尿液用于評估肝癌癥疾病的生物標(biāo)記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于評估肝癌癥疾病的新生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物對肝癌中病理 學(xué)改變較敏感，特別是在疾病或損傷早期階段。此外，本發(fā)明涉及用于評估人患肝癌的風(fēng) 險(xiǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 代謝組學(xué)（1116丨3130110111；[08/1116丨313010111；[08)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之 后提出的一門新的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)中的一個(gè)重要組成部分。生物機(jī)體在受到外界病源 或環(huán)境改變的刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生多層次、多器官和多組織的應(yīng)答反應(yīng)，這些應(yīng)答反應(yīng)最終將影 響到終端代謝水平的變化正是研究這種機(jī)體在受到內(nèi)因、外因的刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)的終端小 分子代謝物(通常指分子量小于1000 Da)的變化規(guī)律的科學(xué)，從整體上動(dòng)態(tài)地闡述生理或病 理狀態(tài)下機(jī)體對外界刺激的應(yīng)答和動(dòng)態(tài)系統(tǒng)性的變化過程，為全面理解多因素影響下的癌 癥的發(fā)生機(jī)制研究將提供一個(gè)新的視角。同時(shí)，從整體上考察人體的生理狀態(tài)，能得到更多 的疾病相關(guān)信息，有利于癌癥的早期診斷。另外，代謝組學(xué)技術(shù)分析的樣本主要是尿液和血 液，其采集過程對人體無傷害或是有極小的傷害，因此代謝組學(xué)的方法將有利于癌癥的大 規(guī)模篩查。
[0003] 癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。癌細(xì)胞的特點(diǎn)是無限制、無止境地增生，使患者體 內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可 轉(zhuǎn)移到全身各處生長繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能 受損等等，繼而破壞組織、器官的結(jié)構(gòu)和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終由于器官 功能衰竭而死亡。
[0004] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按 細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞型肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及混合型肝癌。按腫瘤的形態(tài)可分為結(jié)節(jié) 型、巨塊型和彌漫型。原發(fā)性肝癌在我國屬于高發(fā)病，一般男性多于女性。中國是乙肝大 國，我國的肝癌多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，丙肝病人也在逐漸增加，乙肝后也會(huì)發(fā) 展為肝癌。目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴(yán)重 威脅我國人民健康和生命的一大殺手。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒有什么 不適，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期。故治療難度大、療效差，發(fā)病后生存時(shí)間短。在 我國，每年有11萬人死于肝癌，其中男性8萬，女性3萬，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。作 為最常見的一種惡性腫瘤，肝癌死亡率僅居高，全國每年至少有12萬人被肝癌奪去生命。
[0005] 肝癌起病隱匿，超過60%的肝癌患者在初次就診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入中晚期，從而失去根 治性治療的機(jī)會(huì)，總體5年生存率只有7%左右。目前，臨床上常用的肝癌診斷標(biāo)記物為甲 胎蛋白，簡稱AFP。然而，甲胎蛋白診斷肝癌的敏感度和特異度并不十分理想，在妊娠婦女、 急慢性肝炎、生殖腺腫瘤和胃腸道腫瘤等人群中也可能升高。而且，臨床上有40%的肝癌患 者甲胎蛋白并不升高，呈現(xiàn)陰性。因此，尋找特異性和敏感性均高的診斷肝癌、特別是早期 肝癌的分子標(biāo)記物，成為臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0006] 目前臨床上以大分子癌癥標(biāo)記物的單一或聯(lián)合使用作為癌癥診斷手段的研究較 多，而對于小分子類癌癥標(biāo)記物缺乏系統(tǒng)深入的研究?，F(xiàn)代研究表明，內(nèi)源性小分子物質(zhì)多 胺類化合物與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。國內(nèi)外研究均表明癌癥患者體內(nèi)多胺水平高于正常人 群及非腫瘤患者體內(nèi)多胺水平。多胺在生物體內(nèi)多是水溶性的，通常在體液pH環(huán)境下完全 質(zhì)子化，以多陽離子形式存在，常與RNA，DNA等多陰離子復(fù)合體結(jié)合在一起，并處于動(dòng)態(tài)平 衡之中。多胺能直接參與生物體內(nèi)的多種生理活動(dòng)，如核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，蛋白質(zhì)的合 成和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等，它是生物體生長和細(xì)胞代謝所必須的內(nèi)源性微量活性物質(zhì)。一般在 RNA，DNA及蛋白質(zhì)合成增高之前，多胺含量急劇上升，如在癌癥組織中多胺水平明顯升高， 而多胺的過度積累還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡及轉(zhuǎn)變，使癌癥進(jìn)一步惡化。多胺包括1，3-丙二 胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺、?；?、?；返?。目前研究未能證實(shí)何種多胺為癌癥的生 物標(biāo)記物，也未能找到肝癌的特異性標(biāo)記物，這大大影響了多胺作為肺癌輔助診斷、預(yù)后和 療效評價(jià)指標(biāo)等方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供肝癌的特異性多胺生物標(biāo)記物，該標(biāo)記物為人尿液中腐胺與 酰化腐胺，具體為腐胺與酰化腐胺濃度的比值。
[0008] 本發(fā)明采用UHPLC-MS/MS法分別檢測健康人和癌癥病人尿液樣本中1，3-丙二 胺（DAP)，腐胺（PUT)，尸胺（CAD)，精脒（SPD)，精胺（SPM)，胍丁胺（AGM)，鳥氨酸（0RN)， 賴氨酸（LYS)，精氨酸（ARG)，S-腺苷蛋氨酸（SAM)，?；罚∟PUT)，?；罚∟SPM)， ?；撸∟SPD)與Y-氨基丁酸（GABA)等14種與多胺合成與分解代謝密切相關(guān)物 質(zhì)的濃度° (詳見 Determination of polyamine metabolome in plasma and urine by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method:Application to identify potential markers for human hepatic cancer. Anal Chim Acta. 2013; 791:36-45)對于得到的檢測數(shù)據(jù)，首先對所測得的尿液中多胺類物質(zhì)的 數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值檢測，去掉由于樣本收集或者測定誤差等導(dǎo)致的異常樣本。進(jìn)而分別對肝 癌患者和健康人賦值為1和2作為因變量，以14種待測物為自變量進(jìn)行二元邏輯回歸分 析，所得到的變量腐胺與?；窛舛瓤梢宰鳛閰^(qū)分肝癌與健康人的依據(jù)。最后以此變量 為指標(biāo)采用聚類分析的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明以腐胺與酰化腐胺濃度的比值為指標(biāo)可以 將肝癌患者與健康人區(qū)分開來。
[0009] 本發(fā)明的目的還包括提供應(yīng)用尿液中腐胺與?；窛舛缺戎颠M(jìn)行肝癌評估的 方法，其步驟包括：
[0010] (1)分別收集肝癌患者和待評估人的尿液樣本；
[0011] (2)分別檢測肝癌患者和待評估人尿液樣本中腐胺與?；返臐舛?；