南美白對蝦LvDJ-1蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了南美白對蝦LvDJ-1蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明首次獲得了南美白對蝦的LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，或者是SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的由SEQ?ID?NO:2衍生的蛋白質(zhì)。經(jīng)實驗證明，南美白對蝦LvDJ-1蛋白可以提高南美白對蝦抗應激能力，可以應用于制備與水產(chǎn)動物相關的免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用潛力。
【專利說明】南美白對蝦LvDJ-1蛋白及其編碼基因與應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及南美白對蝦LvDJ-1蛋白以及編碼該蛋白的基因，包含該基因的載體以及該蛋白的應用。

【背景技術】
[0002]1997年Nagakubo等運用酵母雙雜交技術篩選出與c_myc相互作用的一種新的蛋白，第一次發(fā)現(xiàn)DJ-1,是帕金森病(Parkinson s disease, PD)較常見的致病基因，以不對稱的二聚體形式參與細胞的多種生命活動，如神經(jīng)損傷、腫瘤發(fā)生、轉錄調(diào)控、分子伴侶、免疫、以及抗氧化等。DJ-1蛋白的單體是由11個折疊和8個螺旋組成。其中β3和β4折疊形成I個β發(fā)夾結構參與了 DJ-1蛋白的二聚化。DJ-1參與各項生命活動的具體機制尚不清楚，通過鎘應激、亞硝酸鹽應激，溶藻弧菌應激已經(jīng)干擾LvDJ-1的南美白對蝦，初步驗證其與抗鎘離子、抗亞硝酸鹽、抗溶藻弧菌有密切的相關性。
[0003]南美白對蟲下(.Litopenaeus vannamei ),又名凡納濱對蟲下，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱{Crustacea)、十足目 iVecapoda、、游泳亞目 iNatantia)、對奸科iPenaeidae')、對資穆iiPenaeus')、Lito-penaeus亞屬，是廣溫廣鹽性熱帶奸類。南美白對蟲下是當今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一。南美白對蝦原產(chǎn)于南美洲太平洋沿岸海域。南美白對蝦具有生長速度快、適應能力強、產(chǎn)量高等優(yōu)點，已成為我國最主要的養(yǎng)殖品種之一。但是，由于面對著目前的急劇的氣候變化災害和嚴重污染的水質(zhì)問題，從而導致了其致病率和死亡率居高不下，對南美白對蝦的人工養(yǎng)殖造成嚴重的經(jīng)濟打擊，也是一個難以解決的問題。如何增強南美白對蝦的抗逆能力，提高養(yǎng)殖存活率，是目前亟待解決的難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有問題，本發(fā)明的目的在于提供一種南美白對蝦LvDJ-1蛋白、該蛋白的編碼基因、以及該蛋白的應用。
[0005]本發(fā)明所采取的技術方案是:
南美白對蝦LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
[0006]編碼上述南美白對蝦LvDJ-1蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]一種克隆載體，其含有南美白對蝦LvDJ-1蛋白基因。
[0008]一種表達載體，其含有南美白對蝦LvDJ-1蛋白基因。
[0009]生產(chǎn)南美白對蝦LvDJ-1蛋白的方法，包括將含有南美白對蝦LvDJ-1蛋白基因的表達載體導入宿主細胞中，表達得到南美白對蝦LvDJ-1蛋白。
[0010]所述宿主細胞為畢赤酵母。
[0011]南美白對蝦LvDJ-1蛋白在制備水產(chǎn)動物免疫增強劑中的應用。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:(1)本發(fā)明首次獲得了南美白對蝦的LvDJ-1蛋白基因序列，可以應用于制備重組蛋白、免疫制劑和飼料添加劑，為南美白對蝦的生理免疫研究提供了新的實踐基礎；
(2)本發(fā)明所提供的南美白對蝦LvDJ-1重組蛋白，經(jīng)實驗證明可以提高南美白對蝦抗應激能力，可以應用于制備與蝦類相關的免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用潛力；
(3)將南美白對蝦LvDJ-1核苷酸序列在巴斯德畢赤酵母重組菌株中表達，可以應用于產(chǎn)業(yè)化生存，降低了成本的投入，具有較高的經(jīng)濟價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是南美白對蝦LvDJ-1基因ORF的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；
圖2是南美白對蝦LvDJ-1基因ORF連接酶切接頭iEcoR1、Kpn I )的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；
圖 3 是克隆載體 pMD18-T-LvDJ-l 雙酶切 iEcoRI ,Kpn I );
圖4是表達載體pPICZaA雙酶切(McoR1、Kpn I )的電泳鑒定圖；
圖5是pPICZaA表達載體和所構建的pPICZaA-LvDJ-1表達載體單酶切iBstX I )的電泳鑒定圖；
圖6是重組菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33表達產(chǎn)物LvDJ-1重組蛋白的SDS-Page電泳分析圖；
圖7是重組菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33表達產(chǎn)物LvDJ-1重組蛋白的western blot鑒定圖；
圖8是pPICZaA-LvDJ-Ι畢赤酵母表達載體構建示意圖；
圖9是南美白對蝦LvDJ-1蛋白的氨基酸序列和人LvDJ-1蛋白的氨基酸序列對比圖； 圖10是南美白對蝦LvDJ-1蛋白抗原表位預測分析結果；
圖11是重組菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33高密度發(fā)酵產(chǎn)物LvDJ-1重組蛋白的SDS-Page電泳分析圖；
圖12是在鎘應激中的，A，B, C三組蝦血細胞數(shù)目隨應激時間的變化情況；
圖13是在鎘應激中A、B、C三組蝦血細胞凋亡情況隨應激時間的變化情況。

【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0015]以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]一、獲得南美白對蝦LvDJ-1基因的ORF
依據(jù)http://www.ncb1.nlm.nih.gov/ cDNA文庫中的EST拼接,得到包括ORF在內(nèi)的LvDJ-1 序列。第一條引物為 LvDJ-lSl，【5’- TACACAGGCCTTCTCTCTCCCAAC](SEQ ID N0.3),第二條引物為 LvDJ-lAl，【5’- GTTGTTCCTATGGTCACCTTCATT】(SEQ ID N0.4)，以 M-MLVreverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的南美白對蟲下肝臟cDNA為模板，經(jīng)過touchdown PCR技術，獲得PCR擴增產(chǎn)物，對其進行測序并比對，確定為LvDJ-1基因，其長度為564 bp (如SEQ ID N0.1所示)，并推測出其氨基酸序列(如SEQID N0.2所示)。PCR反應條件為:94°C預變性4分鐘；(1)94°C變性30s，退火72°C 30s，共5個循環(huán)；(2)94°C變性30s，退火68°C 30s，延伸72°C，共5個循環(huán)；(3)94°C變性30s，退火55°C 30s，延伸72°C，共30個循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1，其中:M為DS2000 Marker ;1為PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送去華大基因公司測序，測序結果和比對結果一致。
[0017]二、生物信息學方法分析南美白對蝦LvDJ-1蛋白序列
使用clustal-X和GeneDoc兩個序列分析軟件，將南美白對蝦LvDJ-1基因的氨基酸序列和人DJ-1基因的氨基酸序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)南美白對蝦LvDJ-1蛋白序列和人類DJ-1蛋白序列有較高的同源性(圖9),并通過http://tools.1mmuneepitope.0rg/tools/bcell/iedb_input分析南美白對蟲下LvDJ-1蛋白的抗原表位(圖10)。
[0018]三、南美白對蝦LvDJ-1基因序列的合成
根據(jù)分析好的南美白對蝦LvDJ-1基因的cDNA序列，設計合成上下游兩端的引物。上游引物是LVDJ-1SP，在該片段第一位堿基起前加入的限制酶切位點以及其保護堿基【5’- GCGAATTCATGTC TCCCAAGAAAGCTCTCGTTCTC] (SEQ ID N0.5);下游引物是 LVDJ-1AP1M，在該片段后插入式? /的限制酶切位點以及該酶切位點的保護堿基、6Xhis標簽、終止密碼子【5’- GCGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGGAGCAGCATGGCCTTGGCAACAGCAGC] (SEQ IDN0.6 )。以反轉錄得到的南美白對蝦肝臟cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增南美白對蝦的LvDJ-1基因，PCR反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán):94°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸30分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖2，其中，M:DS 2000 marker ；1:PCR擴增產(chǎn)物。從圖2可見PCR擴增后獲得一段約600bp的序列。
[0019]四、含南美白對蝦LvDJ-1序列的克隆載體pMD18-T_LvDJ-l的構建
將上述所獲得的基因片段分離純化，然后與PMD18-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系41:連接過夜(1011)，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌0!15 0，經(jīng)41^+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆；通過質(zhì)粒小提試劑盒(Omega，USA)提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切驗證以及測序驗證，證明南美白對蝦LvDJ-1序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-LvDJ-l，克隆載體轉化大腸桿菌DH5a所得到的重組菌株命名為pMD18-T-LvDJ-1-DH5a。使用及^7?J、Kpn I對克隆載體pMD18-T-LvDJ-l進行雙酶切，酶切圖譜圖3所示:M為DS 5000 Marker ；1:為pMD18-T-LvDJ-l 的、Κρη / 雙酶切產(chǎn)物。酶切圖譜圖 4 所示，M:DS 5000 Marker ；1:完整pPICZaA ;2:pPICZaA表達載體的、Kpn /雙酶切產(chǎn)物。
[0020]五、含南美白對蝦LvDJ-1序列的表達載體pPICZaA- LvDJ-1的構建
克隆載體PMD18-T-UDJ-1經(jīng)小提質(zhì)粒試劑盒(Omega，USA)抽提后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpn I進行雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物用E.Z.N.A.? Gel Extract1n Kit回收，分離純化約600bp的南美白對蝦LvDJ-1序列。
[0021]載體質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)限制性內(nèi)切酶及和治w I雙酶切后分離純化3.6kb的大片段，與約600bp的南美白對蝦LvDJ-1的基因片段以1:3比例混合，用T4連接酶于16°C過夜連接(約15h)。然后，用CaClji將質(zhì)粒轉入大腸桿菌DH5a中，于低鹽LB平板篩選出具Zeocin抗性的轉化子。以標準方法提取質(zhì)粒，篩選大小約4.0 kb的重組質(zhì)粒，經(jīng)送往Invitrogen公司測序，對測序結果進行比對，為南美白對蝦LvDJ-1的基因序列，并正確插入到畢赤酵母表達載體pPICZaA中，重組質(zhì)粒命名為PICZaA-LvDJ-1。質(zhì)粒構建流程見圖7。使用及、Kpn /對表達載體pPICZaA-LvDJ-Ι進行雙酶切，酶切分析圖見圖5，其中M:DS5000 Marker ；1:pPICZaA載體；2:pPICZaA載體的I酶切產(chǎn)物；3:表達載體pP I CZaA-LvDJ-1 ；4:pPICZaA-LvDJ-l 表達載體的 / 酶切產(chǎn)物。
[0022]六、能高效表達南美白對蝦LvDJ-1蛋白的畢赤酵母重組菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33構建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect? Pichia Express1n Kit 說明書制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒pP I CZaA-LvDJ-1用BstX I線形化后凝膠回收，用電擊法將重組質(zhì)粒pP I CZaA-LvDJ-1轉化到畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞中，在含有Zeocin 500 μ g/ml的YPDS平板上28°C進行培養(yǎng)。約3d后長出單克隆菌株。挑取單克隆經(jīng)誘導培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達南美白對蝦LvDJ-1重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- LvDJ-1 -X-33。
[0023]七、利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA- LvDJ-1 _X_33生產(chǎn)重組南美白對蝦LvDJ-1蛋白
分別挑取各單克隆工程菌，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，離心換等體積培養(yǎng)基BMMY，稀釋0D600至1.0，每隔24h向培養(yǎng)基中補加0.5%甲醇，培養(yǎng)約96h后，5000rpm離心2min,4°C收集上清。取約Iml上清,用DOC-TCA-丙酮沉淀法對蛋白進行濃縮后，加入5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理后電泳。陰性對照為空載質(zhì)粒PPICZaA轉化X-33后長出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結果見圖6，其中:M:蛋白分子量標準；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產(chǎn)物；1、2:重組菌株pPICZaA- LvDJ-1-X-33表達產(chǎn)物。NC作為陰性對照，位于15Kd和25Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶,而陰性對照不出現(xiàn)此蛋白帶。
[0024]八、南美白對蝦LvDJ-1蛋白抗原活性鑒定實驗
采用蛋白印跡方法(western blot)對重組南美白對蟲下LvDJ-1蛋白進行免疫鑒定。其中，一抗采用鼠源his單克隆抗體(Novagen), 二抗采用馬抗小鼠IgG-AP (鼎國生物公司)。結果如圖7所示。其中，M:蛋白分子量標準；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產(chǎn)物Westernblot鑒定圖譜；1、2:重組菌株pPICZaA- LvDJ-1-X-33表達產(chǎn)物Western blot鑒定圖譜。NC作為陰性對照，說明鼠源his單克隆抗體能夠識別帶有6Xhis標簽的重組南美白對蝦LvDJ-1蛋白，證明得到的蛋白為南美白對蝦LvDJ-1蛋白。
[0025]九、畢赤酵母工程菌pPICZaA- LvDJ-1 _X_33的高密度發(fā)酵
發(fā)酵過程參照 Invitrogen 公司的Pichia Fermentat1n Process Guidelines,具體步驟如下:
1.分別在 YPDS (Zeocin+)提取單克隆菌株，pPICZ a A-LvDJ-1-X-33 和 pPICZ α Α-Χ-33，其中pPICZ α Α-Χ-33菌株作為空載對照。加入200ml MGY液體培養(yǎng)基到IL的錐形瓶中，30°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)至 0D600=2-6 (約 16_24h)。
[0026]2.組裝好發(fā)酵罐，加入3L含有4%甘油的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(配方見PichiaFermentat1n Process Guidelines),然后121°C,滅菌15min,待冷卻后，用流加瓶加入氨水，調(diào)pH到5。
[0027]3.在火焰圈保護下，將步驟1.1中搖好的菌種接種于發(fā)酵罐中。調(diào)節(jié)通氣量，灌壓，轉速來維持溶氧，使其高于20%。設定發(fā)酵溫度為28°C，自動流加氨水控制pH 5±0.05。
[0028]4.當發(fā)酵罐中的甘油耗盡后(約接種后20個小時)，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方見 Pichia Fermentat1n Process Guideline),設置流加速度為 54.45ml/h,直到細胞濕重為200 g/liter結束(流加大約4個小時)。
[0029]5.甘油消耗盡后，開始添加每升含12ml PTMl的甲醇，設定流加速度為10.8 ml/h，兩個小時，設定流加速度為21.9 ml/h;兩個小時后，設定流加速度為32.7 ml/h，保持這個速度直到發(fā)酵結束。這個階段需要60個小時，總共添加約1.2L的甲醇。此時的細胞濕重約為 290 g/liter ο
[0030]6.分別取 pPICZ a A-LvDJ-1-X-33 與 pPICZ α Α-Χ-33 發(fā)酵的菌液各 Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5Χ電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，pPICZ α Α-Χ-33發(fā)酵的菌液做為陰性對照組，結果見圖11。其中，M:蛋白分子量標準；NC:空載菌株pPICZ α Α_Χ_33表達產(chǎn)物；1:重組菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33表達產(chǎn)物。顯示pPICZaA- LvDJ-1 -X-33在15Kd和25Kd之間出現(xiàn)一條蛋白條帶，而陰性對照不出現(xiàn)此帶。結果說明，pPICZaA- rLvDJ-1 _X_33菌種發(fā)酵產(chǎn)生了高濃度的重組蛋白。
[0031]7.把發(fā)酵液用噴霧干燥器處理，得到粉末，pPICZaA-LvDJ-1 _X_33菌種的發(fā)酵液粉末做為飼料添加劑，pPICZ α Α-Χ-33菌種的發(fā)酵液粉末做為對照，用于飼養(yǎng)實驗。
[0032]十、動物實驗 I實驗條件
選取同一批次、體質(zhì)健康、規(guī)格相近的南美白對奸放養(yǎng)在養(yǎng)殖桶中。水溫25~30°C,水體鹽度28~32%。，pH 值8.1~8.3，溶解氧值大于5.0 mg/L,并且水體持續(xù)循環(huán)。
[0033]2飼料配置
飼料共分為3種，A為商品料，B為商品料十lwt% pPICZ α Α_Χ_33菌種的發(fā)酵液粉末，C為商品料+ lwt%pPICZaA- LvDJ-1-X-33菌種的發(fā)酵液粉末。(分別將各組粉料攪拌均勻，每天投喂前準確稱量，用水稀釋后制備成濕顆粒飼料投喂)。
[0034]3實驗蝦飼養(yǎng)
本試驗設3個實驗組，每組30條蝦。分別投喂A、B、C組飼料。試驗蝦平均體重
0.20±0.03g，長度為3±0.6cm。養(yǎng)殖水不斷充氣，水溫29土 2°C，水體pH值8.1~8.3，水體鹽度28~32%。。上午和下午按照蝦體重的5%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及時清理殘餌，觀察記錄，飼養(yǎng)時間7周。實驗前禁食一天。
[0035]4.應激實驗 4.1實驗計劃
取用飼喂的南美白對蝦做氯化鎘應激實驗，應激濃度為4.25 μ mol-L^10實驗準備1.0mX0.5 mX 0.5 m的儲物箱3個，在每個儲物箱先裝滿40L的海水，，然后每個儲物箱分別放A，B，C三組各30條蝦，應激24小時，分別在O小時、6小時、12小時、24小時取樣，每組取6尾。
[0036]4.2血細胞計數(shù)以及滲透壓的測定
用I ml 一次性無菌注射器預先吸0.2ml抗凝劑，再扎入腹血竇抽約0.2ml血，取完血后，將血液注入1.5ml EP管中，4°C下靜置，取血清。血細胞計數(shù)板的計數(shù)血細胞方法按照WHO手冊進行計數(shù)，分別計數(shù)血細胞3次，取3次結果的平均值為計數(shù)結果。
[0037]4.2.1血細胞計數(shù)的測定原理
細胞的計數(shù)一般使用血球計數(shù)板。每塊計數(shù)板由H形凹槽分為2個同樣的計數(shù)池，計數(shù)池高0.1mm0計數(shù)池分為9個大方格,每個大格面積為1.0mm.容積為0.1mm3C μ I),其中，中央大方格分成25個中方格，位于正中及四角5個中方格是紅細胞計數(shù)區(qū)域。四角的4個大方格是白細胞計數(shù)區(qū)域。在計數(shù)血細胞時，要計算位于中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目，再根據(jù)公式細胞數(shù)/ml=五個中方格內(nèi)的細胞個數(shù)/5 X 25 X 10000X稀釋倍數(shù)。
[0038]4.2.2血細胞計數(shù)的測定方法
視待測血細胞的濃度，加抗凝劑適當稀釋(一般稀釋2倍)，然后取潔凈的血球計數(shù)板一塊，并在計數(shù)區(qū)內(nèi)蓋上一塊蓋玻片。將血細胞輕輕吹打混勻，用移液槍吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生。靜置片刻后，把血球計數(shù)板放在顯微鏡的載物臺上然后觀察并計數(shù)中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目。在計數(shù)時，要遵循原則:數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈。每個血樣分別計數(shù)血細胞3次，取3次結果的平均值為計數(shù)結果。
[0039]結果顯示:應激過程中，在鎘應激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的蝦血細胞數(shù)目并沒有明顯差異。應激6小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞數(shù)目高于A、B組，并且差異顯著。應激12小時后，A，B, C三組的血細胞數(shù)目明顯下降，但是C組的血細胞數(shù)目下降較A、B組少，數(shù)目明顯高于A、B組。應激24小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目略有上升，C組的血細胞數(shù)目略高于A，B組，沒有明顯差異(見圖12)。
[0040]4.3細胞凋亡測定
4.3.1血細胞凋亡的測定原理
細胞凋亡是細胞程序性死亡，當細胞發(fā)生凋亡時候，細胞膜的通透性增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。血淋巴細胞凋亡的測定原理:在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由膜脂內(nèi)側翻向外側。Annexin V是一種依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。用標記了FITC的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine 1dide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠細胞膜與細胞核結合呈現(xiàn)紅色。將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。在雙參數(shù)流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FIT C — / PI—)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FIT C + / PI + );而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC + / PI —)。
[0041]4.3.2血淋巴細胞凋亡的測定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,購自聯(lián)科生物。具體步驟:
收集血細胞，用MAS抗凝劑進行稀釋，調(diào)整血細胞濃度大約為1-5X106 cells/ml，取200 μ I稀釋的血細胞，在細胞懸浮液中加入5 μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI后輕輕混勻，在黑暗環(huán)境下靜置5分鐘，然后使用200目的篩網(wǎng)過濾將細胞懸液轉移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測。
[0042]結果表明:A，B, C三組蝦受到鎘應激后，應激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的蝦血細胞的細胞凋亡數(shù)目并沒有明顯差異。隨著應激時間的延長，血細胞的細胞凋亡數(shù)目不斷增加，A、B組血細胞的細胞凋亡數(shù)目增加比C組多，在12小時達到最大值，并且A、B組的細胞凋亡數(shù)目明顯高于C組。應激24小時后，A、B、C三組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目明顯少于A、B組(見圖13)。
[0043]以上實驗表明:實驗組C組，食用了含有重組蛋白LvDJ-1的飼料后，在鎘應激過程中，其抗應激能力明顯優(yōu)于對照組A、B。由此可見，重組蛋白LvDJ-1能夠提高蝦類尤其是南美白對蝦的免疫力，可用于制備水產(chǎn)動物免疫制劑或飼料添加劑。
[0044]以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。
【權利要求】
1.南美白對蝦LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示，或者是SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.一種克隆載體，含有權利要求2或3所述的基因。
5.—種表達載體,含有權利要求2或3所述的基因。
6.生產(chǎn)南美白對蝦LvDJ-1蛋白的方法，包括將權利要求5所述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到南美白對蝦LvDJ-1蛋白。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母。
8.權利要求1所述的蛋白在制備水產(chǎn)動物免疫增強劑中的應用。
9.一種免疫增強劑，含有權利要求1所述的蛋白。
【文檔編號】C12N15/12GK104072597SQ201410284249
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權日:2014年6月23日
【發(fā)明者】王維娜, 黃明珠, 劉媛 申請人:華南師范大學