陸地棉snp標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及SNP標記，尤其涉及陸地棉SNP標記，本發(fā)明還涉及所述陸地棉SNP標 記在陸地棉遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定中的應(yīng)用，屬于陸地棉SNP標記的開發(fā)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（簡稱SNPs)標記在基因組中具有數(shù)量多、分布密度高的特點，而 且在基因分型過程中不需要根據(jù)片段大小判斷，可以大規(guī)模的自動化的完成。與微衛(wèi)星標 記等重復(fù)序列多態(tài)（SSR)標記相比，SNPs具有很高的遺傳穩(wěn)定性，尤其是處在編碼區(qū)中的 SNPs，工作效率更高，更適合進行大樣本量檢測分析，因此現(xiàn)在的生物學(xué)家認為SNP標記是 很有應(yīng)用前景的分子標記技術(shù)（王建康，蓋鈞錳.利用雜種F2世代鑒定數(shù)量性狀主基因一 多基因混合遺傳模型并估計其遺傳效應(yīng).遺傳學(xué)報，1997, 24(5) :432-440.)。
[0003] 隨著棉花基因組研究的深入，二倍體雷蒙徳氏棉、亞洲棉和四倍體陸地棉基因 組測序相繼完成（Wang,Κ·，Ζ·Wang,F.Li,W.Ye,J.Wangetal.，2012Thedraftgenome ofadiploidcottonGossypiumraimondii.Nat.Genet.44:1098 - 1103 10.1038/ ng. 2371 ；Li,F.G. ,G.Y.Fan,K.B.Wang,F.M.Sun,Y.L.Yuanetal. , 2014Genomesequence ofthecultivatedcottonGossypiumarboreum.Nat.Genet. 46:567 - 572 10.1038/ Ng. 2987 ；Li,F.G. ,G.Y.Fan,C.R.Lu,G.H.Xiao,C.S.Zhouetal. , 2015Genomesequence ofcultivatedUplandcotton(GossypiumhirsutumTM-1)providesinsightsinto genomeevolution.NATUREBIOTECHNOLOGY,doi: 10. 1038/nbt. 3208)，研究者在此基礎(chǔ) 上開發(fā)了大量的SNP標記，進一步利用這些SNP標記合成了一個63K的棉花SNP芯片 (Hulse-KempA.Μ. ,LemmJ,PlieskeJ,etal.Developmentofa63KSNPArrayfor CottonandHigh-DensityMappingofIntraspecificandInterspecificPopulations ofGossypiumspp.G3(Bethesda)5:1187_1209)〇
[0004] 然而，上述SNP標記在開發(fā)的過程中僅僅根據(jù)幾個棉花種間的序列差異進行標記 開發(fā)，并沒有考慮棉花基因組的異源多倍性。因此，目前已有的棉花SNP標記及其棉花SNP 芯片并沒有對標記的拷貝數(shù)進行分析，導(dǎo)致大部分標記在陸地棉基因組中存在多個拷貝， 在進行遺傳多樣性分析、品種鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及關(guān)聯(lián)分析時的效率比較低。例如， 本發(fā)明對目前的63K棉花SNP芯片上的63, 058個SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)只有21171個標記在 陸地棉中具有多態(tài)性，篩選效率僅為33. 57%。在水稻中，目前已經(jīng)開發(fā)出了用于水稻品種 鑒定的SNP芯片（中國專利CN104328507A)，然而該發(fā)明在開發(fā)過程中，盡管考慮了SNP標 記間的連鎖不平衡（LD)，但是并沒有分析具體的連鎖不平衡衰退距離。因為處于LD衰退距 離之內(nèi)的SNP標記往往表現(xiàn)出共分離，這些SNP標記在進行遺傳多樣性分析、指紋圖譜鑒定 時很容易給出錯誤的信息。
[0005] 因此，開發(fā)陸地棉基因組單拷貝SNP標記，并進一步對這些單拷貝SNP標記進行連 鎖不平衡分析，獲得適于陸地棉遺傳多樣性分析的SNP標記，對于陸地棉種質(zhì)資源遺傳分 析和發(fā)掘優(yōu)異基因資源具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供陸地棉SNP標記，能夠用于陸地棉遺傳多樣性 分析、群體結(jié)構(gòu)分析或種質(zhì)鑒定等，且分析效率高。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明通過利用芯片雜交和同源序列比對的方法開發(fā)出陸地棉基因組單拷貝SNP 標記，進一步通過連鎖不平衡分析剔除掉位于連鎖不平衡衰退距離內(nèi)的SNP標記，從而獲 得本發(fā)明陸地棉SNP標記。
[0009] 本發(fā)明所述陸地棉SNP標記所在染色體、SNP位點的物理位置以及核苷酸類型的 具體信息見說明書表2。本發(fā)明所述SNP標記的位點的物理位置是基于陸地棉（TM-1)基 因組測序序列確定的；其中，所述陸地棉（TM-1)基因組測序序列的版本號為：G〇SSypium_ hirsutumvl. 0〇
[0010] 利用本發(fā)明的SNP標記對120份陸地棉材料進行遺傳多樣性分析時，全部的4074 個SNP標記在120份材料間均檢測到多態(tài)性，檢測效率達到100%，平均每個SNP標記可以 檢測到2個等位基因，檢測到的等位基因頻率圍在0. 5~0. 95,平均為0. 75 ;檢測到的基因 多樣性范圍在0. 1~0. 5,平均為0. 34 ;檢測到的PIC值范圍為0. 09~0. 38,平均為0. 27。 聚類分析可以明顯地將這120份材料按照遺傳距離的遠近分成不同類群，群體結(jié)構(gòu)分析表 明這120份材料存在明顯的群體結(jié)構(gòu)。
[0011] 利用本發(fā)明的SNP標記對不同種質(zhì)材料進行指紋圖譜鑒定時，通過篩選針對不同 種質(zhì)材料鑒定的特征SNP基因型標記，可以實現(xiàn)利用1個SNP標記對特定種質(zhì)材料進行鑒 定的目的。具體的，所述SNP標記為i00326Gh、i03099Gh、i02807Gh、i03003Gh、i00827Gh、 i03528Gh、i04354Gh、i03143Gh、i00950Gh、i00546Gh、i01389Gh、i01439Gh、i01985Gh或 i03302Gh中的任意一種或多種。
[0012] 本發(fā)明進一步公開了用于檢測所述陸地棉SNP標記的引物對。根據(jù)本發(fā)明所述陸 地棉SNP位點對應(yīng)序列即可設(shè)計正向引物和反向引物。引物設(shè)計原則為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知。
[0013] 本發(fā)明所述的陸地棉SNP標記能夠應(yīng)用于陸地棉的遺傳多樣性分析或群體結(jié)構(gòu) 分析中，包括以下步驟：（1)提取待測陸地棉的基因組DNA; (2)利用檢測所述陸地棉SNP標 記的引物對，以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；（3) 對所述PCR擴增產(chǎn)物進行測序，獲得測序結(jié)果；(4)根據(jù)測序結(jié)果，確定待測陸地棉在所述 SNP標記的位點的基因型；然后利用相關(guān)軟件進行陸地棉的遺傳多樣性分析或群體結(jié)構(gòu)分 析。
[0014] 本發(fā)明所述的陸地棉SNP標記能夠應(yīng)用于陸地棉的種質(zhì)鑒定中，包括以下步驟： ⑴提取待測陸地棉的基因組DNA; (2)利用檢測所述陸地棉SNP標記的引物對，以步驟（1) 提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；（3)對所述PCR擴增產(chǎn)物進 行測序，獲得測序結(jié)果；(4)根據(jù)測序結(jié)果，確定待測陸地棉在所述SNP標記的基因型；（5) 如果待測陸地棉在所述SNP標記的基因型與本發(fā)明所述陸地棉SNP標記的基因型相同，則 鑒定為同一陸地棉品種；反之，則鑒定為不同陸地棉品種。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種陸地棉SNP芯片，包括：本發(fā)明所述的陸地棉SNP標記。本發(fā) 明所述的陸地棉SNP芯片能夠應(yīng)用于陸地棉的遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析或種質(zhì)鑒定 中。
[0016] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0017] 本發(fā)明開發(fā)出了陸地棉基因組單拷貝SNP標記，進一步通過連鎖不平衡分析剔除 掉位于連鎖不平衡衰退距離內(nèi)的SNP標記，從而獲得適于陸地棉遺傳多樣性分析、指紋鑒 定或群體結(jié)構(gòu)分析的SNP標記。本發(fā)明的SNP位點為單拷貝并且標記間不存在顯著的連鎖 不平衡，因此在進行雜交檢測、測序及PCR熒光擴增檢測時不會存在同源序列的干擾，同時 在進行遺傳多樣性分析、指紋鑒定和群體結(jié)構(gòu)分析時的檢測效率大大提高，工作效率更高。
【附圖說明】
[0018] 圖1為部分染色體上SNP標記的連鎖不平衡分布圖；其中，（A)、（B)、（C)、⑶分 別表示染色體LG13、LG16、LG22、LG25 ;圖中紅色部分為高度連鎖不平衡區(qū)域；
[0019] 圖2為是利用本發(fā)明的標記進行種質(zhì)材料聚類分析的NJTREE;
[0020] 圖3為是利用本發(fā)明的標記進行群體結(jié)構(gòu)分析的deltak的變化圖；
[0021] 圖4為是利用本發(fā)明的標記獲得的種質(zhì)群體的群體結(jié)構(gòu)。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0023] 實施例1陸地棉SNP標記的開發(fā)與應(yīng)用
[0024] 1、實驗方法
[0025] 1. 1供試材料
[0026] 選自120份陸地棉優(yōu)異種質(zhì)材料（表1)的嫩綠葉片，提取其總DNA。
[0027] 表1從嫩綠葉片提取其總DNA進行分析的棉花品系和材料
[0028]
[0029]
[0030]
[0031]
[0032] 1· 2總DNA提取方法
[0033]利用DNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTPlantGenomicDNAExtractionKit， CodeNo. 9768)提取各材料幼苗的DNA，DNA質(zhì)量要求為：DNA濃度大于50ng/ul;DNA樣品 體積大于20ul，DNA總量大于lug，DNA的吸光度260/280比值在1. 7-2. 0之間。
[0034] 1. 3芯片實驗
[0035] 使用illumina棉花全基因組SNP芯片（商業(yè)途徑獲得）對樣品進行SNP位點的 檢測，具體流程參考Infinium芯片實驗流程，芯片雜交實驗委托北京怡美通德科技發(fā)展有 限公司進行操作，使用illuminaGenomestudio(v2011)，Gentrain2. 0算法，自動聚類對樣 本進行分型。根據(jù)分型結(jié)果，篩選MAF&