鑒別新疆彩色棉系列1至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了鑒別新疆彩色棉系列1至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物，以及應用該特異性引物鑒別新疆彩色棉系列1至23號品種的方法，是使用權利要求1所述微衛(wèi)星標記特異性引物進行PCR擴增，將擴增結果進行電泳來進行鑒別的。本發(fā)明首次篩選到30個微衛(wèi)星標記引物，通過基因擴增及電泳分析，將新疆各彩色棉的特異、特征引物及組合引物指紋圖譜與數字信息相結合，提高了各品種與其他品種的鑒別能力，可有效為育種者提供品種知識產權及權益的保護。
【專利說明】鑒別新疆彩色棉系列1至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物及其應用。
【背景技術】
[0002]目前對棉花品種的真實性純度的鑒定依然采用品種形態(tài)特征鑒定，精度不高，速度慢，對操作人員經驗等要求高，不能適應育種工作迅速發(fā)展和種子生產經營及種植需要。目前，0嫩指紋技術發(fā)展日新月異，研究較多的有1^1^、狀?0、4?1^、551? (Simple SequenceRepeat，微衛(wèi)星DNA又叫簡單重復序列)等分子標記技術，其中SSR為共顯性分子標記，具有多態(tài)性豐富和PCR結果重現性高等優(yōu)點。與其它遺傳標記相比，SSR具有可直接檢測DNA分子結構變異、反映研究材料本質差異、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點，在遺傳多樣性分析、種質鑒定、DNA指紋圖譜構建、基因定位和分子標記育種等研究領域應用廣泛。
[0003]分子標記鑒定技術已經成功構建了油菜、玉米、甘蔗、水稻、小麥等作物品種的DNA指紋圖譜。棉花指紋圖譜構建的研究已有一些報道，但有關于新疆彩色棉品種指紋圖譜的構建未見報道。由于用于分子標記的引物目前還在不斷開發(fā)中且分子標記引物擴增到的等位基因數目會隨著建庫材料的增加而增加，在有限的建庫材料中進行指紋分析可能會引起引物多態(tài)性的降低，會出現一些特異的等位基因位點，但隨著建庫材料的增多在進行指紋分析時引物多態(tài)性可能會增高，特異或特征的基因位點就更加唯一。
[0004]特異引物是指:具有特異的等位基因位點，是該品種具有的唯一特有的等位基因位點，僅用這一對特異引物就可以直接、明顯區(qū)分本品種與其它品種。特征引物是指:某個品種I對引物的指紋信息就可以區(qū)分該品種與其它品種。
[0005]本發(fā)明利用SSR分子標記技術，對我國新疆自治區(qū)截至到2012年審定的23個彩色棉新品種進行DNA指紋圖譜分析，利用NTSYS-pcV2.10軟件，采用Jaccard系數計算23個新彩棉品種遺傳相似系數，遺傳相似系數變化范圍是0.3781-0.9298，平均為0.5511，表明，23個新彩棉品種間存在著豐富的遺傳多樣性，且各材料經嚴格自交純化。利用各材料的特異引物或特征引物或組合引物，以及18對核心引物的數字指紋代碼、可簡便、快速、準確地鑒別品種的純度及真實性，可為種子管理及經營單位提供快速、準確、科學的鑒定方法，為育種者保護了品種的知識產權和提供了育種理論指導。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供一種鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物，應用該特異性引物能準確的對新疆彩色棉系列I至23號品種進行區(qū)分。
[0007]本發(fā)明提供了鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物，其特征在于:
鑒別新彩棉I號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:BNL1317、CGR6410、DPL0296 ；鑒別新彩棉2號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:DPL0528、NAU3468 ；
鑒別新彩棉3號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:CGR6932、NAU2265 ；
鑒別新彩棉4號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:DPL0376、SHIN0376、NAU2437 ; 鑒別新彩棉5號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:CGR6932、TMB2295 ；
鑒別新彩棉6號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1233 ；
鑒別新彩棉7號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1362、NAU3995、DPL0917 ；
鑒別新彩棉8號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:MGHES44、BNL3261、BNL3255 ；
鑒別新彩棉9號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042 ；
鑒別新彩棉10號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:TMB2295 ；
鑒別新彩棉11號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1125 ；
鑒別新彩棉12號 品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:BNL1317、TMB2295、BNL1421 ；
鑒別新彩棉13號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932 ；
鑒別新彩棉14號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3110、NAU3995 ；
鑒別新彩棉15號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:TMB2295、NAU3110 ；
鑒別新彩棉16號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3995、CGR6410 ；
鑒別新彩棉17號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:DPL0296、BNL1317 ；
鑒別新彩棉18號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3468 ；
鑒別新彩棉19號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:BNL1421 ；
鑒別新彩棉20號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:HAU1001 ；
鑒別新彩棉21號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:GH132、MGHES44、TMB2295 ；
鑒別新彩棉22號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNLl 19、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296 ；
鑒別新彩棉23號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:NAU934、NAU2437。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供一種鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的方法，是使用權利要求1所述微衛(wèi)星標記特異性引物進行PCR擴增，將擴增結果進行電泳來進行鑒別的。
[0009]進一步地，所述PCR擴增的條件為:
94°C3min ；
94 °C50sec,
(53 ~63) °C 45sec,
72 °Clmin, 35 個循環(huán)；
72 °CIOmin ；
4 °CIOmin0
[0010]進一步地，所述鑒別分為應用組合引物和應用特異性引物或特征引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別兩種；
其中，所述應用組合引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別的具體方法是:按照組合引物中的先后順序對新疆彩色棉系列I至23號品種DNA進行PCR擴增、電泳，對電泳結果進行分析，最終鑒別得到相對應的新疆彩色棉系列品種；
所述應用特異性引物或特征引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別的具體方法是:應用特異性引物或特征引物對新疆彩色棉系列I至23號品種DNA進行PCR擴增、電泳，對電泳結果進行分析，找出電泳條帶與其他電泳條帶位置不同的，即為相對應的新疆彩色棉品種。
[0011]本發(fā)明的第三個目的是提供新疆彩色棉系列I至23號品種的18對核心引物的十進制數字指紋代碼，其中，
所述 18 對核心引物為:NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44,
所述新疆彩色棉系列I至23號品種在所述18對核心引物下的十進制數字指紋代碼分別依次為:
【權利要求】
1.鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物，其特征在于: 鑒別新彩棉1號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:BNL1317、CGR6410、DPL0296 ； 鑒別新彩棉2號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:DPL0528、NAU3468 ； 鑒別新彩棉3號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:CGR6932、NAU2265 ； 鑒別新彩棉4號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:DPL0376、SHIN0376、NAU2437 ; 鑒別新彩棉5號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:CGR6932、TMB2295 ； 鑒別新彩棉6號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1233 ； 鑒別新彩棉7號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1362、NAU3995、DPL0917 ； 鑒別新彩棉8號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:MGHES44、BNL3261、BNL3255 ； 鑒別新彩棉9號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042 ； 鑒別新彩棉10號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:TMB2295 ； 鑒別新彩棉11號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU1125 ； 鑒別新彩棉12號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:BNL1317、TMB2295、BNL1421 ； 鑒別新彩棉13號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932 ； 鑒別新彩棉14號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3110、NAU3995 ； 鑒別新彩棉15號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:TMB2295、NAU3110 ； 鑒別新彩棉16號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3995、CGR6410 ； 鑒別新彩棉17號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:DPL0296、BNL1317 ； 鑒別新彩棉18號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3468 ； 鑒別新彩棉19號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:BNL1421 ； 鑒別新彩棉20號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:HAU1001 ； 鑒別新彩棉21號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:GH132、MGHES44、TMB2295 ； 鑒別新彩棉22號品種的微衛(wèi)星標記特異性引物為:NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNLl 19、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296 ； 鑒別新彩棉23號品種的微衛(wèi)星標記組合引物為:NAU934、NAU2437。
2.一種鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種的方法，其特征在于:是使用權利要求1所述微衛(wèi)星標記特異性引物進行PCR擴增，將擴增結果進行電泳來進行鑒別的。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增的條件為: 94°C3min ； 94 °C50sec, (53 ~63) °C 45sec, 72 °Clmin, 35 個循環(huán)； 72 °C10min ； 4 °C10min0
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述鑒別分為應用組合引物和應用特異性引物或特征引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別兩種； 其中，所述應用組合引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別的具體方法是:按照組合引物中的先后順序對新疆彩色棉系列I至23號品種DNA進行PCR擴增、電泳，對電泳結果進行分析，最終鑒別得到相對應的新疆彩色棉系列品種； 所述應用特異性引物或特征引物進行PCR擴增、電泳后對結果進行鑒別的具體方法是:應用特異性引物或特征引物對新疆彩色棉系列I至23號品種DNA進行PCR擴增、電泳，對電泳結果進行分析，找出電泳條帶與其他電泳條帶位置不同的，即為相對應的新疆彩色棉品種。
5.新疆彩色棉系列I至23號品種的18對核心引物的十進制數字指紋代碼，其特征在于: 所述 18 對核心引物為:NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44, 所述新疆彩色棉系列I至23號品種在所述18對核心引物下的十進制數字指紋代碼分別依次為:
6.權利要求1所述的微衛(wèi)星標記特異性引物在鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種中的應用。
7.權利要求5所述的十進制數字指紋代碼在鑒別新疆彩色棉系列I至23號品種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103614456SQ201310391563
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權日:2013年9月2日
【發(fā)明者】尤春源, 聶新輝, 林忠旭, 秦江鴻, 趙圖強, 雷江榮, 馮國禮, 呂軍 申請人:石河子農業(yè)科技開發(fā)研究中心