一種基于原位形成光活性納米材料模擬酶的堿性磷酸酯酶活性檢測方法
【專利說明】
活性檢測方法技術(shù)領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明涉及納米科技領(lǐng)域和生物分析檢測領(lǐng)域，尤其涉及新型的光活性納米材料模擬酶及其在堿性磷酸酯酶活性檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]堿性磷酸酯酶(ALP)是廣泛存在于各種生物組織中的一種酶。ALP的存在濃度與骨骼疾病、肝炎以及前列腺癌等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[Colombatto P.；Randone A.；Civitico G.；Gorin J.M.；Dolci L ；Medaina N.；01iveri F.；Verme G.；Marchiaro G.；Pagni R.；Karayiannis P.；Thomas H.C.；Hess G.；Bonino F.；Brunetto M.R.J.ViralHepatitis 1996，3，301-306]。此外，ALP具有催化活性高，穩(wěn)定性好，成本低，廣泛的底物特異性等優(yōu)點(diǎn)，是一種被廣泛使用的免疫分析標(biāo)記物，被用于酶聯(lián)免疫測定中[LeiJ.；Ju H.Chem.Soc.Rev.2012，41，2122-2134 ;Akanda M.R.；Tamilavan V.；Park S.；Jo K.；Hyun Μ.H.;Yang H.Anal.Chem.2013, 85, 1631-1636 ；Xian Y.L.；Wang Z.； JiangX.Y.ACS Nano 2014，8，12741 - 12747 ；Geraud E.；Prevot V.；Forano C.；Mousty C.Chem.Commun.2008, 13，1554 - 1556]。在酶聯(lián)免疫測定中，抗原與抗體之間可以產(chǎn)生特異性的結(jié)合，通過標(biāo)記在抗體上的ALP的催化反應(yīng)產(chǎn)生測量信號。因?yàn)閱蝹€酶分子可以催化許多個底物分子產(chǎn)生大量的產(chǎn)物，從而使檢測信號放大[Zhang B.；Tang D.；Goryacheva 1.；Niessner R.；Knopp D.Chem.-Eur.J.2013，19，2496-2503]。目前，以天然酶為標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫吸附分析在環(huán)境檢測、食品安全及臨床診斷等方面已經(jīng)成長為重要的技術(shù)之一 [Quff.；LiuY.；Liu D.；ffang Z.Jiang X.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3442-3445]。因此，ALP活性的檢測在臨床疾病診斷以及免疫分析研宄中具有重要意義。
[0003]目前，大部分針對ALP的檢測方法雖然較為簡單，但是，由于這類方法單純依靠ALP催化產(chǎn)生的產(chǎn)物的電化學(xué)信號或光信號進(jìn)行檢測，缺少信號放大策略，方法的靈敏度不是很高[Gao Z.；Xu M.；Hou L.；Chen G.；Tang D.Anal.Chem.2013, 85, 6945 - 6952 ；ZhangL.；Zhao J.；Duan M.；Zhang H.；Jiang J.；Yu R.Anal.Chem.2013，85，3797-3801 ；Wei H.；Chen C.；Han B.；Wang E.Anal.Chem.2008，80，7051 - 7055 ;Qian Z.；Chai L ;Tang C.；Huang Y.；Chen J.；Feng H.Anal.Chem.2015，87，2966-2973]。所以，探索高效的信號放大策略以建立高靈敏的ALP活性的檢測方法仍然是需要解決的問題。
[0004]隨著納米科技的發(fā)展，基于納米材料的分析方法因其具有快速、靈敏的特點(diǎn)以及更加容易微型化等優(yōu)點(diǎn)引起了大家廣泛的關(guān)注。納米材料模擬酶具有高效的模擬酶活性，并且還具有穩(wěn)定性好，酶活性容易調(diào)節(jié)等特點(diǎn)[Wei H.;Wang E.Chem.Soc.Rev.2013，42，6060 - 6093 ；Lin Y.H.；Ren J.S.；Qu X.G.，Acc.Chem.Res.2014，47，1097 -1105]。盡管具有過氧化物酶活性的納米材料具有較好的活性，但缺乏方便的手段控制和觸發(fā)其類酶活性。另外，此類酶在工作時依賴具有危害性的過氧化氫作為電子受體。這些問題嚴(yán)重限制著過氧化物納米材料模擬酶的活性、生物相容性及其在生物分析中的應(yīng)用[TaoY.；Lin Y.H.；Huang Ζ.Ζ.；Ren J.S.；Qu X.G.Adv.Mater.2013，25，2594 - 2599]。目前的納米材料模擬酶幾乎都是采用一定的化學(xué)試劑反應(yīng)制備好后使用。與當(dāng)前的研宄不同，本發(fā)明利用天然酶酶的催化反應(yīng)原位形成了一種具有較高催化活性的光活性納米材料模擬酶。堿性磷酸酯酶(ALP)催化磷酸酯類底物如鄰苯二酚磷酸酯、水楊酸磷酸酯的水解反應(yīng)產(chǎn)生的含有雙羥基的化合物能夠與二氧化鈦納米材料表面的鈦(IV)發(fā)生特異性的絡(luò)合反應(yīng)，在納米材料表面形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。單獨(dú)的二氧化鈦納米材料并沒有表現(xiàn)出光活性模擬酶性質(zhì)，而結(jié)合了雙羥基化合物的二氧化鈦納米材料可以在可見光光照條件下產(chǎn)生較高的模擬氧化酶活性。該氧化酶的活性可以通過光照方便的進(jìn)行調(diào)控；在不依靠過氧化氫的存在下，表現(xiàn)出了很高的類酶催化活性，表明其具有更好的穩(wěn)定性和生物相容性。與大多數(shù)納米材料模擬酶相比，本方法的特點(diǎn)在于此納米光活性模擬酶通過ALP的原位催化反應(yīng)產(chǎn)生；與常規(guī)的ALP活性檢測方法相比(單純依靠催化反應(yīng)的產(chǎn)物的電化學(xué)/光學(xué)信號)，ALP的催化產(chǎn)物原位形成的納米光活性模擬酶進(jìn)一步對ALP活性的檢測產(chǎn)生了良好的信號放大作用。實(shí)現(xiàn)了 ALP活性的高靈敏檢測，檢測限低至0.01U/L，遠(yuǎn)低于成人血清中 ALP 的含量 40-190U/L[Hausamen T.U.；Helger R.；Rick ff.；Gross ff.Clin.Chim.Acta1967，15，241-245]。滿足實(shí)際樣品中ALP的檢測需求。據(jù)我們所知，利用酶催化反應(yīng)原位形成的光活性納米材料模擬酶進(jìn)行酶活性檢測，尚無文獻(xiàn)報道。該方法在ALP的檢測以及以ALP為標(biāo)記物的免疫分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于光活性納米材料模擬酶的堿性磷酸酯酶活性檢測方法，該光活性納米材料模擬酶可以通過堿性磷酸酯酶的催化反應(yīng)原位產(chǎn)生；利用堿性磷酸酯酶催化反應(yīng)形成的光活性納米材料模擬酶的高效類酶催化活性實(shí)現(xiàn)信號放大，可以方便、靈敏、快速地檢測堿性磷酸酯酶活性。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn):
[0007]a、二氧化鈦納米材料的制備:將5mL含鈦化合物逐滴加入到75mL超純水中，混合后的溶液在室溫下持續(xù)攪拌。然后將上述溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜內(nèi)并加熱到160°C持續(xù)24h。離心獲得產(chǎn)物并用超純水洗滌多次，最后烘干獲得白色二氧化鈦納米顆粒；
[0008]b、堿性磷酸酶活性的測定:5 μ mo I/L的堿性磷酸酶的底物與10 μ L不同濃度的堿性磷酸酯酶混合后加入到96微孔板中，室溫下反應(yīng)一段時間；加入10 μ L 1.5mg/mL的二氧化鈦納米材料反應(yīng)15min后，加入100 μ L pH為4.0的0.2mol/L的醋酸緩沖溶液和20