6ms，1/2RT為17.9±8.3ms；P0為99.2±17.3mN/mm2，P0/+dT/dt為1700.5±228.4mN/mm2/sec，P0/-dT/dt為3822.1±633.8mN/mm2/sec。黃芪提取物組(n＝32)造模前Pt為33.4±3.9mN/mm2，Pt/+dT/dt為1828.9±152.3mN/mm2/sec，Pt/-dT/dt為1509.1±230.5mN/mm2/sec，CT為19.7±3.3ms，1/2RT為14.9±3.9ms；表1.黃芪提取物對低頻電刺激(50Hz)造成的小鼠趾長伸肌疲勞后強(qiáng)直收縮恢復(fù)的作用

與Fatigue比較*P＜0.05，**P＜0.01與Caffine比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
P0為101.9±17.4mN/mm2，P0/+dT/dt為1754.5±268.9mN/mm2/sec，P0/-dT/dt為-3797.4±119.6mN/mm2/sec。咖啡因組(n＝31)造模前Pt為33.4±3.3mN/mm2，Pt/+dT/dt為1819.9±137.1mN/mm2/sec，Pt/-dT/dt為-1497.4±246.7mN/mm2/sec，CT為20.9±3.0ms，1/2RT為15.9±11.0ms；P0為103.3±15.8mN/mm2，P0/+dT/dt為1719.6±334.9mN/mm2/sec，P0/-dT/dt為-3797.7±763.5mN/mm2/sec。在正常情況下三組間的對照值非常接近，組間無差異(表1、表2)。
疲勞后小鼠趾長伸肌肌力的恢復(fù)過程見圖3和圖4。圖3說明了疲勞組、黃芪提取物和咖啡因組小鼠在經(jīng)低頻電刺激造成肌肉疲勞后60min趾長伸肌單收縮恢復(fù)過程中的Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt、CT及1/2RT的變化。圖4說明了疲勞組、黃芪提取物和咖啡因組小鼠在經(jīng)低頻電刺激造成肌肉疲勞后60min趾長伸肌強(qiáng)直收縮恢復(fù)過程中的P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt的變化。
表2.黃芪提取物對低頻電刺激(50Hz)造成的小鼠趾長伸肌疲勞后單收縮恢復(fù)的作用

與Fatigue比較*P＜0.05，**P＜0.01與Caffine比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01P0為101.9±17.4mN/mm2，P0/+dT/dt為1754.5±268.9mN/mm2/sec，P0/-dT/dt為-3797.4±119.6mN/mm2/sec?？Х纫蚪M(n＝31)造模前Pt為33.4±3.3mN/mm2，Pt/+dT/dt為1819.9±137.1mN/mm2/sec，Pt/-dT/dt為-1497.4±246.7mN/mm2/sec，CT為20.9±3.0ms，1/2RT為15.9±11.0ms；P0為103.3±15.8mN/mm2，P0/+dT/dt為1719.6±334.9mN/mm2/sec，P0/-dT/dt為-3797.7±763.5mN/mm2/sec。在正常情況下三組間的對照值非常接近，組間無差異(表1、表2)。
從上述兩圖中可以看到小鼠趾長伸肌經(jīng)低頻電刺激造成疲勞后，除CT及1/2RT的變化外，其余各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)值明顯下降，并且在恢復(fù)過程中，進(jìn)一步的下降，大約在疲勞后恢復(fù)的15分鐘時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)不再下降和趨于平穩(wěn)。同時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)的幅度也很少。疲勞組經(jīng)電刺激造成疲勞后恢復(fù)至60min，與恢復(fù)最低值比較，P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt分別上升了24.3％、24.4％、31.1％。Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt分別上升了4.4％、7.4％、18.8％。
咖啡因組小鼠趾長伸肌在用電刺激造成疲勞后，立即給予1mmol/L的咖啡因，在單收縮肌力恢復(fù)方面，引起即刻的Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt恢復(fù)，然后，出現(xiàn)一個(gè)緩慢的下降，大約在疲勞恢復(fù)后的20min，趨于穩(wěn)定，不再下降，但恢復(fù)也較少；在強(qiáng)直收縮肌力恢復(fù)方面，在給藥5min內(nèi)，引起一個(gè)快速的P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt上升，然后，呈現(xiàn)緩慢的上升，約在給藥40min后，P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt各數(shù)值趨于穩(wěn)定，即上升很少?？Х纫蚪M經(jīng)電刺激造成疲勞后恢復(fù)至60min，與恢復(fù)最低值比較，P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt分別上升了72.4％、50.2％、80.2％。Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt分別上升了1.1％、3.8％、36.1％。
黃芪提取物組小鼠趾長伸肌在用電刺激造成疲勞后，立即給予0.1mg/ml的黃芪提取物，在單收縮肌力恢復(fù)方面，先出現(xiàn)一個(gè)肌力下降的過程，這樣一個(gè)過程大約持續(xù)15-20min，然后Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt開始逐漸回升，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；在強(qiáng)直收縮肌力恢復(fù)方面，在給藥后，肌力開始上升，與咖啡因的效應(yīng)進(jìn)行比較，P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt回升是一個(gè)逐漸上升的過程，存在于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。這與咖啡因的效應(yīng)完全不同，其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。黃芪提取物組經(jīng)電刺激造成疲勞后恢復(fù)至60min，與恢復(fù)最低值比較，P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt分別上升了64.2％、39.6％、68.3％。Pt、Pt/+dT/dt、Pt/-dT/dt分別上升了35.2％、41.0％、48.5％。
3.黃芪提取物對低頻電刺激造成小鼠趾長伸肌疲勞恢復(fù)過程生化指標(biāo)的影響疲勞組、咖啡因組和黃芪提取物組三組小鼠離體趾長伸肌在收縮性能測試完畢后，經(jīng)冷凍和復(fù)溫后，測定肌纖維中糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和無機(jī)磷(Pi)的變化。為了與正常趾長伸肌中的生化指標(biāo)進(jìn)行比較，增加一組正常的、未經(jīng)電刺激造模的對照組。疲勞后，肌肉生化代謝發(fā)生明顯的變化，肌糖原、ATP和PCr的含量下降，乳酸和無機(jī)磷的含量升高。從表3中可見正常對照組的肌糖原含量為178.2±29.5μmol/g dry wt，疲勞組的肌糖原含量為77.4±26.7μmol/g dry wt，兩組比較，疲勞組的肌糖原含量為對照組的43.3％，約下降了一倍以上；黃芪提取物組的肌糖原含量為162.5±26.4μmol/g dry wt，與疲勞組比較，為疲勞組的213.4％，約增加了一倍以上，接近對照組的數(shù)值，說明黃芪提取物能夠明顯地增加疲勞時(shí)肌糖原的含量；咖啡因組的肌糖原含量為139.5±25.9μmol/g dry wt，與疲勞組比較，為疲勞組的180.2％，約增加了一倍左右，說明咖啡因同樣能夠明顯地增加疲勞時(shí)肌糖原的含量。小鼠的趾長伸肌在發(fā)生疲勞后，ATP的利用明顯增加，使細(xì)胞內(nèi)ATP含量急劇下降，正常時(shí)ATP含量為34.22±9.4μmol/g dry wt，當(dāng)疲勞發(fā)生后，下降到13.64±1.9μmol/g dry wt，應(yīng)用黃芪提取物和咖啡因能不同程度地增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量，與疲勞組進(jìn)行比較，P值分別小于0.05和0.01。對于PCr而言，黃芪提取物和咖啡因均不能對抗其下降。疲勞時(shí)，肌纖維內(nèi)乳酸和無機(jī)磷(Pi)含量增加，黃芪提取物和咖啡因均抑制疲勞引起的Pi含量的升高，但不能逆轉(zhuǎn)乳酸含量的升高。
表3.黃芪提取物對低頻電刺激(50Hz)造成的小鼠趾長伸肌疲勞后的肌肉生化代謝指標(biāo)(X±SD)的影響

與Fatigue比較*P＜0.05，**P＜0.01()內(nèi)數(shù)值為樣本數(shù)本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論和長期臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，對一定數(shù)量的補(bǔ)腎益肝填精中藥進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過濃縮提取的黃芪提取物對低頻疲勞具有明顯的恢復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用離體小鼠趾長伸肌作為標(biāo)本，通過給予低頻電刺激造成的疲勞，觀察到黃芪提取物具有明顯促進(jìn)低頻疲勞的恢復(fù)。
由于肌纖維的最大縮短速度(V0)與肌絲水解ATP的速率呈高度相關(guān)。在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)過程中，最大縮短速度(V0)很少或無改變。但在高強(qiáng)度作功時(shí)，V0能降低到疲勞前的40％，說明疲勞時(shí)肌絲水解ATP的速率受到限制。在橫橋周期速率中的速率限制步驟，目前還不清楚，很可能涉及到ADP解離步驟(肌動(dòng)球蛋白-ADP→肌動(dòng)球蛋白+ADP)。在去皮纖維實(shí)驗(yàn)中，已說明H+和ADP能降低V0，相反，Pi的增加，即使到達(dá)20mM也不影響V0。在疲勞的起始相，力快速下降而V0無變化。早期疲勞Pi的迅速增加是因?yàn)槭湛s活動(dòng)開始時(shí)ATP循環(huán)增加。在疲勞的第二相，P0出現(xiàn)緩慢下降和V0開始下降，這能夠通過H+的增加來解釋；在該相中，力的緩慢下降是由于ADP的增加，ADP增加已知能夠抑制V0和P0。在疲勞的最后相，肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)中Ca2+的釋放受到抑制，所以，力的下降歸結(jié)于細(xì)胞內(nèi)鈣([Ca2+]i)瞬時(shí)釋放的幅度降低。此外，疲勞肌的收縮時(shí)間(CT)和1/2松弛時(shí)間(1/2RT)的延長表明[Ca2+]i瞬時(shí)釋放延長。在強(qiáng)收縮活動(dòng)時(shí)，[Ca2+]i瞬時(shí)釋放延長部分是由于SR泵蛋白受到H+的抑制。ATP含量下降引起的ATP水解自由能的減少和ADP和Pi的增加都能夠損害SR泵的功能。肌肉疲勞恢復(fù)的研究表明恢復(fù)分快速和緩慢兩個(gè)時(shí)相，快速恢復(fù)時(shí)相大約在2分鐘內(nèi)完成；緩慢恢復(fù)時(shí)相需要30-60分鐘，這一時(shí)相的恢復(fù)與H+和Pi的含量高度相關(guān)?？焖贂r(shí)相的恢復(fù)發(fā)生在H+和Pi含量的恢復(fù)之前，所以，快速恢復(fù)時(shí)相與H+和Pi的含量無關(guān)，這樣，快速恢復(fù)時(shí)相很可能與興奮-收縮偶聯(lián)(excitation-contractioncoupling，E-C偶聯(lián))中的某些環(huán)節(jié)相關(guān)。在低頻活動(dòng)情況下，對低頻反應(yīng)的力需要幾小時(shí)才能恢復(fù)；特別是在長時(shí)間的低頻活動(dòng)時(shí)，對低頻反應(yīng)的力需要幾天而不是幾小時(shí)能恢復(fù)，這種疲勞稱為低頻疲勞。目前認(rèn)為低頻疲勞是由于抑制了SR的Ca2+釋放通道而不是SR Ca2+釋放的耗竭。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃芪提取物能夠使疲勞肌的P0、P0/+dT/dt、P0/-dT/dt值和Pt、P0t/+dT/dt、Pt/-dT/dt值在一個(gè)小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到一個(gè)可觀的水平，與咖啡因的結(jié)果進(jìn)行比較，咖啡因引起的恢復(fù)是非常快速的，而黃芪提取物引起的恢復(fù)是一個(gè)逐漸緩慢上升的過程。另外，在單收縮力的測定中觀察到黃芪提取物對CT和1/2RT影響不同于疲勞組和咖啡因組，疲勞時(shí)，黃芪提取物組的CT和1/2RT明顯長于疲勞組和咖啡因組，說明黃芪提取物能夠延長[Ca2+]i瞬時(shí)釋放。因此，黃芪提取物和咖啡因增加疲勞肌肌力的作用機(jī)制方面是有所不同的。有一點(diǎn)肯定是黃芪提取物將能夠影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量和SR的Ca2+釋放通道。這在應(yīng)用黃芪有效成分抗慢性心力衰竭的工作中已發(fā)現(xiàn)能增加細(xì)胞膜上Ca2+-ATPase的活性。
權(quán)利要求
1.一種黃芪提取物在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃芪提取物在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用，其特征在于該黃芪提取物是通過下列方法制備的1)原料黃芪藥材飲片藥材為山西省渾源產(chǎn)的膜莢黃芪；2)二次醇沉法提取黃芪浸膏黃芪藥材飲片加水，第一次為黃芪藥材重量的5倍量，第二、三次3倍量煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小時(shí)，合并三次煎液，濃縮至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量為70％，冷藏過夜，過濾，濾液濃縮至浸膏，加無水乙醇使浸膏含醇量為85％，冷藏過夜，濾過，濾液再次濃縮至浸膏，與黃芪藥材重量比較，濃縮100倍；3)提取黃芪提取物用相當(dāng)于步驟(2)制得的黃芪浸膏重量4倍量的60％乙醇加入上述黃芪浸膏中，進(jìn)行沉淀，去沉淀物，濃縮乙醇部分，該濃縮部分再用相當(dāng)于該濃縮物重量4倍量的80％乙醇沉淀，去沉淀物，濃縮乙醇部分得黃芪提取物，與步驟(2)制得的黃芪浸膏重量比較，濃縮5倍，呈微黃色的粉末狀。
全文摘要
本發(fā)明公開了中藥黃芪在制備抗疲勞藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過采用小鼠趾長伸肌的離體疲勞模型，觀察中藥黃芪的抗疲勞試驗(yàn)，結(jié)果表明黃芪能改善能量代謝、促進(jìn)酸堿平衡和內(nèi)環(huán)境的恒定的作用，提供了中藥黃芪在制備抗疲勞藥物中的新用途。
文檔編號A61K9/14GK1772036SQ200510110018
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者吳大正, 胡之璧, 周吉燕 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)