一種葛花降糖活性的定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領域，特別是一種葛花降糖活性的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 現(xiàn)行中藥質量控制方法主要借鑒化學藥的質量控制模式與方法，即以定性、定量 測定成分為主。然而中藥不同于單一成分的化學藥，一般來說中藥成分極其復雜，單一成分 難以代表體現(xiàn)中藥整體，難以關聯(lián)中藥藥效。由此，《中國藥典》2010年版編制大綱明確指 出，要建立符合中醫(yī)藥特點的質量標準體系，逐步由單一指標性成分定性定量向活性、有效 成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分及和指紋或特征圖譜整體質量控制模式轉化。 由此而制定的"中藥生物活性測定指導原則"已被《中國藥典》（一部）2010年版附錄收載。
[0003] 葛花又名葛條花，為豆科植物葛Puerarialobata(Willd. )Ohwi的干燥花蕾。性 涼、味甘，入陽明經(jīng)。為傳統(tǒng)中藥，《神經(jīng)農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等記載其具有解酒醒脾、 除煩止渴之功效，主治醉酒、發(fā)熱煩渴等癥?，F(xiàn)代研宄葛花所含化學成分非常復雜，有揮發(fā) 油類、黃酮類等等，如丁香油酚、芳樟醇、苯甲酸甲酯、丙酸甲酯、異戊酸甲酯、正己酸甲酯、 染料木素、槲皮素、葛花甙、槐花二醇、0 _谷留醇、葛花異黃酮等等，多數(shù)成分有明顯藥理活 性。與葛花同基源(來源于同一植物的不同部位)的另外一種中藥葛根被證明具有降低血糖 的藥理作用。葛花、葛根均在糖尿病的臨床治療中體現(xiàn)了良好的具有除煩止渴的功效，且基 源相同，但是對于葛花的降糖作用鮮有研宄，更是缺乏相應的生物活性檢定方法用于葛花 的質量控制評價。因此，急需建立對葛花降糖活性的定量檢測方法。
[0004] a -葡萄糖苷酶（a -glucosidase，EC3. 2. 1. 20)又叫a -D-葡萄糖苷水解酶，食 物中的碳水化合物主要成分是淀粉，麥芽糖和蔗糖。淀粉和蔗糖（雙糖）均不能直接被腸 壁細胞吸收。唾液和胰a-淀粉酶（a-Amylase)使淀粉水解生成寡糖及二糖，寡糖及二糖 還需要在小腸上皮絨毛膜刷狀緣上的a-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成單糖(葡萄糖）后 才能被吸收。a-葡萄糖苷酶不僅可以從低聚糖類的非還原末端切開a-1，4糖苷鍵，釋放 出葡萄糖，而且在糖蛋白和糖脂的形成中也有關鍵的影響。在動物體內(nèi)，它主要存在于小腸 上半段的刷狀緣上它對食物中碳水化合物的消化起著非常重要的作用。a _葡萄糖苷酶抑 制劑是二十世紀八十年代出現(xiàn)的一類新的藥物，它通過抑制a -葡萄糖苷酶的活性，延緩 總體碳水化合物的消化時間，從而降低餐后高血糖，防治糖尿病并減少糖尿病并發(fā)癥?，F(xiàn)有 上市的糖尿病治療藥物，如，阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等藥物已取得了良好的臨床 治療效果。目前篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑主要是根據(jù)Piere C等的方法，即以4-硝基 酷-a -D-吡喃葡糖苷（p-Nitrophenol- a -glucopyramoside， PNPG)為底物，在波長400nm(或405nm)處測定在酶作用下釋放出的有顏色的物質硝 基酚（PNP)的量，如果反應體系中有影響酶活性的物質，則PNP的量會發(fā)生改變，所得吸光 度也會改變，從而測定和計算抑制或促進酶的活性大小，分別可以用抑制率或促進率表示。
[0005] 對于藥品進行質量控制的生物活性測定法又稱生物檢定（bioassay)，常用于抗生 素、生物制劑的質量控制，它是嚴格按照藥品檢定要求設計試驗，將藥物在體內(nèi)或體外的生 物反應值經(jīng)一定統(tǒng)計學處理，用以定性、定量或半定量的表征該藥品質量。其中《中國藥典》 2010版.二部附錄XIV生物檢定統(tǒng)計法中規(guī)定的"量反應的平行線測定法（2*2)"法、"量 反應的平行線測定法（3*3)"法等便是得到專業(yè)認可的藥品效價測定方法。該類方法依據(jù) 平行線測定原理，即待測樣品與對照品在一定條件下的生物活性測定中"量一效關系曲線" 保持平行，再對二者劑量與效應值進行統(tǒng)計學處理，便可得出被測樣品的效價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種葛花降糖活 性的定量檢測方法，可有效解決對葛花降糖活性進行定量檢測問題。
[0007] 本發(fā)明的技術方案為，包括以下步驟： 1) 葛花供試藥物的制備： 將葛花藥材凈選，粉碎，加入葛花重量8~12倍的雙蒸水浸泡25~35分鐘，超聲提取 15~25分鐘，抽濾，得葛花水提物母液，母液質量濃度為0.lg/mL，即為葛花供試藥物，密封， 閉光40 °C保存； 2) 檢測用溶液的配制： (1) 制備PBS磷酸緩沖液： 將2. 0-2. 5gK2HP04溶解在100mL雙蒸水中，制成K2HP04母液；稱取3. 2-3. 6gKH2P04 溶解在100mL雙蒸水中，制成KH2P04母液；取K2HP04母液30-31ml、KH2P04母液29-31ml，混 勻，得PBS磷酸緩沖液； (2) 制備a-葡萄糖苷酶溶液： 將30U/mg的a-葡萄糖苷酶凍干粉9-llmg溶于28-32ml的PBS磷酸緩沖液中，再加 入55-65mg小牛血清白蛋白，混勻成a-葡萄糖苷酶溶液，4°C保存； (3) 制備PNPG溶液： 將85-95mgPNPG溶于28-32ml雙蒸水中，得PNPG溶液； (4) 制備似20)3溶液： 將l〇-llg無水Na2C03溶于90_11〇1111雙蒸水中，得似20)3溶液 ； 3) 制備對照品溶液： 取對照品40~60mg，溶于0. 5~1. 5ml雙蒸水中，離心，取上清，即得對照品溶液；所述的 對照品為阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一種； 4) 測定葛花對a-葡萄糖苷酶活性抑制率： 在樣品管中加入葛花供試藥物0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混勻；在空白管 中加入PBS磷酸緩沖液0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混勻；在背景管中加入PBS磷 酸緩沖液〇. 3~0. 4ml、對照品溶液0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混勻；然后將上述 溶液在35~40°C保溫8~12min，向空白管和樣品管中分別加入a-葡萄糖苷酶〇. 2~0. 3ml， 35~40 °C保溫18~22min;向空白管、樣品管和背景管中加入Na2C03溶液0. 4~0. 6ml，靜置 4~6min，從上述管中分別取180~220y1溶液置于96孔板中，在波長400nm處用酶標儀分 別測定各孔板中溶液的吸光度0D值，每管做3個重復，取平均值計算，并將得到的吸光度0D 值代入以下公式計算，得葛花對a_葡萄糖苷酶活性抑制率： 酶活性抑制率=[0D空白組_ (0D樣品組-0D背景組）]/0D空白組X100% ; 5)效價測定與計算： 將葛花供試藥物的劑量、對照品的劑量、葛花對a _葡萄糖苷酶活性抑制率、對照品的 約定效價值、待測樣品的估計效價值分別輸入中國藥典生物檢定統(tǒng)計程序BS2000進行計 算，即得葛花樣品的效價值，實現(xiàn)葛花質量的評價； 將葛花供試藥物的劑量調(diào)整到〇. eSmgmr1，對照品的劑量調(diào)整為 0.0 C^SmgmL^^O. OlOOmg*!!!!/1，方可進行效價測定，對照品的約定效價值為100U*mg4,并根 據(jù)預實驗進行葛花的效價估計(說明：1、關于對照品效價的約定：葛花的效價值是通過與 標準品比較而來的，而標準品要經(jīng)過國家法定部門認定，在國家認定前我們稱之為"工作對 照品"，其效價值首次要人為賦予，就像長度值最初來源是"通過巴黎的地球子午線全長的 四千萬分之一作為長度單位米"。一般約定單位重量的工作對照品生物效價為整數(shù)，為了方 便計算，本試驗中對照品的約定效價值為l〇〇U*mg'效價的單位常用"U"表示.2、關于 被測樣品的效價估計：葛花的效價估計不同批次樣品估計值不一樣，估計值主要依據(jù)預實 驗繪制對照品與被測樣品的量效關系圖(就像附圖圖4)進行估計，如某次實驗（因為每次測 定數(shù)據(jù)均不相同，為了方便說明數(shù)據(jù)純粹假設）工作對照品在〇. 075 mg^r1時的抑制率為 50%，被測樣品在0. -gmr1時的抑制率為50%，則被測樣品估計效價為對工作照品效價的 1/5. 3)〇
[0008] 本發(fā)明操作簡單、快捷，效果好，費用低，基于葛花對a _葡萄糖苷酶活性的抑制， 對葛花樣品的效價值進行測定及質量控制評價，具有良好的經(jīng)濟和社會效益。
【附圖說明】
[0009] 圖1為葛花抑制a-葡萄糖苷酶活性的研宄與測定的工藝路線圖。
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