專利名稱：中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標記四重pcr引物與識別方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學遺傳育種的分子標記輔助技術，是一種中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標記四重PCR引物及利用該引物進行家系識別的方法。
背景技術：
中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)又名東方對蝦、對蝦，是原產我國的一種優(yōu)質海水養(yǎng)殖品種。利用分子標記輔助育種是中國對蝦良種選育重要途徑之一，目前應用最為廣泛的分子標記為微衛(wèi)星。常規(guī)微衛(wèi)星檢測技術為單對引物進行單個位點的PCR擴增，其產物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，效率低，周期長。微衛(wèi)星多重PCR是基于常規(guī)PCR技術，在一個PCR反應體系中加入多對特異性的微衛(wèi)星引物，針對特定模板進行多個微衛(wèi)星目的片段的PCR技術。中國對蝦多重PCR檢測技術的特點是效率高、周期短，可以有效利用少量模板，提高微衛(wèi)星標記中國對蝦遺傳多樣性分析、個體系譜識別及遺傳連鎖圖譜構建的效率。目前國內外尚未見有中國對蝦微衛(wèi)星四重PCR技術的發(fā)明及相關報道。與本發(fā)明類似的專利申請有“中國對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術”(孔杰，高煥，授權公告號為CN100510103C)。該專利將開發(fā)的三對中國明對蝦微衛(wèi)星引物納入到一個PCR反應體系中，利用片段大小區(qū)分不同產物。其優(yōu)點在于三重PCR提高了 PCR檢測效率；缺點在于個體識別率有限，不同目的片段的PCR產物靠目測難以區(qū)分。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供中國對蝦家系識別四重微衛(wèi)星PCR引物，并利用不同中國對蝦微衛(wèi)星位點擴增片段的大小差異，優(yōu)化PCR反應條件，建立一個中國對蝦四重微衛(wèi)星PCR反應及檢測體系，為中國對蝦分子標記輔助育種提供高效、準確的微衛(wèi)星標記檢測技術。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的中國對蝦家系識別微衛(wèi)星四重PCR引物的序列如下RSllOl 正向序列為5 ‘ -CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列為5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。一種中國對蝦微衛(wèi)星標記四重PCR家系識別方法，包括以下步驟提取中國對蝦基因組DNA、加入上述中國對蝦微衛(wèi)星標記四重PCR引物建立PCR反應體系，選擇合適的 PCR反應程序進行擴增，PCR產物經常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進行區(qū)分或者進行個體間及親子之間的識別和鑒定；所述的PCR反應體系，即四對引物可在同一個PCR反應體系中同時擴增的參數(shù)，這些參數(shù)是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (內含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween 20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. OunitDNA 聚合酶，模板DNAlOOng，補充滅菌雙蒸水使PCR反應體系達到25 μ 1 ；所述的PCR反應程序為95°C預變性^iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、 52°C退火lmin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為941變性408、511退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火 lmin、72°C延伸 lmin。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果本發(fā)明將需要分別進行四次的中國對蝦微衛(wèi)星PCR擴增和檢測，整合為一次的四重PCR反應體系和一次的產物檢測，可大大提高中國對蝦微衛(wèi)星標記的檢測效率，四重PCR 技術的中國對蝦單親排除率為99. 25%，個體識別率99. 87%。由于四對微衛(wèi)星產物片段差異顯著，避免了由于不同位點產物片段大小接近時無法有效區(qū)分的弊病。利用該四重PCR 反應體系進行中國對蝦微衛(wèi)星標記檢測，可以大大節(jié)約包括PCR實驗耗材、PCR試劑、電泳檢測及時間成本等各項內容。同時避免了其它以熒光標記為基礎的多重PCR技術檢測體系成本高，對分析儀器要求嚴格的缺點。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的解釋，但實施例不對本發(fā)明作任何形式上的限制。中國對蝦微衛(wèi)星標記RSllOl引物是引用已有的參考文獻(專利名稱“中國對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術”，授權公告號為CN100510103C)。FCKR005，F(xiàn)CKR007和FCKR009 是我們利用“菌落富集-探針雜交”策略測序獲得的，對重復序列進行引物設計從而實現(xiàn)對中國對蝦特定微衛(wèi)星位點的PCR擴增。利用引物設計軟件分析排除這四對引物彼此形成引物二聚體、發(fā)莢結構的可能，對于檢測到的嚴重影響復合PCR反應進行的二聚體及發(fā)莢結構的引物進行修改，使其完全適合復合PCR反應體系。組合這四對引物于同一個PCR反應體系。調整PCR反應體系，建立這四對引物可在同一個PCR反應體系中同時擴增的參數(shù)，這些參數(shù)是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (內含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA 聚合酶，模板DNAlOOng，補充滅菌雙蒸水使PCR反應體系達到25 μ 1，模板DNA為取中國對蝦肌肉組織采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法獲得。PCR反應程序為95°C預變性％iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、52°C退火Imin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為94 V變性40s、51 °C退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火lmin、72°C 延伸lmin;循環(huán)完成后72°C延伸5min。PCR反應過程在常規(guī)PCR儀上進行。PCR產物經變性聚丙酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。四對微衛(wèi)星引物的序列如下
RSllOl正向序列為5 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列為5 ‘ 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3
反向序列為
-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 -GC ACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為技術指標RS1101，F(xiàn)CKR005，F(xiàn)CKR005, FCKR007和FCKR009位點的目的片段大小分別為330bp, 283bp, 241bp和196bp,具有的等位基因數(shù)分別為12，9，8和14個，由此組合的四重PCR技術的中國對蝦單親排除率為99. 25%,個體識別率99. 87%。應用范圍可以通過此四重PCR技術，經過常規(guī)方式PCR擴增和銀染檢測，可一次性獲得四個微衛(wèi)星位點上的中國對蝦個體的遺傳信息，通過這些不同個體間顯示的遺傳信息差異來進行個體和家系系譜識別。育種中的應用1)獲得了家系個體四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以推測缺失的父本或母本的基因型或父母本的基因型組合；幻獲得群體四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以對該群體按照家系組成進行歸類；幻獲得親本之一或父母本四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以對混養(yǎng)的后代進行遺傳分析，確定或排除后代是否為檢測親本的子代個體。
權利要求
1.中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標記四重PCR引物，其特征在于所述引物序列如下RSllOl正向序列為5 -TATTCCCACGCTCTTGTC-3‘；-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3反向序列為FCKR005 正向序列為5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
2. 一種中國對蝦微衛(wèi)星標記四重PCR家系識別方法，其特征在于包括以下步驟提取中國對蝦基因組DNA、加入權利要求1所述的引物，建立PCR反應體系，選擇合適的PCR反應程序進行擴增，PCR產物經常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進行區(qū)分或者進行個體間及親子之間的識別和鑒定； 所述的PCR反應體系，即四對引物可在同一個PCR反應體系中同時擴增的參數(shù)， 這些參數(shù)是10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，Buffer 內含 pH8. 8 濃度為 750mM Tris-HCl, 200mM (NH4) 2S04、0. 1% Tween20，另有 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP,四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA聚合酶，模板DNAlOOng,補充滅菌雙蒸水使PCR反應體系達到25 μ 1 ； 所述的PCR反應程序為95°C預變性％iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、52°C 退火lmin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為94°C變性40s、51°C退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火lmin、 72°C延伸 lmin。
全文摘要
中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標記四重PCR引物與識別方法，利用現(xiàn)有中國對蝦微衛(wèi)星標記RS1101引物和“菌落富集-探針雜交”策略測序獲得的FCKR005、FCKR007和FCKR009共四個引物，建立PCR反應體系，選擇合適的PCR反應程序進行擴增，PCR產物經常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進行區(qū)分或者進行個體間及親子之間的識別和鑒定；本發(fā)明通過一次的四重PCR反應體系和一次的產物檢測，可大大提高中國對蝦微衛(wèi)星標記的檢測效率，組合的四重PCR技術的中國對蝦單親排除率為99.25％，個體識別率99.87％；同時大大節(jié)約了實驗耗材，降低成本。
文檔編號C12Q1/68GK102399776SQ201110258128
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權日2011年9月2日
發(fā)明者李偉亞, 王偉繼, 阮曉紅 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所