糞便取樣提取黔金絲猴基因組dna的方法
【專利摘要】糞便取樣提取黔金絲猴基因組DNA的方法，取凍存黔金絲猴糞便于滅菌燒杯中，加TE溶解，攪拌靜置；取清液于Eppendorf管中，做10管，離心；取清液置Eppendorf管，離心，獲腸壁脫落細(xì)胞；加預(yù)冷的丙酮，洗沉淀，離心，傾去丙酮，重復(fù)洗3次，晾干；加入TE和溶菌酶置于37℃條件下保溫；離心，棄上清液；于沉淀中加入裂解液和的蛋白酶K置于55℃溫浴3h以上；加RNAse放置于37℃條件下保溫；將Eppendorf管于94℃沸水浴中放置；離心，取清液，加入兩倍體積無水乙醇混勻置-20℃ 30 min以上；離心，用預(yù)冷70%乙醇洗滌沉淀兩次，離心，待沉淀干燥后加入TE溶解DNA，-20℃保存。
【專利說明】糞便取樣提取黔金絲猴基因組0…的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組0嫩的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]齡金絲猴(1)1-6110111^隸屬于靈長(zhǎng)目(/?'胍((95)猴科(06^00^)1 ^601(136)仰鼻猴屬(熱//?0/7/ ^60118),是傳說中美猴王孫悟空的原形，外形惹人喜愛，具有相當(dāng)觀賞價(jià)值。在我國(guó)特有的三種金絲猴中，黔金絲猴數(shù)量最少，棲息地最狹窄，是珍稀保護(hù)動(dòng)物，被譽(yù)為“世界的獨(dú)生子”，僅存800只左右分布于貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)約340平方公里范圍內(nèi)，比國(guó)寶大熊貓還要稀少。早在1989年就列為我國(guó)一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物；1996年列入瀕危動(dòng)物紅皮書瀕危⑶級(jí))⑴。保護(hù)黔金絲猴既是保護(hù)自然環(huán)境的重要內(nèi)容之一，也與人類自身生存息息相關(guān)，對(duì)黔金絲猴遺傳變異水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)的深刻認(rèn)識(shí)，能制定合理、科學(xué)、有效的保護(hù)措施，這對(duì)于極度瀕危的黔金絲猴來說是迫在眉睫。但是，由于野外黔金絲猴采集血樣困難，保護(hù)遺傳學(xué)研宄難以全面深入展開。
[0003]非損傷性取樣821卹1丨叩)是在不捕捉和不干擾動(dòng)物正?；顒?dòng)情況下，收集動(dòng)物脫落毛發(fā)、糞便、口腔黏膜細(xì)胞、尿液等樣品，從中獲取0嫩的方法。其中糞便含有成千上萬的腸壁脫落細(xì)胞，是最具潛力的0嫩資源?]。1992年1社訪匕1恥88等首先用糞便做材料對(duì)棕熊線粒體控制區(qū)141恥的片段進(jìn)行分析，標(biāo)志著糞便0嫩分析技術(shù)建立；1997年，]8116 2 066(1等匸5]首次提出分子糞便學(xué)8(^1:0100)概念，提倡運(yùn)用分子糞便學(xué)技術(shù)，以為基礎(chǔ)，有效開展個(gè)體識(shí)別、性別鑒定、野外種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和種群大小預(yù)測(cè)等研宄。糞便提取0嫩的可靠性已經(jīng)在許多文獻(xiàn)中證實(shí)，丁波等⑹通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)糞便0嫩進(jìn)行特異性擴(kuò)增是可靠的；1八了等⑺在對(duì)不同方法保存糞便的效果進(jìn)行討論時(shí)指出，超過60%的糞便0嫩樣品可以獲得與血液0嫩一致的結(jié)果；
??！ 8等運(yùn)用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)美洲獅糞便0嫩進(jìn)行分析的結(jié)果也表明，糞便0嫩可以獲得與肌肉樣品一致的基因型結(jié)果。張志敏⑼通過糞便取樣對(duì)亞洲黑熊腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子全長(zhǎng)基因分析證實(shí)糞便取樣的可靠性。
[0004]目前關(guān)于黔金絲猴的報(bào)道僅幾篇，主要集中在個(gè)體水平上黔金絲猴形態(tài)習(xí)性、生態(tài)環(huán)境和人工飼養(yǎng)等方面描述〔13，14]；國(guó)內(nèi)楊眸宇等(2002年)用放射免疫法對(duì)黔金絲猴血清1231與￡2進(jìn)行測(cè)定[15]；李明等(2004年)報(bào)道了從線粒體0嫩細(xì)胞色素6 (402?))和(387?))基因片段推斷四種金絲猴間種系發(fā)生關(guān)系，認(rèn)為金絲猴是一個(gè)獨(dú)立屬，川金絲猴、滇金絲猴和越南金絲猴可能是從齡金絲猴中分化出來的種[16]I 61:已1(2009年)評(píng)價(jià)了黔金絲猴的生殖參數(shù)，認(rèn)為黔金絲猴比川金絲猴和滇金絲猴面臨更高滅絕風(fēng)險(xiǎn)[17]；但是，由于采集血樣的限制，相關(guān)研宄進(jìn)展比較緩慢。
[0005]？161~1~6 1^)361*161:等[18]曾指出，用糞便樣品作為實(shí)驗(yàn)材料，通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的可靠性可達(dá)到99%，同時(shí)為排除污染，提取過程中設(shè)置陰性對(duì)照十分必要。本文參照問現(xiàn)在中方法，但對(duì)方法中酚氯仿抽屜去除蛋白質(zhì)的方法改進(jìn)為941:加熱10111111讓蛋白質(zhì)變性〔10，11]，操作簡(jiǎn)便、試劑成本低、所提取的0嫩純度高。因此，該方法在分子糞便學(xué)中值得推廣。在糞便0嫩提取和擴(kuò)增過程中均設(shè)置陰性對(duì)照，甚至對(duì)抽提陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，排除實(shí)驗(yàn)過程中人為操作造成污染的可能性；同時(shí)以毛發(fā)做陽(yáng)性對(duì)照和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)糞便中各種雜質(zhì)和微生物可能造成的污染，徹底排除污染干擾。為獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者對(duì)采集的糞便樣品做3次重復(fù)抽提0嫩；每次糞便抽提做十管(包括陰性對(duì)照),平均而言有6?8管可以得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物(60?8090，這個(gè)比例已經(jīng)相當(dāng)高；對(duì)每次提取的糞便基因組0嫩做三次重復(fù)擴(kuò)增，選取其中六個(gè)擴(kuò)增良好的產(chǎn)物和兩次毛發(fā)0嫩擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，其中3個(gè)糞便和一個(gè)毛發(fā)擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序，獲得相同結(jié)果，充分證明本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0006]已有資料表明，每克人新鮮糞便中含有3.0父106~4 0父106個(gè)腸壁脫落細(xì)胞，而且大部分是活細(xì)胞〔19〕。因此從理論上講，糞便中可以提取到完整基因組0嫩。從本文結(jié)果看，丙酮洗滌結(jié)合煮沸法去除蛋白質(zhì)，對(duì)于無水乙醇保存糞便，可提取到大小在23吐左右的基因組0嫩，沒有降解，足以滿足研宄人員對(duì)基因組0嫩操作的一般需求。如果結(jié)合特殊提取方法，我們可能得到更大的基因組0嫩片段(有待進(jìn)一步研宄X傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，糞便0嫩降解嚴(yán)重，很難擴(kuò)增出達(dá)到600恥的片段[20]；本文參照文獻(xiàn)的糞便0嫩提取方法并改進(jìn)，從糞便中擴(kuò)增到696如的線粒體基因片段，不僅證實(shí)該方法的優(yōu)越性和簡(jiǎn)便性，在分子糞便學(xué)領(lǐng)域也是一個(gè)極大突破。作者贊同通過陰性對(duì)照和重復(fù)實(shí)驗(yàn)可以從糞便0嫩中獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。
[0007]不可否認(rèn)，糞便取樣中的重復(fù)實(shí)驗(yàn)較血液需要更多的人力、物力和財(cái)力。不過，對(duì)于瀕危物種甚至推測(cè)已經(jīng)滅絕的物種，糞便取樣是唯一的研宄手段。即使在個(gè)體數(shù)量較多的物種，采集血樣也只能限于少數(shù)個(gè)體，依靠血樣難以開展大范圍的群體遺傳分析；同時(shí)采血不可避免地會(huì)對(duì)個(gè)體和群體造成或多或少的負(fù)面影響。因此，糞便作為非損傷性取樣方法中最簡(jiǎn)單易行、信息量最豐富的方法無可厚非地成為最具潛力的實(shí)驗(yàn)材料。迄今為止，已經(jīng)在野生沸沸07110061)1131118〉、棕熊⑶11(301010、北美叢林狼狀7叩8 )、印地安象(￡1601&8 1118X1111118歐洲野牛(818011北極熊(1118118 胍1~11: 1111)、黑猩猩(？5111 ￠￡11118118 )、野生儒艮如叫]!)、大熊貓(八 1111^01)0(13 1116131101611(?)、小熊貓血丨陰仙)、亞洲黑熊(361611211^1:08訪11361:2111118 )等物種中展開了廣泛的分子糞便學(xué)研宄。雖然遭遇一些困難，但這些研宄成果呈現(xiàn)出令人信服的證據(jù)，使我們相信糞便在將來的某一天可以取代血液或組織樣品成為動(dòng)物分子遺傳研宄中的基本方法，它將為我們進(jìn)行分子進(jìn)化和分子生態(tài)研宄提供一個(gè)嶄新窗口。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，從而提供一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組0嫩的方法。
[0009]一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組0泌\的方法，包括以下步驟:
步驟一:^2.5 8 一 201:凍存黔金絲猴糞便于滅菌燒杯中，加30011?溶解，攪拌充分后靜置2 111111 ；
步驟二:取上清液 1 III[于 1.5 1111170111，離心 5
111111 ；步驟三:取上清液于另一2^611(101^管，4。0，1 500 ^/舊!!離心5 111111，獲得腸壁脫落細(xì)胞；
步驟四:加入-20。〇預(yù)冷的丙酮0.5 111[，洗沉淀，4。〇，1 500 ^/舊!!，離心5 111111，傾去丙酮，重復(fù)洗3次，晾干；
步驟五:加入600叱呢和40叱的濃度為50呢/111[溶菌酶置于371:條件下保溫30111111 ；400 , 1 500 17111111，離心 5 111111，棄上清液；
步驟六:于沉淀中加入500叱裂解液和12.5叱的濃度為20溫浴3卜以上；加1.25虬的濃度為10呢/此^86放置于371:條件下保溫30 111111 ；所述裂解液由 200 11111101/1 ^01,100 11111101/1 11-18-1101 (^8.0),50 11111101/1 201 八和重量體積比為2.0%十二烷基硫酸鈉303及體積比為1.0% 11-1^011 乂-100配制而成；步驟七:將管于94。0沸水浴中放置10111111 ；
步驟八:1330
111111 以上；
步驟九:4。0，13 200 170111，離心15 111111，用0.5 111[預(yù)冷70%乙醇洗滌沉淀兩次，4，13 200 1/111111，離心 5 111111，傾去上清；
步驟十:待沉淀干燥后加入50虬12溶解0嫩，-20X:保存；
所述邛由 10 11111101/11 11111101/1 201八，邱8.0 配制而成。
[0010]采用上述技術(shù)方案的有益效果是:①結(jié)果穩(wěn)定可靠，所提取基因組0嫩為23?左右，純度高；②操作簡(jiǎn)便，941:加熱10111111后一次離心去除變性蛋白質(zhì)，較傳統(tǒng)的酚氯仿抽提去除蛋白質(zhì)操作更加簡(jiǎn)便，無需重復(fù)抽提和離心；③試劑毒性小:只需在水浴中就可完成，避免實(shí)驗(yàn)人員接觸酚和氯仿等有毒試劑(酚氯仿主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有麻醉作用，對(duì)心、肝、腎有損害，為可疑致癌物。)④成本低:無需購(gòu)買酚氯仿等試劑。

【具體實(shí)施方式】
[0011]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明:
一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組0嫩的方法，包括以下步驟:
步驟一:^2.5 8 一 201:凍存黔金絲猴糞便于滅菌燒杯中，加30011?溶解，攪拌充分后靜置2 111111 ；
步驟二:取上清液 1 III[于 1.5 1111170111，離心 5
111111 ；
步驟三:取上清液于另一2^611(101^管，4。0，1 500 ^/舊!!離心5 111111，獲得腸壁脫落細(xì)胞；
步驟四:加入-20。〇預(yù)冷的丙酮0.5 111[，洗沉淀，4。〇，1 500 ^/舊!!，離心5 111111，傾去丙酮，重復(fù)洗3次，晾干；
步驟五:加入600叱呢和40叱的濃度為50呢/111[溶菌酶置于371:條件下保溫30111111 ；400 , 1 500 17111111，離心 5 111111，棄上清液；
步驟六:于沉淀中加入500叱裂解液和12.5叱的濃度為20溫浴3卜或過夜；加1.25虬的濃度為10呢/此^86放置于371:條件下保溫30 111111 ；所述裂解液由 200 11111101/1 ^01,100 11111101/1 11-18-1101 (^8.0),2.0% 808,50 11111101/I ￡01'八、1.0% 11-1^011 父-100 配制而成；
所述303是指十二烷基硫酸鈉，2.0%指的是重量體積比，即1001111雙蒸水中稱??； 所述11-11:011父-100是液體，因此1.0%指的是體積比，即取1^1原液，定容到100^1 ； 步驟七:將管于94。0沸水浴中放置10111111 ；
步驟八:1330
111111或過夜；
步驟九:4。0，13 200 170111，離心15 111111，用0.5 111[預(yù)冷70%乙醇洗滌沉淀兩次，4，13 200 1/111111，離心 5 111111，傾去上清；
步驟十:待沉淀干燥后加入50虬12溶解0嫩，-20X:保存；
所述邛由 10 11111101/11 11111101/1 201八，邱8.0 配制而成。
[0012]所述管為離心管。
[0013]？邙擴(kuò)增
根據(jù)從:81上已發(fā)表的川金絲猴線粒體基因組全序列(序列號(hào):凡821835),采用軟件？1~6111161~5和 011職6 設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)引物，上游(起始位 14042)5,6^6 601 1^6^6 ‘-3’，下游(末位14738) 5’ -^6 166 ^66 6X6 ^6 03’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0014]擴(kuò)增在？10200型？邙儀上進(jìn)行，采用30虬反應(yīng)體系:1011-18-1101 (邱8.3),50 臟 01/1 1(01,1.5 臟 ￠)1/1 1^012,0.1 臟 01/1 伽??？，引物各 0.4 1111101/1, I'叫 0 嫩聚合酶1.5 [，模板總0嫩100叩。循環(huán)條件為:95。0預(yù)變性6 “打；94。0變性60 8、51。。退火40 8、72。0延伸80 8，36個(gè)循環(huán)；721:延伸8
[0015]電泳檢測(cè)和0嫩擴(kuò)增片段測(cè)序
糞便基因組0嫩提取物和擴(kuò)增產(chǎn)物分別在0.8%和1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。酒精沉淀回收純化？(?擴(kuò)增片段，由中科院北京遺傳與發(fā)育研宄所完成測(cè)序。
【權(quán)利要求】
1.一種糞便取樣提取黔金絲猴基因組DNA的方法，其特征在于:它包括以下步驟:步驟一:取2.5 g 一 20°C凍存黔金絲猴糞便于滅菌燒杯中，加30mlTE溶解，攪拌充分后靜置2 min ； 步驟二:取上清液I mL于1.5 mL Eppendorf管中，做10管，4°C，500 r/min，離心5min ； 步驟三:取上清液于另一 Eppendorf管，4°C，I 500 r/min離心5 min，獲得腸壁脫落細(xì)胞； 步驟四:加入_20°C預(yù)冷的丙酮0.5 mL，洗沉淀，4°C，1 500 r/min，離心5 min，傾去丙酮，重復(fù)洗3次，晾干； 步驟五:加入600 μ? TE和40 μ?的濃度為50 mg/mL溶菌酶置于37°C條件下保溫30min -A°C, I 500 r/min，離心 5 min，棄上清液； 步驟六:于沉淀中加入500 PL裂解液和12.5 μ?的濃度為20 mg/mL蛋白酶K置于55°C溫浴3h以上；加1.25 μ?的濃度為10 mg/mL RNAse放置于37°C條件下保溫30 min ； 所述裂解液由 200 mmol/L NaClUOO mmol/L Tris-HCl ρΗ8.0、50 mmol/L EDTA 和重量體積比為2.0%十二烷基硫酸鈉SDS及體積比為1.0% Triton X-100配制而成； 步驟七:將Eppendorf管于94°C沸水浴中放置1min ； 步驟八:13 200rpm離心5min，取上清液450ul，加入兩倍體積無水乙醇混勾置_20°C.30 min以上； 步驟九:4°C，13 200 r/min，離心15 111；[11，用0.5 mL預(yù)冷70%乙醇洗滌沉淀兩次，4°C，.13 200 r/min，離心5 min，傾去上清; 步驟十:待沉淀干燥后加入50 μ? TE溶解DNA，_20°C保存； 所述 TE 由 10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA，ρΗ8.0 配制而成。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104480104SQ201410816416
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】張志敏, 肖代敏, 李學(xué)英, 潘有福, 錢剛 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院