專利名稱：：一種從黃芪廢渣中提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從黃芪廢渣中提取、分離和純化功能性有效成分黃芪異黃酮的方法，具體是從生產(chǎn)加工黃芪注射液的黃芪廢渣中提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮的方法。
背景技術(shù)：
：黃芪首載于我國(guó)古代第一部本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科多年生草本植物蒙古黃甚Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bungevar.mongholicus(Bunge)Hsiao或膜英黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根。據(jù)藥典記載有黃芪味甘，性微溫，具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性、改善心功能、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、利尿消腫、益衛(wèi)固表、托瘡生肌、抗菌、抗病毒、抗疲勞、抗衰老、促進(jìn)造血功能、保護(hù)肝臟等功效。常用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久泄脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、久潰不斂、慢性腎炎、蛋白尿、糖尿病等癥。黃芪是名貴中藥材，主要含有皂苷、異黃酮、多糖等多種主要活性成分。目前，我國(guó)對(duì)黃芪的需求量呈逐年上升趨勢(shì)，年產(chǎn)量約為50萬(wàn)噸左右，年需量約為100萬(wàn)噸以上，早已顯現(xiàn)出供不應(yīng)求的情況。而被廣泛應(yīng)用的黃芪注射液即以黃芪為原料，采用水煎煮的方法提取黃芪皂苷等有效成分。在生產(chǎn)黃芪注射液過(guò)程中，大量的異黃酮類成分未能被提取出來(lái)，極大地浪費(fèi)了黃芪資源。已有相關(guān)研究報(bào)道，黃芪異黃酮是黃芪的次生代謝產(chǎn)物，芒柄花素和毛蕊異黃酮是黃芪異黃酮的主要成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪異黃酮類成分具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、降血脂和具有卵泡激素等作用，因此，提取、分離和純化異黃酮類成分已經(jīng)成為當(dāng)今黃芪研究的熱點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)高效利用黃芪資源的目的，本發(fā)明以工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的黃芪廢渣為原料，探索了一條經(jīng)濟(jì)、有效的提取、分離和純化黃芪異黃酮類成分的方法，不僅達(dá)到了高效利用黃芪資源，促進(jìn)了我國(guó)黃芪資源深度開(kāi)發(fā)和利用，而且為黃芪異黃酮的研究提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明旨在提供一種簡(jiǎn)單、快速、高效、低成本、高回收率、高資源利用度、適合于工業(yè)化生產(chǎn)的提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮的熟化路線。
發(fā)明內(nèi)容為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明以黃芪廢渣為原料，通過(guò)獨(dú)創(chuàng)性的勻漿萃取_混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)、負(fù)壓空化提取技術(shù)、液液萃取技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效提取、分離和純化技術(shù)手段，從而保證了在較低成本和較高收率的情況下，簡(jiǎn)單、快速、高效地獲得高純度、高回收率的芒柄花素和毛蕊異黃酮。包括以下具體步驟(1)勻漿萃取-混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化將黃芪廢渣和配制好的酶溶液按固液比1:1050(g:mL)混合，連續(xù)萃取15次，每次0.52min。將勻漿液放入搖床中恒4溫酶解，2550。C酶解624h，轉(zhuǎn)速100150rpm。(2)負(fù)壓空化提取將酶解液抽濾后，濾渣加入6090%乙醇溶液，壓力為0.020.09Mpa，固液比為1:1050(g:mL)，室溫提取15次，每次30120min。(3)液液萃取將得到的黃芪黃酮提取液合并，減壓濃縮后，以體積比1:11:5的乙酸乙酯作為萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取15次，減壓濃縮至干得到固形物。(4)大孔吸附樹(shù)脂富集精制合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至干，得到精制的富含異黃酮類活性成分的黃芪提取物。大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，保留液面，將液液萃取所得到的固形物用蒸餾水溶解后，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，上樣體積為1IOBV，流速為0.52BV/h。吸附后用2050%乙醇溶液1IOBV洗脫雜質(zhì)，然后用6080%乙醇溶液120BV洗脫目標(biāo)物質(zhì)。收集洗脫液，得到目標(biāo)化合物的富集液。(5)正相硅膠中壓柱層析所用樣品為樹(shù)脂富集后所得粗目標(biāo)產(chǎn)物，所用硅膠為300400目。稱取質(zhì)量為樣品量515倍的硅膠濕法裝柱，所用溶劑包括石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。將樣品用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1.21:3(w/w)的硅膠拌勻，水浴鍋上炒干，裝入已裝好的硅膠柱中。用三氯甲烷(乙酸乙酯)、三氯甲烷(乙酸乙酯)_甲醇、甲醇連續(xù)中壓洗脫1040BV，用硅膠薄層層析檢測(cè)洗脫液成分，展開(kāi)劑為三氯甲烷(乙酸乙酯)甲醇=10:12:i。(6)低溫析晶和重結(jié)晶重結(jié)晶所用的溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重結(jié)晶所用溶劑比例為三氯甲烷(二氯甲烷、乙酸乙酯)甲醇=20:ii:i，低溫析晶溫度為-io25t:。上述的黃芪中芒柄花素和毛蕊異黃酮的提取、分離和純化方法所用的混合酶為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、P-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶等。上述的黃芪中芒柄花素和毛蕊異黃酮的提取、分離和純化方法所用的大孔吸附樹(shù)脂分別為D101、DM130、NKA-9、AB-8、AL-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、ADS-11、ADS-17、ADS-21、ADS-31、D3520、FL_1、FL_2、FL_3、HPD450、HPD500、HPD600和HPD700等大孔吸附樹(shù)脂。傳統(tǒng)的提取方法如煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取、超聲提取和索式提取過(guò)程都是在完整植物細(xì)胞的情況下，通過(guò)浸潤(rùn)與滲透、使溶劑進(jìn)入組織細(xì)胞、溶解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)并使其擴(kuò)散至溶劑主體，這使溶劑提取細(xì)胞內(nèi)生物活性成分成為可能。但由于細(xì)胞壁的屏障作用，決定了中藥材有效成分的提取效率有一定限度，所以傳統(tǒng)提取方法存在提取溫度過(guò)高，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取率低，成本高，不安全等問(wèn)題。酶誘導(dǎo)是在提取的基礎(chǔ)上，利用混合酶將細(xì)胞壁的成分水解或降解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分充分暴露出來(lái)，溶解、混懸或膠溶于提取溶劑中，加速有效成分的釋放，從而提高提取效率。所謂空化(cavitation)，一般是指液體內(nèi)部局部壓力降低時(shí)，液體內(nèi)部或液固交界面上蒸汽或氣體的空穴(空泡)的形成、發(fā)展和潰滅的過(guò)程。當(dāng)潰滅發(fā)生在固體表面附近時(shí)，由于空泡瞬間(微秒級(jí))潰滅產(chǎn)生極高的瞬時(shí)壓強(qiáng)，極高壓強(qiáng)的反復(fù)作用，從而破壞固體表面。因此，負(fù)壓空化提取技術(shù)是利用負(fù)壓空化氣泡產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、湍流效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)，造成樣品顆粒細(xì)胞壁快速破裂，加速了胞內(nèi)物質(zhì)向介質(zhì)釋放、擴(kuò)散和溶解，從而促進(jìn)提取。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)51.本發(fā)明所用原料為工業(yè)生產(chǎn)中的黃芪廢渣，工藝簡(jiǎn)單易行，且對(duì)環(huán)境污染小，可以高效合理的利用黃芪資源，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。2.本發(fā)明采用勻漿萃取_混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)、負(fù)壓空化提取技術(shù)、液液萃取技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的技術(shù)手段，可以高效的提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮，且純度均可達(dá)95%以上，收率為80-95%。3.與傳統(tǒng)提取、分離和純化方法相比，該方法操作條件溫和，提取周期短，耗能低，生產(chǎn)成本低，可實(shí)現(xiàn)芒柄花素和毛蕊異黃酮大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。圖1為芒柄花素和毛蕊異黃酮的結(jié)構(gòu)(A)芒柄花素；(B)毛蕊異黃酮圖2為芒柄花素和毛蕊異黃酮的HPLC色譜圖(A)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖；(B)提取樣品HPLC色譜圖具體實(shí)施方案實(shí)施例1精密稱取黃芪廢渣1000g，取0.1%固形物質(zhì)量的混合酶(纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、木聚糖酶)溶解于10倍體積溫水中，連續(xù)勻漿萃取3次，每次2min。將勻漿液放入3(TC恒溫?fù)u床中恒溫酶解12h，酶解液抽濾后，濾渣加入70%乙醇溶液負(fù)壓空化提取，壓力為0.05Mpa，固液比為1:10(g:mL)，室溫提取3次，每次45min，將抽濾后的酶解液和負(fù)壓空化提取液合并，減壓濃縮至干后用水溶解，以等體積的乙酸乙酯為萃取溶劑萃取3次，減壓濃縮至干得到固形物。固形物用水溶解后，通過(guò)ADS-ll大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，上樣量為2BV，流速為lBV/h。吸附后用30X乙醇溶液3BV洗雜質(zhì)，然后用60%乙醇溶液10BV解吸。收集解吸液，濃縮至干后用少量甲醇溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1.2(w/w)的目數(shù)為300400的層析硅膠炒樣。預(yù)先稱取質(zhì)量為樣品量的515倍的硅膠，用乙酸乙酯濕法裝柱，將拌好樣品的硅膠裝入中壓柱內(nèi)，然后以TLC監(jiān)測(cè)收集洗脫液，濃縮分別得到芒柄花素和毛蕊異黃酮產(chǎn)品，低溫析晶和重結(jié)晶后最終得到芒柄花素102.21mg，純度為95%，收率為85.18%;毛蕊異黃酮90.34mg，純度為97%，收率為92.18%。實(shí)施例2精密稱取黃芪廢渣1000g，取0.3%固形物質(zhì)量的混合酶(半纖維素、13-葡萄糖苷酶、漆酶、淀粉酶)溶解于15倍體積溫水中，連續(xù)勻漿萃取5次，每次lmin。將勻漿液放入3(TC恒溫?fù)u床中恒溫酶解24h，酶解液抽濾后，濾渣加入90%乙醇溶液負(fù)壓空化提取，壓力為0.06Mpa，固液比為l:15(g:mL)，室溫提取5次，每次30min，將抽濾后的酶解液和負(fù)壓空化提取液合并，減壓濃縮至干后用水溶解，以1:1.5(v/v)的乙酸乙酯作為萃取溶劑萃取5次，減壓濃縮至干得到固形物。固形物用水溶解后，通過(guò)HPD-500大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，上樣量為4BV，流速為0.5BV/h。吸附后用40%乙醇溶液5BV洗雜質(zhì)，然后用70%乙醇溶液15BV解吸。收集解吸液，濃縮至干后用少量甲醇溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1.2(w/w)的目數(shù)為300400的層析硅膠炒樣。預(yù)先稱取質(zhì)量為樣品量的515倍的硅膠，用乙酸乙酯濕法裝柱，將拌好樣品的硅膠裝入中壓柱內(nèi)，然后以TLC監(jiān)測(cè)收集洗脫液，濃縮分別得到芒柄花素和毛蕊異黃酮產(chǎn)品，低溫析晶和重結(jié)晶后最終得到芒柄花素101.85mg，純度為98%，收率為84.88%;毛蕊異黃酮88.92mg，純度為96%，收率為90.73%。本發(fā)明中，結(jié)果定量檢測(cè)分析采用下表?xiàng)l件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種從黃芪廢渣中提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮的方法，其特征在于包括如下步驟(1)勻漿萃取-混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化將黃芪廢渣和配制好的酶溶液混合后，連續(xù)勻漿萃取，一定時(shí)間后，放入恒溫?fù)u床中進(jìn)行酶解，得到黃芪的酶解液；(2)負(fù)壓空化提取將酶解液抽濾，濾渣用醇溶液進(jìn)行負(fù)壓空化提取，提取結(jié)束后抽濾，得黃芪黃酮提取液；(3)液液萃取將得到的黃芪黃酮提取液合并，減壓濃縮后，以乙酸乙酯作為萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取液合并后，減壓濃縮至干得到固形物；(4)大孔吸附樹(shù)脂富集固形物加水溶解后上大孔吸附樹(shù)脂柱，分別用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集乙醇洗脫部分得到目標(biāo)化合物的富集液；(5)硅膠柱層析富集液濃縮，用有機(jī)溶劑溶解后上硅膠柱，用不同比例的溶劑進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)的洗脫部分，得到芒柄花素和毛蕊異黃酮溶液；(6)低溫析晶和重結(jié)晶芒柄花素和毛蕊異黃酮溶液，經(jīng)過(guò)低溫析晶得到最終目標(biāo)化合物，重結(jié)晶后得到純度均大于95％的芒柄花素和毛蕊異黃酮。2.按照權(quán)利要求1所述的勻漿萃取_混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，其特征在于勻漿萃取所用的溶劑為配制好的酶溶液，按固液比1:1050(g:mL)混合，連續(xù)萃取15次，每次0.52min。將勻漿液放入恒溫?fù)u床中，在255(TC酶解624h，轉(zhuǎn)速100150rpm。勻漿過(guò)程產(chǎn)生的強(qiáng)大剪切力，兼具打破細(xì)胞壁、使植物組織細(xì)胞與酶充分接觸以及瞬時(shí)剌激誘發(fā)內(nèi)源性酶活性的作用，使目標(biāo)化合物從細(xì)胞內(nèi)向溶劑中充分釋放，增加目標(biāo)成分的含量。經(jīng)過(guò)恒溫酶解誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化，利用酶反應(yīng)的高效性、專一性等特性，將細(xì)胞壁的主要成分纖維素、半纖維素和果膠水解或降解，使有效成分充分的暴露出來(lái)，溶解、混懸或膠溶于提取液中，從而使細(xì)胞內(nèi)有效成分含量顯著提高。此過(guò)程所用的混合酶為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、13-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶等。3.按照權(quán)利要求1所述的負(fù)壓空化提取技術(shù)，其特征在于將酶解液抽濾后，濾渣加入6090%乙醇溶液，壓力為0.020.09Mpa，固液比為1:1050(g:mL)，室溫提取15次，每次30120min。負(fù)壓空化提取方法是以負(fù)壓為動(dòng)力，利用氣泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)、湍流效應(yīng)而產(chǎn)生的高速傳質(zhì)液固提取技術(shù)。4.按照權(quán)利要求1所述的液液萃取技術(shù)，其特征在于將得到的黃芪黃酮提取液減壓濃縮，以體積比l:11:5的乙酸乙酯作為萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取15次，減壓濃縮至干得到固形物。5.按照權(quán)利要求1所述的大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)，其特征在于所用樹(shù)脂包括DIOI、DM130、NKA-9、AB_8、AL_2、ADS_5、ADS_7、ADS_8、ADS-ll、ADS_17、ADS_21、ADS_31、D3520、FL-l、FL-2、FL-3、HPD450、HPD500、HPD600和HPD700等大孔吸附樹(shù)脂。該方法中大孔吸附樹(shù)脂采用濕法裝柱，上樣體積為1IOBV，流速為0.52BV/h。吸附后用2050%乙醇溶液1IOBV洗脫雜質(zhì)，然后用6080%乙醇溶液120BV洗脫目標(biāo)物質(zhì)。收集洗脫液，得到目標(biāo)化合物的富集液。6.按照權(quán)利要求1所述的正相硅膠中壓柱層析技術(shù)，其特征在于所用硅膠為300400目，稱取質(zhì)量為樣品量515倍的硅膠濕法裝柱，所用溶劑包括石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。將樣品用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與浸膏質(zhì)量比為1:1.21:3(w/w)的硅膠拌勻，水浴鍋上炒干，裝入已裝好的硅膠柱中。用三氯甲烷(乙酸乙酯)、三氯甲烷(乙酸乙酯)-甲醇、甲醇連續(xù)中壓洗脫1040BV，用硅膠薄層層析檢測(cè)洗脫液成分，展開(kāi)劑為三氯甲烷(乙酸乙酯)甲醇=io:i2:i。7.按照權(quán)利要求i所述的低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)，其特征在于重結(jié)晶所用的溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重結(jié)晶所用溶劑比例為三氯甲烷(二氯甲烷、乙酸乙酯)甲醇=20:ii:i，低溫析晶溫度為-io25°c。全文摘要本發(fā)明提供了一種從黃芪廢渣中提取、分離和純化芒柄花素和毛蕊異黃酮的方法，所采取的技術(shù)方案是以黃芪注射液生產(chǎn)加工后廢渣為原料，采用獨(dú)創(chuàng)性的勻漿萃取-混合酶誘導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)、負(fù)壓空化提取技術(shù)、液液萃取技術(shù)、大孔吸附樹(shù)脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列高效提取、分離和純化技術(shù)手段，得到高純度的芒柄花素和毛蕊異黃酮，其純度均可達(dá)95％以上，收率為80-95％。本發(fā)明所用原料為工業(yè)生產(chǎn)中的廢渣，工藝簡(jiǎn)單易行，且對(duì)環(huán)境污染小，所獲得的芒柄花素和毛蕊異黃酮具有生產(chǎn)成本低、純度高、收率高、重復(fù)性好、高效利用黃芪資源等特點(diǎn)，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。文檔編號(hào)C07D311/36GK101775418SQ20101010196公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者付玉杰,孔羽,祖元?jiǎng)?羅猛,趙寶山,閆明明,陳彩云,顧成波申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué);付玉杰