利用熒光定量pcr技術(shù)鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于棉花育種領(lǐng)域，涉及鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法，具體地 說(shuō)，涉及利用熒光定量PCR技術(shù)鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的影響陸地棉品種最嚴(yán)重的病害之一，由于缺乏 有效的化學(xué)防治藥劑，只有依賴(lài)棉花品種抗性的提高來(lái)減少產(chǎn)量損失，因此棉花品種抗黃 萎病鑒定是培育抗黃萎病品種的必要手段。目前用于棉花品種黃萎病抗性鑒定方法主要有 兩大類(lèi)，一類(lèi)是田間鑒定方法，如自然病圃鑒定和人工病圃鑒定；一類(lèi)是室內(nèi)苗期鑒定方 法，如裸根蘸菌法、針刺接菌法、紙缽撕底法、無(wú)底塑缽菌液澆根法和毒素鑒定。
[0003] 田間鑒定方法中人工病圃鑒定被認(rèn)為是最接近自然實(shí)際，最為可靠的抗病鑒定方 法，在抗病育種過(guò)程中應(yīng)用最為普遍，但此鑒定方法受鑒定病圃限制，并易受氣候條件的影 響，一般需要2-3年重復(fù)鑒定才能出結(jié)果，歷時(shí)太長(zhǎng)。溫室病圃鑒定也需要半年左右的時(shí)間， 鑒定時(shí)間長(zhǎng)，不能做到早期診斷。
[0004] 室內(nèi)苗期鑒定方法目前應(yīng)用最多的主要有紙缽撕底法、無(wú)底塑缽菌液澆根法等， 但由于這些方法傷根程度很難做到統(tǒng)一，致使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤差（簡(jiǎn)桂良，2001.簡(jiǎn)桂良，孫文 姬，馬存.棉花黃萎病抗性鑒定新方法一無(wú)底塑缽菌液澆根法[J].棉花學(xué)報(bào)，2001，13(2): 67-69.)。而針刺接菌法使黃萎病菌強(qiáng)制侵入到棉株維管束系統(tǒng)，違背了病菌在自然條件下 的侵染規(guī)律，使棉花自身的部分防衛(wèi)系統(tǒng)失效，不能客觀反映鑒定材料的抗性(史認(rèn)輝.棉 花抗黃萎病鑒定技術(shù)研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010))。毒素鑒定法，需要提取粗 毒素，較繁瑣，且與上述方法相比，棉苗往往表現(xiàn)為發(fā)病偏重(杜威世，2003，杜威世.棉花黃 萎病抗性遺傳及分子標(biāo)記研究.[碩士學(xué)位論文〕.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，2003)。
[0005] 郭寶生等（郭寶生，王凱輝，劉素恩，趙存鵬，耿軍義，張香云，華金平.陸地棉抗黃 萎病種質(zhì)創(chuàng)新與抗病基因挖掘.棉花學(xué)報(bào)，2014，26(3): 252-259.)研究表明，陸地棉植株受 到黃萎病菌侵染后，植株內(nèi)部會(huì)形成物理障礙或生化障礙來(lái)遏制棉花黃萎病菌在體內(nèi)擴(kuò) 展，但是由于不同品種的抗病基因表達(dá)調(diào)控水平不一，從而出現(xiàn)抗病差異。與黃萎病抗性相 關(guān)基因主要有植物抗毒素合成相關(guān)基因、植株組織結(jié)構(gòu)防御蛋白相關(guān)基因等。這種黃萎病 菌侵染下不同陸地棉品種抗病相關(guān)基因的表達(dá)差異可以通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè) ((郭寶生，師恭曜，等，黃萎病菌侵染下棉花Dirigent-like蛋白基因表達(dá)差異分析.中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2014,47(22) :4349-4359.)。熒光定量PCR技術(shù)（Bustin S A，Benes V，Nolan T， Pfaffl M ff.Quantitative real-time RT-PCR-A perspective.Journal of Molecular Endocrinology，2005，34:597-601.)是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物 進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度 也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān) 測(cè)產(chǎn)物量的變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了避免上述田間和室內(nèi)苗期鑒定方法的缺陷，提供利用熒光 定量PCR技術(shù)鑒定陸地棉品種黃萎病抗性的基因及方法。本發(fā)明是在棉花品種幼苗6葉期， 利用與陸地棉受黃萎病菌侵染下2個(gè)抗性相關(guān)關(guān)鍵基因，即植物抗毒素合成相關(guān)基因類(lèi)一 多向耐毒性基因和植株組織結(jié)構(gòu)防御蛋白相關(guān)基因---lateral organ boundaries domain family protein轉(zhuǎn)錄子焚光定量的表達(dá)差異鑒定出陸地棉品種是否為抗黃萎病品 種。
[0007] 陸地棉品種抗黃萎病鑒定相關(guān)基因，其包括序列表中SEQ ID NO: 1所示的多向耐 毒性基因和SEQ ID N0:2所示的轉(zhuǎn)錄子基因。
[0008]陸地棉品種抗黃委病鑒定相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增特異引物，多向耐毒性基因的特異 引物上游序列見(jiàn)SEQ ID N0:3,下游序列見(jiàn)SEQ ID N0:4;轉(zhuǎn)錄子基因特異引物上游序列見(jiàn) SEQIDN0:5，下游序列見(jiàn)SEQIDN0:6。
[0009] 利用熒光定量PCR技術(shù)鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，該方法包括如下步驟:① 待測(cè)棉花品種營(yíng)養(yǎng)缽培養(yǎng)室育苗;②黃萎病病菌培養(yǎng);③病菌浸根接種:用步驟②培養(yǎng)的病 菌菌液對(duì)步驟①育成的幼苗進(jìn)行浸根接種;④總RNA提取:摘取步驟③中被病菌侵染過(guò)的幼 苗嫩片，提取葉片總RNA;⑤cDNA合成;⑥與陸地棉抗性相關(guān)關(guān)鍵基因即SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示基因，以及內(nèi)參基因 GhACTIN14的熒光定量PCR特異引物的合成；⑦熒光定量 PCR檢測(cè);⑧結(jié)果分析。
[0010] 步驟①所述的待測(cè)棉花品種營(yíng)養(yǎng)缽培養(yǎng)室育苗采用塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)紙質(zhì)營(yíng)養(yǎng)缽培 養(yǎng)室育苗，培養(yǎng)條件:平均溫度28 °C左右，每天保持光照14個(gè)小時(shí)。
[0011] 步驟③所述的病菌浸根接種，是指當(dāng)待測(cè)棉花品種幼苗長(zhǎng)至6葉期開(kāi)始進(jìn)行病菌 浸根接種，病菌孢子濃度為1〇6_1〇 8個(gè)/ml的孢子懸浮液。
[0012] 步驟④所述的總RNA提取，提取的是病菌接種侵染Oh和48h時(shí)的幼苗嫩片中的總 RNA；
[0013] 步驟⑤所述的cDNA合成反應(yīng)體系為步驟④中提取的總RNA 2ul，Anchored oligo (dT)18 primer(0.5ug/ul)lul,2 X TS Reaction Mix lOul,Transcript RT/R1 Enzyme Mix lul，gDNA Remover lul,Rnase-free water 5ul〇
[0014] 步驟⑥所述的與陸地棉抗性相關(guān)關(guān)鍵基因和內(nèi)參基因 GhACTIN14的的熒光定量 PCR特異引物的合成，合成引物GC含量50%，Tm在60°C_62°C，長(zhǎng)度18-22個(gè)核苷酸，擴(kuò)增片段 80-150bp;合成的多向耐毒性基因特異引物序列：上游序列AAGGCTGACGATAGGAGAAATG (SEQ ID N0:3)，下游序列GAAAGGTGGTGGAGCTATCTAAG(SEQ ID N0:4);合成的lateral organ boundaries domain family protein轉(zhuǎn)錄子基因特異引物序列：上游序列 AGCTATTCAAACCCACCATGT(SEQIDN0:5)，下游序列GGCTCTTCTGGTGGGAAATAG(SEQIDN0 : 6);內(nèi)參基因 GhACTINl4特異引物序列：上游序列CTTATGTTGCCCTGGACTATGA(SEQ ID N0:7)， 下游序列CGGAATCTCTCAGCTCCAATAG(SEQ ID N0:8)。
[0015] 步驟⑦所述的熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex Taq TM 10ul， 步驟⑥中合成的相應(yīng)被檢測(cè)基因的特異上游引物（lOpm/ul )0.4ul，下游引物（lOpm/ul) 0.4ul，R0X Reference Dye 0.4ul，滅菌蒸饋水7.8ul，cDNA SulaRT-PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95 °C，30s; 95 °C，5s，60 °C，34s，40 個(gè)循環(huán)。
[0016] 步驟⑧結(jié)果分析所依據(jù)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是，利用熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量 法，在接種黃萎病菌后48h多向耐毒性基因相對(duì)表達(dá)量倍值大于2和lateral organ boundaries domain family protein轉(zhuǎn)錄子相對(duì)表達(dá)量倍值小于1的判定為抗病品種;在 接種黃萎病菌后48h多向耐毒性基因相對(duì)表達(dá)量倍值小于1和lateral organ boundaries domain family protein轉(zhuǎn)錄子相對(duì)表達(dá)量倍值大于2的判定為感病品種。
[0017] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果：
[0018] (1)早期診斷。在陸地棉幼苗6葉期，即棉花播種育苗20天內(nèi)就可鑒定出其抗性。
[0019] (2)可靠、準(zhǔn)確。本發(fā)明從基因表達(dá)水平揭示陸地棉品種的抗病性，可靠性高；同時(shí) 針對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，提高了鑒定準(zhǔn)確度，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度達(dá)到100 %。
[0020] (3)簡(jiǎn)便易行。本發(fā)明所使用的關(guān)鍵基因熒光定量PCR特異引物由專(zhuān)業(yè)公司合成， 所用儀器設(shè)備為一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都具備，所用試劑亦為通用試劑，無(wú)需單獨(dú)配制， 按照本發(fā)明操作步驟，一般科研人員都能進(jìn)行陸地棉品種的抗性鑒定。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是育苗用的紙質(zhì)營(yíng)養(yǎng)缽和塑料周轉(zhuǎn)箱示意圖；圖中，①為塑料箱;②為營(yíng)養(yǎng)缽。 [0022]圖2是抗病品種冀79和感病種質(zhì)TM-1受黃萎病菌侵染0h_96h時(shí)的多向耐毒性基因 熒光定量相對(duì)表達(dá)量。
[0023] 圖3是抗病品種冀79和感病種質(zhì)TM-1受黃萎病菌侵染0h_96h時(shí)的lateral organ boundaries domain family protein轉(zhuǎn)錄子基因焚光定量相對(duì)表達(dá)量。
[0024] 圖4是冀228棉花品種受黃萎病菌侵染0h、96h時(shí)多向耐毒蛋白基因及l(fā)ateral organ boundaries domain family protein的焚光定量相對(duì)表達(dá)量。
[0025] 圖5是冀122棉花品種受黃萎病菌侵染0h、96h時(shí)多向耐毒蛋白基因及l(fā)ateral organ boundaries domain family protein的焚光定量相對(duì)表達(dá)量。
[0026] 圖6是冀1096棉花品種受黃萎病菌侵染0h、96h時(shí)多向耐毒蛋白基因及l(fā)ateral organ bou