基于陸地棉轉錄組序列開發(fā)的est-ssr標記引物與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于陸地棉轉錄組序列開發(fā)的EST-SSR標記引物與應用，EST-SSR標記分別為SCRC056、SCRC371、SCRC878、SCRC1022。本發(fā)明還涉及EST-SSR標記引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用。本發(fā)明所述的基于陸地棉莖尖轉錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構建、品種純度和真實性鑒定、分子標記輔助育種等研究領域。
【專利說明】基于陸地棉轉錄組序列開發(fā)的EST-SSR標記引物與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基于陸地棉轉錄組序列開發(fā)的EST-SSR標記引物與應用，特別涉及基于陸地棉Coker312莖尖轉錄組序列開發(fā)的EST-SSR引物及其應用，屬于分子標記【技術領域】。
【背景技術】
[0002]棉花是重要的經(jīng)濟作物之一，也是最重要的紡織纖維作物。其栽培種有4個，包括2個二倍體棉種，即草棉(Gossypium.herbaceum)和亞洲棉(G.arboreum)以及2個四倍體棉種，即陸地棉(G.hirsutum)和海島棉(G.barbadense)。由于陸地棉的產(chǎn)量高，適應性的特點，使之成為栽培種中的重要品種。但目前育成的陸地棉品種多樣性水平降低，遺傳基礎狹窄，導致在生產(chǎn)上難以區(qū)分和識別，從而制約著產(chǎn)量和品質(zhì)的進一步提高。
[0003]隨著基因組學的發(fā)展，分子標記成為改善這一問題的首選方法。簡單重復序列(SSR)是一種高度多態(tài)和共顯性標記，因而被廣泛用于分子標記遺傳分析。隨著高通量測序技術的發(fā)展，許多物種中已開發(fā)出大量的轉錄組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在新標記的開發(fā)和應用過程中具有重要意義。蘿卜(Raphanus sativus L.),辣椒(Capsicum annuum L.),芝麻(Sesamum indicum L.)等作物中轉錄組數(shù)據(jù)的挖掘，為其識別和開發(fā)新的EST-SSR標記提供可靠性。目前利用轉錄組序列開發(fā)新的分子標記在棉花中已有應用，來德勇等利用陸地棉花發(fā)育相關的轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘了 670個新的EST-SSR標記；陳浩東等從達爾文氏棉轉錄組序列中開發(fā)了 780對EST-SSR引物，并詳細分析了 EST-SSR位點的特征，引物的多態(tài)性及可轉移性；呂遠大等基于海島棉纖維發(fā)育EST序列開發(fā)出380對SSR引物Jena等在草棉轉錄組99780個Unigene中，查找出12471個SSR位點，分布于8900條EST中。
[0004]目前，棉花中開發(fā)的EST-SSR主要與纖維發(fā)育基因相關，與棉花早期形態(tài)建成相關的基因SSR標記開發(fā)尚未見報道。莖端組織與植物葉原基、芽原基的發(fā)生以及植物頂端生長優(yōu)勢密切相關，開發(fā)與此相關的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR標記的數(shù)量，又能深入探究EST-SSR標記基因的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于陸地棉轉錄組序列開發(fā)的EST-SSR標記引物與應用。基于陸地棉莖尖轉錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構建、品種純度和真實性鑒定、分子標記輔助育種等研究領域。
[0006]本發(fā)明的技術方案如下:
[0007]一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC056的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2。
[0008]上述EST-SSR標記SCRC056的引物在遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC056定位于chr.16 (D7)上20.4cM處，位于chr.16 (D7)上15.4cM的標記BNL2734與chr.16 (D7)上24.4cM的標記CGR6280之間，與標記BNL2734相距5cM,與標記CGR6280 相距 4cM。
[0009]一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC371的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
[0010]上述EST-SSR標記SCRC371的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標記SHIN1403與chr.18(D13)上78.4cM的標記CGR5021之間，與標記SHIN1403相距10.5cM0
[0011]一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC878的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6。
[0012]上述EST-SSR標記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端，與位于chr.2 (A2)上35.5cM的標記HAU880距離最近，相距7.0cM0
[0013]一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC1022的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8。
[0014]上述EST-SSR標記SCRC1022的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC1022定位于chr.23 (D9)上19.5cM處，位于chr.23 (D9)上16.6cM的標記CGR5392與chr.23 (D9)上24.4cM的標記HAU2017之間，與標記CGR5392相距2.9cM,與標記HAU2017相距4.9cM。
[0015]上述的EST-SSR標記的引物進行棉花遺傳多樣性分析的方法，步驟如下:
[0016](I) DNA 提取
[0017]利用改良的CTAB法提取待測樣品總DNA
[0018](2)引物擴增及電泳檢測
[0019]以步驟(1)提取的待測樣品為模板，利用上述引物進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。
[0020]PCR 體系(IOyL)包括 1.0μ LlOXTaq Buffer(含 Mg2+)，0.2μ L dNTP，
0.1 μ L(2.5U) Taq酶，上下游引物各0.6 μ L，2.0 μ L(20~50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至10 μ Lo
[0021]PCR程序為:94°C預變性 3min ；94°C 45s，(Tm) V 45s, 72°C 45s,共 32 個循環(huán)；72°C延伸7min ;25°C保存。
[0022]PCR產(chǎn)物加入2.0μ L溴酚藍后點樣，采用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳在Electrophoresis Power Supply_EPS301 (Made in Sweden)核酸電泳系統(tǒng)中進行。取
1.2 μ L樣品，以 Takara20bp DNA Ladder Marker 為 DNA分子量標準,300W恒功率電泳40min,銀染顯色。
[0023](3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用兩種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的方法:①記錄多態(tài)性位點。根據(jù)DNA分子量標準和引物擴增結果統(tǒng)計數(shù)據(jù)。同一等位點出現(xiàn)清晰條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“O” ；②差異性條帶記錄。以引物在親本中擴增出的條帶為標準，親本I的帶型記錄為“1”，親本2的帶型記錄為“2”，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為“3”，以此類推。
[0024]所述遺傳多樣性分析為:采用上述(3)中①方法統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，利用PopGene32計算引物的多態(tài)性信息含量(PIC)。
[0025]所述高密度遺傳圖譜的構建是采用上述步驟⑶中②記錄的數(shù)據(jù)采用Jion-Map4.0軟件構建分子遺傳連鎖圖譜(L0D值=6.5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用MapChart2.2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。
[0026]有益效果
[0027]本發(fā)明所述的EST-SSR弓丨物均來自陸地棉莖尖轉錄組序列，與以往的陸地棉纖維相關的轉錄組中開發(fā)出的SSR引物存在功能差別，所述的引物在陸地棉莖尖轉錄組中分布均勻、多態(tài)性豐富、擴增穩(wěn)定、擴增條帶易于鑒定，并且成功連鎖到高密度遺傳圖譜上，豐富了陸地棉基于轉錄組發(fā)掘SSR引物的數(shù)量，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構建、品種純度和真實性鑒定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為SSR Locator軟件搜索結果示意圖；
[0029]圖2為引物SCRC056在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結果圖；
[0030]圖中:M、Marker (20bp DNA Ladder TAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ_5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號,7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞I號；
[0031]圖3為引物SCRC371 在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結果圖；
[0032]圖中:M、Marker (20bp DNA Ladder TAKARA)，1、Tm_l，2、Coker312，3、AcalasJ_5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號,7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫尼，
11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞I號；
[0033]圖4為引物SCRC878在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結果圖；
[0034]圖中:M、Marker (20bp DNA Ladder TAKARA)，1、Tm_l，2、Coker312，3、AcalasJ_5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號,7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫尼，
11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞I號；
[0035]圖5為引物SCRC1022在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結果圖；
[0036]圖中:M、Marker (20bp DNA Ladder TAKARA)，1、Tm_l，2、Coker312，3、AcalasJ_5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號,7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫尼，
11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞I號；
[0037]圖6為5對引物在重組自交系親本中擴增后的電泳結果圖；
[0038]圖中:M、Marker (20bp DNA Ladder TAKARA)，5 對引物:SCRC056( I )、SCRC371( II )、SCRC584 (III)、SCRC878 (IV )、SCR1022C( V ) ;1、親本 I，2、親本 2 ；
[0039]圖7為4對引物在遺傳圖譜上的定位示意圖。
【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0041]實施例
[0042]陸地棉Coker312轉錄組EST-SSR在棉屬種間及種內(nèi)多態(tài)性分析中的應用[0043]1.棉花基因組DNA的提取
[0044](I)材料
[0045]從棉花種質(zhì)材料中選取5個棉種共13份材料(見表1)，用于新開發(fā)引物的評價，包括擴增效果和多態(tài)性分析。
[0046]表1本發(fā)明中用于引物多態(tài)性分析的材料信息
[0047]
【權利要求】
1.一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC056的引物，其特征在于，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
2.權利要求1所述的EST-SSR標記SCRC056的引物在遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC056定位于chr.16 (D7)上20.4cM處，位于chr.16 (D7)上15.4cM 的標記 BNL2734 與 chr.16 (D7)上 24.4cM 的標記 CGR6280 之間，與標記 BNL2734 相距5cM，與標記CGR6280相距4cM。
3.一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC371的引物，其特征在于，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。
4.權利要求3所述的EST-SSR標記SCRC371的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標記SHIN1403與chr.18 (Dl3)上78.4cM的標記CGR5021之間，與標記SHIN1403 相距 10.5cM。
5.一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC878的引物，其特征在于，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6。
6.權利要求5所述的EST-SSR標記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端，與位于chr.2 (A2)上35.5cM的標記HAU880距離最近，相距7.0cM0
7.一種陸地棉Coker312的EST-SSR標記SCRC1022的引物，其特征在于，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8。
8.權利要求7所述的EST-SSR標記SCRC1022的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構建方面的應用，標記SCRC1022定位于chr.23 (D9)上19.5cM處，位于chr.23 (D9)上 16.6cM 的標記 CGR5392 與 chr.23 (D9)上 24.4cM 的標記 HAU2017 之間，與標記 CGR5392 相距 2.9cM,與標記 HAU2017 相距 4.9cM。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017896SQ201410284580
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權日:2014年6月23日
【發(fā)明者】張軍, 高陽, 王芙蓉, 劉國棟, 張傳云, 張景霞, 周娟 申請人:山東棉花研究中心