本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種長非編碼RNA及其在診斷/治療T2DM中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是嚴(yán)重影響人群健康的慢性疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，不僅給個(gè)體帶來軀體和精神上的損害，還給個(gè)人、國家?guī)斫?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。胰腺復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和胰島生理功能以及臨床上高居不下的糖尿病發(fā)病率使得對胰島功能的研究尤為重要，胰島功能的維持是目前糖尿病的研究重點(diǎn)之一。

越來越多的報(bào)道顯示，lncRNA參與胰島細(xì)胞的發(fā)育、功能維持、糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。有課題組通過對人類胰島beta細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在人胰島中鑒定出1128條lncRNA，且具有組織特異性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胰島中長鏈的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空特異性，參與了胰島beta細(xì)胞的分化成熟過程，研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNA可以受到葡萄糖的調(diào)控以及在人T2DM的胰島中表達(dá)異常，HI-LNC25能調(diào)控GLIS3，GLIS3是胰島細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，含有T2DM易感位點(diǎn)，提示HI-LNC25在維持胰島功能起到重要作用。同一課題組近期發(fā)現(xiàn)lncRNAβlinc1通過調(diào)控胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子來維持胰島功能，敲除之后會(huì)引起beta細(xì)胞發(fā)育缺陷及成年小鼠糖耐量受損。另外，有全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wi de association study,GWAS)發(fā)現(xiàn)大量非編碼區(qū)域含有T2DM的易感位點(diǎn)，如lncRNA ANRIL及K CNQ1OT1含有T2DM的易感位點(diǎn)。在非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰島中發(fā)現(xiàn)了異常表達(dá)的lncRNA，過表達(dá)后引起beta細(xì)胞凋亡。GWAS分析發(fā)現(xiàn)PVT1與糖尿病腎病顯著相關(guān)，而且PVT1能增加糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)率。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，Tug1及Meg3在小鼠胰腺組織中相對高表達(dá)，在T1DM及T2DM小鼠胰島中表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子影響胰島素合成及分泌。以上結(jié)果提示lncRNA參與成年beta細(xì)胞的功能維持及糖尿病的發(fā)生發(fā)展。然而，lncRNA在be ta細(xì)胞中作用的分子機(jī)制還要進(jìn)一步探索。

鑒于lncRNAs在T2DM中的重要性，我們探究了lncRNA Lincpint，首先通過定量PCR檢測了Li ncpint在小鼠胰腺、心、肝、脾、肺、肌、腎中的表達(dá)，同時(shí)檢測在db/db小鼠胰島中的表達(dá)情況。隨后我們在體內(nèi)及體外水平用RNA干擾方式下調(diào)Lincpint的表達(dá)，并采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、RIA、ELISA等技術(shù)研究Lincpint在小鼠胰島功能中的作用，旨在初步探討L incpint對胰島beta細(xì)胞增殖、凋亡以及胰島素的合成和分泌功能的作用，研究Lincpint在T2DM小鼠beta細(xì)胞損傷中所發(fā)揮的作用，進(jìn)而豐富和完善胰島功能的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提示lncRNA可能作為診斷和治療糖尿病的新的分子靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于診斷T2DM(T2DM)發(fā)病情況或作為治療T2DM藥物靶點(diǎn)的lncRNA Lincpint，其基因位于6A3.3，總長度為1714bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO:1：

ATGATGGACA TGATATAATG AAACAACATT GTGGAGAGGA AAGCATTAGGGGAGCCCACG GCTACAAAAC AAGTGAGAAG AGGTGGGAGA AAGAGAAACT ACGCCACCTCCTCTGCAGCC GAGCGCACGC AGCAGCCTGG CGTGACAAGT GGGCGACGCC AGGGACAGAGAGTGGGGGTC CTCCGCCCGC TCCGGGGACC CTGTCGCCCA CCGTGGTGCG CTGAGCAACTTTTAGCCGGC AGCCCCGCAC CTGTCTCAGA GTCCCCATCG CTCCCCACCA ACCATCATGGGAAAATTCTA GAAGAATACG CTCTCGGAAT CTACGTGCGC ATCATTTTCC TCCTCACTCCAGAGGAAGGA ACCAGAAAAG AGAGCAAAGC GGTGTAGTGT TCAGCCTCAA GAACCCCCGTGCATCCCAGG GATGGCGCCC TCTACAGGAG GGTCCTTGCC TCACTTTCGG GAGTCTCTTAACTGCATCTC GTTGATTCCT AGCGTTAGAA GAACTGAGCT AACAGGAGTC TGCCACCTCTCTGCCTTGCTGATGCACCCA GGCAGGGCTC ACTGGTTTGC AGGAGTACAT GACCACAGATCAGAGCCATT GGCTGCACAG ATACCTGACT CTGGGCTCTC AGGAAGACTC AGGCAGAGATGGGGAGTCGG CCTGCAAGCT GGGACGCTAG AGCTCACGTG CAGTTCTCCA TTTAGCTAGGAGGTTTCCAG GGCAACCACC GAAGCAGTAA TTAAAGATGA AGAGCTAAAA GGTAAGTACTTCCAAACCTG AATCCTGAAG GAGGTGGTCC GCAGGCTGGT GTCACAGTGT GCACTCTTATTCACTTAACA ATTAGGATGT TCATGCTCTG CTTTGATTTG TATCTTTTCA CGCGCGCACGTATTCTTGTA TGTACGTACA CACCACACAC ACACACACAC ATTTTTATGC TTCCACCAGCCAGTCATGGG ACCAGGCATT GGGATACCAG GGCTTAAGGT GTCTTTCGGG TTCCTGTTTTGAACGTCCTA GCATGCATGT ATATATATAT ACATACATAC ATATATATAT ATACACATTTAAGGCATGCA AACGAGCAAC TGCAGAGGCG TCTACAGTAC TTAGCGTGTA GCAGGAACATCCAGGCTCTC CAGGCAGTTC ACGGGTGCTT ACACAGCCTG ACGAGGTGCT CGCCGTGCCGCCATCCTTTC CTTGAGCGAA CTGTACCCTG GGTTATGAAC CTTGTTTGCC TGATAGTTCAGGGCATCAGT GCAGTAACAG GGCTGATGAG AGAGAGCTCC ACCAAAGCAG CAGCGCCATTGAGAAGGTAG AAGACAGCTA TTTTAACGGA AGCTTCAGAA GCTCATGAGT CTATTCCCAGGAGTATGGGT AAAGTTTGCT CATGCAAATG CTGCATTTCA TGAGTCCATG GGTTAAAGCAGTTACGGACC CTGGAAGATG GGAGATACTT ACAAAAAGCA AAGCCCAGAT CTCCACACCTTCAAAGAGAA GATGCTCAAA TCTCCAATTT TCAGACCAGT GCTTTTTTCA GTTATGCACTGGTATATGGC TGAAACTGTA GGTGGCATGG GAGACTTTGG TAAGTGTAGG CCCTAGGATATCTGTCCCAC CATTTTCCCT GTAACAAAAG TAAGGAATCT GTAA

本發(fā)明還涉及識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物在制備判斷T2DM發(fā)病和治療情況的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的標(biāo)記物包括但不限于：

(1)結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組或熒光標(biāo)記的結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組；

(2)結(jié)合所述長非編碼RNA的小分子化合物；

(3)結(jié)合所述長非編碼RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗體或抗體功能片段、熒光標(biāo)記的抗體或抗體功能片段、RNA結(jié)合蛋白或其功能片段、熒光標(biāo)記的RNA結(jié)合蛋白或其功能片段。

優(yōu)選的，所述的引物組或熒光標(biāo)記的引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，

Lincpint Primer F(SEQ ID NO：2)：5'ACGCTCTCGGAATCTACGTG3',

Primer R(SEQ ID NO：3)：5’-CTCCCGAAAGTGAGGCAAGG-3’。

beta-actin Primer F(SEQ ID NO：4)：5'AGGTCATCACTATTGGCAACGA 3',

Primer R(SEQ ID NO：5)：5'CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT 3'。

本發(fā)明還涉及包含所述的識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物的用于判斷T2DM發(fā)病情況的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還涉及所述的識(shí)別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物或包含所述標(biāo)記物的試劑或試劑盒在判斷T2DM的發(fā)病情況中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在制備治療T2DM的藥物中的應(yīng)用；

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選判斷T2DM發(fā)病情況的診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選治療T2DM的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用8周齡的雄性B6.BKS-Leprdb(db/db)小鼠和對照小鼠各40只，體重在30g左右，從南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所(MARC)購買。6-8周大小的雄性Balb/c小鼠，各50只，體重25g左右，從南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購買。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

細(xì)胞培養(yǎng)

胰島beta細(xì)胞系(MIN6細(xì)胞)用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入15％FBS，2.5mMβ-巰基乙醇，100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的鏈霉素，在37℃，含5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NIT-1細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，10％FBS，加入雙抗，在37℃，含5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80％-90％時(shí)傳代。是從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買(上海，中國)。NCIH1299，NCI-H1975，SK-MES-1和16HBE細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SPC-A1和PC9細(xì)胞在D MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清，的，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RNA提取和定量PCR分析

根據(jù)試劑的使用說明，用Trizol試劑分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa Prime Script試劑盒(TaKaRa，大連，中國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參beta-actin進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)操作說明用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Lincpint-siRNA和control-siRNA。MIN6和NIT-1細(xì)胞融合滿了就接種到六孔板里，然后根據(jù)說明操作。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用于qRT-PCR或免疫印跡分析。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

MTT法檢測細(xì)胞增殖活力：首先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h后按每孔8000個(gè)細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。12h后，棄去培養(yǎng)基，20μl的MTT反應(yīng)液加入每孔，37℃避光孵育4h。棄上清，150μl的二甲亞砜(DMSO)加入每孔，震蕩10min，測定490nm波長處的吸光值。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：將細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48h后，用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化下來，4℃，1000g離心，棄上清，PBS洗2遍。將預(yù)冷的75％乙醇吹勻細(xì)胞后離心，在-20℃過夜。離心棄去上清，PBS洗2遍。每個(gè)樣品取450μl PBS吹勻離心，50μl的碘化丙錠加入其中，混勻后放在37℃水浴箱30 min。離心棄去上清，PBS吹勻離心，用流式細(xì)胞儀(BD公司)測量并分析。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48h后，用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化下來，4℃，1000g離心，棄上清，PBS洗2遍。吸盡細(xì)胞沉淀殘留的PBS，振蕩30s，使細(xì)胞懸浮。將200μl含鈣離子的結(jié)合緩沖液加入，再將10μl Annexin V-FITC熒光探針加入，輕輕振蕩混勻，避光放置30min。5μl的碘化丙錠加入細(xì)胞中，振蕩混勻，避光放置5min。400μl結(jié)合緩沖液加入其中，振蕩混勻后，用流式細(xì)胞儀檢測。

葡萄糖刺激的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)(GSIS)

將MIN6細(xì)胞種于48孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)60-70％，棄去培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48h后，進(jìn)行GSIS實(shí)驗(yàn)。配制glucose-free Krebs-Ringer bicarbonate(Krb)(115mM NaCl,4.7mM KCl,1.2mM MgSO4.7H2O,1.2mM KH2PO4,20mM NaHCO3,16mM HEPES,2.56mM CaCl2,0.2％BSA)溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔數(shù)配制低糖液(2mM)、高糖液(20mM)。加入低糖液200ul，棄掉。加200ul的低糖液，37℃培養(yǎng)1h后棄掉，每孔加入200ul低糖液，37℃培養(yǎng)1h，收集上清至EP管中。加200ul高糖液，37℃培養(yǎng)1h收集上清至EP管中。加200ul的酸乙醇，4℃過夜，取上清至EP管中，放在-80℃。用放免法(RIA)檢測胰島素含量。

小鼠胰島細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

小鼠胰島的提取及純化：配HBSS溶液(KCl 0.4g，KH2PO 40.06g，MgCl2.6H2O 0.1g，MgSO4.7H2O0.1g，CaCl2 0.1g，NaCl 8g，NaHCO3 0.35g，NaHPO4.7H2O 0.09g去離子水至IL，PH7.4)配制膠原酶(膠原酶V用HBSS溶液配制，1mg/ml)，小鼠禁食12h以上，配制戊巴比妥鈉，麻醉小鼠。剖腹開胸，找到胰總管，用線結(jié)扎。剪心臟放血，擦干血跡，找到胰總管，進(jìn)行插管。推注射器先慢后快。胰腺充盈一般需2ml。將胰腺剝離下來，放在滅菌的50ml離心管中，隨后放在冰上。向50ml離心管中加膠原酶V至5ml。37度水浴25min。把離心管取出，放置冰上。渦旋離心管，將組織渦旋成泥沙狀。加入帶血清的HBSS溶液2倍體積，混勻終止消化。用篩子除去未消化的組織塊至新的離心管。1000g(加速度9，減速度9)，2分鐘，4度。棄上清，加入不含血清的HBSS，離心洗一遍。棄上清。加入Histopaque 5ml，吹打混勻，放入10ml玻璃管中，用巴氏吸管緩慢加入HBSS，5ml。2000g(加9，減1)，20分鐘，4度。離心后，將中間的白色顆粒層吸出到大皿中待挑。在顯微鏡下粗挑。原代胰島細(xì)胞的培養(yǎng)：原代胰島細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，10％FBS，雙抗培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜細(xì)挑。原代胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)12h后，將每孔200個(gè)胰島分配在6孔板里。取10μl脂質(zhì)體，100pmol si-Lincpint，si-NC加在OPTI-MEMI 200μl中，吹打混勻。室溫下放置5分鐘。將脂質(zhì)體與si-Lincpint混合，及脂質(zhì)體和si-NC混合，吹打混勻。室溫下放置20分鐘。在6孔板中加入1.6ml OPTI-MEMI，將混合液均勻滴入，將胰島挑至每孔。6h后更換培養(yǎng)基，將胰島挑至每孔。

在動(dòng)物體內(nèi)干擾Lincpint

選擇干擾效率最高的si-Lincpint#1，Invitrogen公司合成活體的小干擾序列。將50nmol的si-Lincpint溶于200ul PBS的用針頭通過尾靜脈(hydrodynamic intravenous(IV)tail vein injections)注射入成年小鼠體內(nèi)，作為si組,另取相同體積的亂序注入成年小鼠，作為NC組。48h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

腹腔注射的葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)

將si-NC和si-Lincpint小鼠禁食12h。按照每g體重需2mg葡萄糖，腹腔注射葡萄糖。體積(ml)＝體重(g)/100。用75％乙醇消毒動(dòng)物腹部，并用棉球干燥。牢牢抓住受試動(dòng)物背部并用注射器腹腔注射葡萄糖。分別在注射前0，15，30，60，90，120時(shí)，剪尾來測血糖。

免疫印跡分析和抗體

細(xì)胞蛋白裂解產(chǎn)物通過10％SDS-PAGE分離開，轉(zhuǎn)移到0.22μm NC膜，用特定的抗體孵育。放射自顯影用密度測定法從而被量化。Beta-actin抗體被用來作為對照。EZH2，beta-actin抗體(1:1000)從CST公司購買。

ELISA法測小鼠血清胰島素

活體小鼠，眼眶靜脈采血。取0，15，30，60，90，120時(shí)間點(diǎn)的血液，室溫放置30min，離心3000g，15min。收集上層血清，可保存于-20℃。將試劑盒中試劑放置室溫。用ddH2O把10X wash buffer稀釋至1X，每孔加300微升wash buffer，洗3次。對照和樣品加10微升assay buffer，對照和標(biāo)準(zhǔn)孔(0.2，0.5，1，2，5，10ng/ml)加10微升matrix solution；標(biāo)準(zhǔn)孔中加入10微升的各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在樣品孔中加10微升的血清樣品，所有孔加80微升detection Ab，搖床上室溫孵育2小時(shí)(此步之前的所有操作盡量在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成)。wash buffer清洗3次，每孔300微升；每孔100微升enzyme solution，搖床室溫孵育30min。吸出，wash buffer清洗6次，每孔300微升；吸出，每孔100微升substrate；搖床室溫孵育15min，會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。吸出，每孔100微升stop solution，藍(lán)色變黃色，在450nm波長下酶標(biāo)儀中讀數(shù)。

數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，用雙尾Student’s T檢驗(yàn)組間差異，相關(guān)性分析用線性回歸模型分析。P<0.05，P<0.01或P<0.001為顯著差異。

附圖說明

圖1.在正常Balb/c小鼠中，Lincpint的表達(dá)情況

1A：相對于心、肝、脾、肌、腎，Lincpint在胰腺組織中相對高表達(dá)；

1B：Lincpint在小鼠胰島中是外分泌部的7倍

圖2.在db/db小鼠胰島中，Lincpint表達(dá)下調(diào)

2A采用8周齡及12周齡對照小鼠和db/db小鼠，同時(shí)檢測了隨機(jī)血糖變化：與對照小鼠相比，db/db小鼠的隨機(jī)血糖都有升高(P<0.05)；

2B-2C提取對照小鼠和db/db小鼠的胰島，通過qPCR技術(shù)檢測了Ins1，Ins2，Lincpint的表達(dá)情況：與8周齡及12周齡對照小鼠相比，Lincpint在相同周齡的db/db小鼠胰島中表達(dá)下調(diào)37±3％及49±5％(P<0.05)，

2D:在MIN6細(xì)胞中給予棕櫚酸鹽(palmitate 0.5mM)處理48h后，通過qPCR檢測Lincpint的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，palmitate處理組中Lincpint的表達(dá)水平下調(diào)37±2％(P<0.01)

圖3.Lincpint的表達(dá)受到葡萄糖的調(diào)控

3A-B：與正常糖濃度25mM相比，Ins2，MafA在5.5,11.1,33.3mM表達(dá)下調(diào)

3C：與正常糖濃度25mM相比，Lincpint在5.5,11.1,33.3mM表達(dá)下調(diào)28％±2％，32％±7％，32％±3％，與Ins2及MafA的表達(dá)趨勢一致

圖4.在小鼠細(xì)胞系中，下調(diào)Lincpint抑制胰島素的分泌

4A，4B：與對照相比，Lincpint siRNA#1的干擾效率達(dá)80±3％及68±3％；

4C，4D：干擾組中，在低糖濃度2mM刺激下，胰島素的分泌無明顯差異，但高糖濃度20mM刺激下，干擾組的胰島素分泌下調(diào)42％，同時(shí)下調(diào)Lincpint后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)的胰島素content減少22％。

圖5.在小鼠細(xì)胞系及原代胰島中，下調(diào)Lincpint的表達(dá)抑制胰島素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

5A，5C，5E：干擾組中Ins1和Ins2表達(dá)均下調(diào)；

5B，5D，5F：干擾Lincpint后，轉(zhuǎn)錄因子MafA,Pdx1,Glut2mRNA水平表達(dá)下調(diào)；

5G-H：干擾組轉(zhuǎn)錄因子MafA,Pdx1,Glut2的蛋白表達(dá)減少，與mRNA表達(dá)水平一致

圖6.在MIN6細(xì)胞中，下調(diào)Lincpint的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡

6A：干擾Lincpint后，細(xì)胞活力受到抑制；

6B-C：干擾組中，細(xì)胞周期不受影響；

6D-E:干擾組中，細(xì)胞凋亡增加了8.5％；

6F-G：干擾Lincpint后，促凋亡蛋白Bax,剪切型caspase3，caspase9表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少。

圖7.在正常成年Balb/c小鼠中，下調(diào)Lincpint的表達(dá)會(huì)減弱胰島素分泌能力

7A：與對照組相比，干擾組胰腺中的干擾效率為55±7.9％；

7B-C：與對照組相比，15min，30min干擾組的血糖都有升高，0min，15min，60min干擾組的胰島素水平有所下降；

7D：與對照組相比，Ins1，Ins2，MafA，Pdx1，Glut2的表達(dá)下調(diào)，與細(xì)胞水平的結(jié)果一致。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的細(xì)胞株、siRNA干擾序列以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

實(shí)施例1檢測Lincpint在正常Balb/c小鼠中的表達(dá)情況

原代胰島細(xì)胞的提取，配HBSS溶液(KCl 0.4g，KH2PO 40.06g，MgCl2.6H2O 0.1g，MgSO4.7H2O0.1g，CaCl2 0.1g，NaCl 8g，NaHCO3 0.35g，NaHPO4.7H2O 0.09g去離子水至IL，PH7.4；配制膠原酶(膠原酶V用HBSS溶液配制，1mg/ml)；小鼠禁食12h以上，配制戊巴比妥鈉，麻醉小鼠。；剖腹開胸，找到胰總管，用線結(jié)扎；剪心臟放血，擦干血跡，找到胰總管，進(jìn)行插管；推注射器先慢后快。胰腺充盈一般需2ml。將胰腺剝離下來，放在滅菌的50ml離心管中，隨后放在冰上；向50ml離心管中加膠原酶V至5ml。37度水浴25min；把離心管取出，放置冰上；渦旋離心管，將組織渦旋成泥沙狀。加入帶血清的HBSS溶液2倍體積，混勻終止消化；用篩子除去未消化的組織塊至新的離心管。1000g(加速度9，減速度9)，2分鐘，4度；棄上清，加入不含血清的HBSS，離心洗一遍；棄上清，加入Histopaque 5ml，吹打混勻，放入10ml玻璃管中，用巴氏吸管緩慢加入HBSS，5ml；2000g(加9，減1)，20分鐘，4度；離心后，將中間的白色顆粒層吸出到大皿中待挑。在顯微鏡下粗挑。原代胰島細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，10％FBS，雙抗培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜細(xì)挑。

取0.1g組織，液氮研磨充分(成粉末狀)或手挑的胰島細(xì)胞，預(yù)冷的PBS潤洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以無酶槍頭吹打混勻，靜置5min，將裂解液移入預(yù)先標(biāo)記好的無菌無酶1.5ml的離心管中。4℃7500g離心5分鐘，取上清加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻30s，靜置2-4min。4℃，12000g離心，15min。溶液分三層(水相-白色沉淀-紅色有機(jī)物)，轉(zhuǎn)移水相層至新的1.5ml離心管中，盡量不要吸到白色沉淀。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置5-10min。4℃，12000g離心，10min。吸棄上清，加入1ml 75％的乙醇(現(xiàn)配)，洗滌RNA沉淀。4℃，7500g離心，5min，棄上清。盡量去除75％的酒精，于室溫中晾干，約15min。用無RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收測定法測定RNA的濃度。使用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。在260nm處讀值1為表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA純度的檢測，比值范圍在1.8到2.1表明符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。配制1％的瓊脂糖膠。加熱溶解瓊脂糖，冷卻，加入1μl溴化乙錠(EB，10mg/ml)。搖勻后倒膠，待膠冷凝后，置于電泳槽中，浸于1×TAE緩沖液中平衡10min，待用。點(diǎn)樣。按1：4(v/v)將5×核酸電泳上樣緩沖液與樣本混合，準(zhǔn)確將各樣本含有1μg的RNA加入凝膠孔中。80V恒壓電泳50min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

Tris-乙酸(TAE)緩沖液配方(1L)50×：

實(shí)時(shí)定量PCR

Balb/c小鼠各個(gè)組織，原代胰島細(xì)胞及外分泌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa PrimeScript 試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物序列，

QPCR應(yīng)用7300PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA樣品采用三部法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參beta-actin進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

Lincpint的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-ACGCTCTCGGAATCTACGTG-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-CTCCCGAAAGTGAGGCAAGG-3’。

結(jié)果表明，相對于心、肝、脾、肌、腎，Lincpint在胰腺組織中相對高表達(dá)(P<0.05)(圖1A)。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了Lincpint在小鼠胰腺內(nèi)外分泌部中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示Lincpint在小鼠胰島中是外分泌部的7倍(P<0.05)(圖1C)。。

實(shí)施例2在db/db小鼠胰島中，Lincpint表達(dá)下調(diào)

db/db(diabetes)小鼠是T2DM小鼠模型，在小鼠4號(hào)常染色體的db基因發(fā)生隱性突變，是由瘦素受體缺陷導(dǎo)致的自發(fā)二型糖尿病小鼠，是研究T2DM較好的動(dòng)物模型。

db/db小鼠在2周左右開始出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗，隨后出現(xiàn)肥胖，一般到了4周以后血糖明顯增高，胰島beta細(xì)胞遭到明顯的破壞，八周以后隨機(jī)血糖達(dá)到20mmol/L以上，出現(xiàn)典型的糖尿病癥狀。8周齡及12周齡對照小鼠和db/db小鼠，同時(shí)檢測了隨機(jī)血糖變化(Fig2.A)：與對照小鼠相比，db/db小鼠的隨機(jī)血糖都有升高(P<0.05)。提取對照小鼠和db/db小鼠的胰島，通過qPCR技術(shù)檢測了Ins1，Ins2，Lincpint的表達(dá)情況(Fig2.B-C)：與8周齡及12周齡對照小鼠相比，Lincpint在相同周齡的db/db小鼠胰島中表達(dá)下調(diào)37±3％及49±5％(P<0.05)，與Ins1和Ins2的mRNA水平變化一致，提示Lincpint可能參與了T2DM的發(fā)生發(fā)展。

有研究報(bào)道，T2DM的發(fā)生與脂肪酸的聚集有關(guān)，在體內(nèi)長期的脂肪酸水平的升高會(huì)引起beta細(xì)胞功能損傷以及beta細(xì)胞的死亡，從而引起糖尿病的發(fā)生。在體外細(xì)胞系中給予脂肪酸處理，會(huì)抑制GSIS功能及insulin的轉(zhuǎn)錄[38]。我們在MIN6細(xì)胞中給予棕櫚酸鹽(palmitate 0.5mM)處理48h后，通過qPCR檢測Lincpint的表達(dá)水平，結(jié)果顯示(Fig.2D)：與對照組相比，palmitate處理組中Lincpint的表達(dá)水平下調(diào)37±2％(P<0.01)，提示Lincpint可能與T2DM中胰島beta細(xì)胞功能損傷有關(guān)。

實(shí)施例3在小鼠細(xì)胞系中，下調(diào)Lincpint抑制胰島素的分泌

為了檢測Lincpint對胰島細(xì)胞功能的影響，Invitrogen公司設(shè)計(jì)和合成小鼠Lincpint的三條干擾序列，并合成了相應(yīng)的亂序做對照。我們在MIN6及NIT-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了Lincpint的3個(gè)干擾序列，實(shí)時(shí)定量PCR檢測它們的干擾效率，結(jié)果顯示(Fig.4A-B)：與對照相比，Lincpint siRNA#1的干擾效率達(dá)80±3％及68±3％(P<0.01)。

將MIN6細(xì)胞種于48孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)60-70％，棄去培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48h后，進(jìn)行GSIS實(shí)驗(yàn)。配制glucose-free Krebs-Ringer bicarbonate(Krb)(115mM NaCl,4.7mM KCl,1.2mM MgSO4.7H2O,1.2mM KH2PO4,20mM NaHCO3,16mM HEPES,2.56mM CaCl2,0.2％BSA)溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔數(shù)配制低糖液(2mM)、高糖液(20mM)。加入低糖液200ul，棄掉。加200ul的低糖液，37℃培養(yǎng)1h后棄掉，每孔加入200ul低糖液，37℃培養(yǎng)1h，收集上清至EP管中。加200ul高糖液，37℃培養(yǎng)1h收集上清至EP管中。加200ul的酸乙醇，4℃過夜，取上清至EP管中，放在-80℃。用放免法(RIA)檢測胰島素含量。

首先檢測了Lincpint對胰島素合成及分泌的影響，我們使用了胰島素分泌功能最強(qiáng)的MIN6細(xì)胞。在MIN6細(xì)胞中干擾Lincpint 48h后，檢測胰島素分泌量及胰島素總量的變化結(jié)果顯示(Fig.4C-D)：干擾組中，在低糖濃度2mM刺激下，胰島素的分泌無明顯差異(P＝0.66)，但高糖濃度20mM刺激下，干擾組的胰島素分泌下調(diào)42％(P<0.05)，同時(shí)下調(diào)Lincpint后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)的胰島素content減少22％(P<0.05)。以上結(jié)果提示Lincpint的下調(diào)會(huì)損傷胰島素分泌功能。

實(shí)施例4在小鼠細(xì)胞系及原代胰島中，下調(diào)Lincpint的表達(dá)抑制胰島素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

蛋白質(zhì)的變性：樣本按1:4的體積比例加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，混勻，99℃加熱10min，-20℃保存。

蛋白電泳：將變性完成的蛋白樣品按40μg/孔，加入預(yù)先制好的變性聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)的加樣孔中；先以80V電壓恒壓使蛋白樣本經(jīng)濃縮膠壓縮，待樣品進(jìn)入分離膠后，切換成120V電壓 恒壓繼續(xù)電泳45-50min，使樣本中的蛋白分離。

SDS-PAGE膠配方：

4％濃縮膠(總4ml)：

10％分離膠(總6ml)：

12.5％分離膠(8ml)：

5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(1L)：

轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后按蛋白marker根據(jù)目的蛋白的大小，將特定位置的膠條切至合適大小(切角標(biāo)記)，用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡10min。膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙(上下各兩層)和醋酸纖維素(NC)膜(剪角標(biāo)記)，轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按照陽極碳板、濾紙、NC膜、凝膠、濾紙、陰極不銹鋼板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步均需去除氣泡，蓋上陰極不銹鋼板。接通電源，恒流1mA/cm²，根據(jù)不同蛋白分子量的大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜時(shí)間。

1×半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液配方(1L)：

封閉：待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移了蛋白的NC膜取出，用1×TBST沖洗膜一次。隨后用1×TBST緩沖液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05％Tween-20,pH7.6)配制的5％脫脂牛奶于室溫中封閉2h，以封閉膜上非特異性蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

抗體孵育：用1×TBST緩沖液配制的5％脫脂牛奶稀釋一抗(EZH2,GAPDH，1:1000)，4℃，輕搖過夜。1×TBST緩沖液洗膜，5min×3次。分別加入1×TBST緩沖液配制的5％脫脂牛奶稀釋的抗兔或小鼠的辣根過氧化物偶聯(lián)IgG，室溫中振搖孵育2h。1×TBST緩沖液洗膜，10min×3次。

ECL檢測：避光配制ECL-plus顯色液，混勻后滴加在放置平整的塑封膜上，待反應(yīng)1min，隨即將NC膜夾入塑封膜中。在暗室中覆蓋感光膠片，根據(jù)熒光的強(qiáng)度決定曝光的時(shí)間。

為了探討Lincpint對胰腺beta細(xì)胞胰島素合成和分泌的影響是否是由于beta細(xì)胞中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子變化引起的，我們首先在MIN6、NIT-1細(xì)胞及原代胰島中干擾Lincpint后檢測beta細(xì)胞中insulin的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本Ins1及Ins2的變化，結(jié)果顯示(Fig.5A、C、E)：干擾組中Ins1和Ins2表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。隨后檢測了與insulin合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(Fig.5B、D、F)：干擾Lincpint后，轉(zhuǎn)錄因子MafA,Pdx1,Glut2mRNA水平表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。在MIN6細(xì)胞檢測了轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)情況(Fig.5G-H)：干擾組轉(zhuǎn)錄因子MafA,Pdx1,Glut2的蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，與mRNA表達(dá)水平一致。以上結(jié)果提示下調(diào)Lincpint會(huì)引起insulin合成的減少。

實(shí)施例5在正常成年Balb/c小鼠中，下調(diào)Lincpint的表達(dá)會(huì)減弱胰島素分泌能力

選擇干擾效率最高的si-Lincpint#1，Invitrogen公司合成活體的小干擾序列。將50nmol的si-Lincpint溶于200ul PBS的用針頭通過尾靜脈(hydrodynamic intravenous(IV)tail vein injections)注射入成年小鼠體內(nèi)，作為si組,另取相同體積的亂序注入成年小鼠，作為NC組。48h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

腹腔注射的葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)：將si-NC和si-Lincpint小鼠禁食12h。按照每g體重需2mg葡萄糖，腹腔注射葡萄糖。體積(ml)＝體重(g)/100。用75％乙醇消毒動(dòng)物腹部，并用棉球干燥。牢牢抓住受試動(dòng)物背部并用注射器腹腔注射葡萄糖。分別在注射前0，15，30，60，90，120時(shí)，剪尾來測血糖。

ELISA法測小鼠血清胰島素：活體小鼠，眼眶靜脈采血。取0，15，30，60，90，120時(shí)間點(diǎn)的血液，室溫放置30min，離心3000g，15min。收集上層血清，可保存于-20℃。將試劑盒中試劑放置室溫，用ddH2O把10X wash buffer稀釋至1X。每孔加300微升wash buffer，洗3次；對照和樣品加10微升assay buffer。對照和標(biāo)準(zhǔn)孔(0.2，0.5，1，2，5，10ng/ml)加10微升matrix solution，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入10微升的各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在樣品孔中加10微升的血清樣品。所有孔加80微升detection Ab，搖床上室溫孵育2小時(shí)(此步之前的所有操作盡量在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成)，wash buffer清洗3次，每孔300微升；每孔100微升enzyme solution。搖床室溫孵育30min，吸出，wash buffer清洗6次，每孔300微升；吸出，每孔100微升substrate。搖床室溫孵育15min，會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，吸出，每孔100微升stop solution，藍(lán)色變黃色，在450nm波長下酶標(biāo)儀中讀數(shù)。

將50nmol siRNA溶于0.2ml PBS中，通過尾靜脈快速注入小鼠體內(nèi)，在成年小鼠中外源性封閉Lincpint的表達(dá)。同時(shí)將相同體積的亂序注入對照組小鼠體內(nèi)。48h后，檢測其在胰腺中的干擾效率，結(jié)果顯示(Fig.7A)：與對照組相比，干擾組胰腺中的干擾效率為55±7.9％(P<0.05)。

干擾48h后，進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，檢測注射葡萄糖前0min及注射后15min，30min，60min，90min，120min的血糖及胰島素水平，結(jié)果顯示(Fig.7B-C)：與對照組相比，15min，30min干擾組的血糖都有升高(P<0.05)，0min，15min，60min干擾組的胰島素水平有所下降(P<0.05)。

在活體水平中，通過qPCR檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化，結(jié)果顯示(Fig.7D)：與對照組相比，Ins1，Ins2，MafA，Pdx1，Glut2的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，與細(xì)胞水平的結(jié)果一致。

實(shí)施例6Lincpint在機(jī)制方面的初步研究

核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)：大皿里的細(xì)胞用PBS洗2次；胰酶將細(xì)胞消化下來，2mL培養(yǎng)基終止消化，吸入2mL無菌無酶管，4℃，500g，5分鐘；加入1mL PBS，棄上清，加入500μL Cell fractionation Buffer，輕輕吹打，冰上放5～10分鐘后，4℃，500g，5分鐘；上清移入新2mL無菌無酶管，4℃，500g，5分鐘；沉淀中加入500μL Cell fractionation Buffer，混勻后，加入500μL 2×Lysis/binding solution，吹打混勻，靜置后棄去上清，加入預(yù)冷的500μL Cell Disruption Buffer，渦旋混勻；加入500μL無水乙醇，吹打混勻，把吸附柱放到收集管中，加入700μL反應(yīng)液，12,000g，30s，棄掉收集管內(nèi)液體，并按照以下步驟進(jìn)行：加入700μL Wash solutionⅠ，12,000g，30s，棄掉收集管，然后加入500μL Wash solution 2/3，12,000g，30s，棄收集管，最大轉(zhuǎn)速離心空柱1min，棄掉收集管；吸附柱放到新收集管中，加入40μL Elution solution(水浴到95℃)12,000g，30s洗脫，再加入10μL進(jìn)行洗脫；測定RNA濃度，去DNA逆轉(zhuǎn)錄，qPCR。

在MIN6細(xì)胞中，通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測Lincpint的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(Fig.8A)：Lincpint主要表達(dá)于細(xì)胞核中，提示其主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)。在MIN6細(xì)胞中干擾Ezh2，檢測轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，結(jié)果顯示(Fig.8C-D)：干擾組Ins1，Ins2，轉(zhuǎn)錄因子MafA，Pdx1，Glut2的mRNA和蛋白水平下調(diào)，與干擾Lincpint組的結(jié)果一致。提示Lincpint可能通過綁定Ezh2，沉默下游靶基因，引起轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)改變，從而影響beta細(xì)胞功能。