菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因及其編碼蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供一種菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT?SERPIN基因及其編碼蛋白。該菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT?SERPIN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述蛋白去除信號肽前體后得到的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明通過基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序方法，得到CvT?SERPIN的cDNA核苷酸序列后，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達蛋白，利用His?tag能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量的可溶性CvT?SERPIN重組蛋白，為進行CvT?SERPIN的活性實驗提供了便利。
【專利說明】
菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因及其編碼 蛋白
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及到從菜蛾盤絨繭蜂cDNA文庫中克隆 得到絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因全長cDNA序列，并對其基因編碼區(qū)除去信號肽進 行體外重組表達，也涉及到該重組蛋白的分離純化及其對彈性蛋白酶、糜蛋白酶和凝血酶 的抑制作用，以及對金黃色葡球菌萄和枯草芽孢桿菌有抑制作用，同時還涉及該重組蛋白 獲得方法作為蛋白酶抑制劑類藥物開發(fā)和獲得的重組蛋白作為抗菌劑在食品防腐或飼料 添加劑生產(chǎn)等方面的潛在應(yīng)用價值。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine proteinase inhibitor,SERPIN)是一類分布廣泛 于植物、動物、微生物等中，已知的最大的蛋白酶抑制劑類超家族。1980年，Hunt and Dayhoff 指出 了雞卵清蛋白 ovalbumin (OVA)、人類抗凝血酶 antithrombin III (AT-III)和 人類a 1-蛋白酶抑制劑a 1-protease inhibitor (a 1-PI)三個蛋白一級結(jié)構(gòu)的序列相似性。 由于這個超家族的大部分是絲氨酸蛋白酶抑制劑，1985年，Carrell就確定了SERPIN的簡 寫。目前，人類、模式昆蟲果蠅等中關(guān)于SERPIN的結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)有很多。絲氨酸蛋 白酶抑制劑通常是具有350~500個氨基酸的單鏈蛋白，一般有3個f3-sheets和8~9個〇-helices，含有一個反應(yīng)中心環(huán)RCL(reactive center loop)，RCL上的P1氨基酸與革E1酶的活 性絲氨酸間形成共價鍵，P1通常決定了抑制蛋白酶的特異性。抑制性的SERPIN使用獨特的 自殺底物機理，與靶酶反應(yīng)，構(gòu)象發(fā)生改變，與靶酶形成極為穩(wěn)定的共價復(fù)合物，靶酶活性 被不可逆抑制。SERPIN在人體中參與調(diào)控許多生理過程比如血液凝結(jié)、補體激活、炎癥反 應(yīng)、荷爾蒙轉(zhuǎn)運和腫瘤抑制等。一旦SERPIN出現(xiàn)功能缺陷等異常變化，人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)不能 維持將會導(dǎo)致許多疾病。SERPIN在昆蟲體內(nèi)調(diào)節(jié)昆蟲免疫系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，比如酚氧化酶激 活系統(tǒng)和toll信號通路等，同時也調(diào)控果蠅胚胎的發(fā)育。
[0003] 菜蛾盤絨苗蜂(Cotesia vestalis)是防治小菜蛾(Plutella xylostella)的主要 優(yōu)勢寄生性天敵，畸形細胞(Teratocytes)是菜蛾盤絨繭蜂卵在寄主體內(nèi)發(fā)育過程中由蜂 卵的漿膜層解離下來的一種特殊細胞?；渭毎軌蚍置谝恍┕δ艿鞍?，其中也包括一些 胞外絲氨酸蛋白酶抑制劑。目前，沒有菜蛾盤絨繭蜂來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑的相關(guān)報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋 白酶抑制劑CvT-SERPIN基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的也在于提供CvT-SERPIN重組蛋白 的獲得方法，本發(fā)明目的還在于CvT-SERPIN重組蛋白的獲得方法作為蛋白酶抑制劑類藥物 開發(fā)和獲得的重組蛋白作為抑菌劑在食品或飼料添加劑生產(chǎn)等方面的潛在應(yīng)用價值。
[0005] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0006] 提供一種菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因，該基因的核苷酸序 列如SEQ ID N0.1所示。
[0007] 本發(fā)明進一步提供了所述基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 [0008]本發(fā)明進一步提供了蛋白制得的菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN 重組蛋白，是將所述蛋白去除信號肽前體后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了所述重組蛋白的制備方法，包括:去除信號肽的序列用于構(gòu) 建原核表達載體，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag純化重組蛋白。
[0010] 本發(fā)明進一步提供了所述重組蛋白在制備抑制糜蛋白酶、凝血酶和彈性蛋白酶活 性的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明進一步提供了所述重組蛋白作為抑菌劑在制備食品防腐劑或飼料添加劑 中的應(yīng)用。
[0012] 發(fā)明原理描述：
[0013]本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的全長是1405bp， 開放閱讀框是1239bp，編碼412aa，其中l(wèi)-25aa是信號肽序列，CvT-SERPIN包含有絲氨酸蛋 白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有RCL(reactive center loop)，RCL上的P1氨基酸是蛋氨 酸(Met)，與人類al-蛋白酶抑制劑(a 1-protease inhibitor，al-PI)的P1氨基酸相同，a 1-PI能夠抑制中性粒細胞彈性蛋白酶。
[0014]本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因cDNA的克隆方法： 以菜蛾盤絨繭蜂總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫，測序獲得菜蛾盤絨繭蜂轉(zhuǎn)錄 組，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找出編碼SERPIN的EST序列，然后經(jīng)RACE方法擴增得到末端序列，最后 經(jīng)序列拼接獲得菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因cDNA全長序列。
[0015]本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因重組蛋白表達方 法如下：將去除信號肽的CvT-SERPIN基因編碼序列，連接到表達載體，獲得重組表達質(zhì)粒， 利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)表達，用HisTALONTM重力柱純化上清表達的重組蛋白，然 后使用超濾管進行去離子濃縮得到重組蛋白。
[0016]本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因體外原核表達獲 得的重組蛋白能夠抑制牛胰腺糜蛋白酶，凝血酶和豬胰腺彈性蛋白酶的活性，同時測不 同菌的生長曲線，結(jié)果表明CvT-SERPIN能夠抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長。 [0017]本發(fā)明所提供的菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN的基因及其氨基 酸序列和其重組蛋白的獲得方法，CvT-SERPIN基因或者蛋白或獲得重組蛋白的方法可以用 在藥物開發(fā)和飼料添加劑生產(chǎn)等方面。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明通過基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序方法，以菜蛾盤絨繭蜂為實驗材料，通過基因 注釋，篩選其表達的絲氨酸蛋白酶的EST序列標簽，并通過RACE方法得到CvT-SERPIN的cDNA 全長序列。得到CvT-SERPIN的cDNA核苷酸序列后，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達蛋 白，利用His-tag能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量的可溶性CvT-SERPIN重組蛋白，為進行CvT-SERPIN的活性實驗提供了便利。
【附圖說明】
[0020]圖1:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN的基因驗證；
[0021]圖2:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因原核誘導(dǎo)表達和純化的 蛋白電泳圖，其中1，沒有加IPTG誘導(dǎo)結(jié)果；2，加入終濃度0.2mM的IPTG誘導(dǎo)結(jié)果；3，超聲破 碎可溶性蛋白點樣；4，超聲破碎后包涵體蛋白點樣；5，純化濃縮后的蛋白樣品；M，蛋白 Marker；
[0022]圖3:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN的基因序列和氨基酸序列分 析，其中黑色加粗字體標注信號肽序列；下劃線標注CvT-SERPIN的反應(yīng)中心位點(reactive center site,RCL);黑色加粗斜體表示多腺苷酸化信號;P1位點的氨基酸是蛋氨酸(Met); [0023]圖4:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因原核表達獲得的重組蛋 白對牛胰腺糜蛋白酶、凝血酶、豬胰腺彈性蛋白酶和胰蛋白酶的抑制效果；
[0024]圖5:測定加入CvT-SERPIN重組蛋白的情況下，金黃色葡萄球菌的生長曲線，其中 Amp濃度為0 ? lmg/ml，TBS為0 ? 01M, CvT-SERPIN濃度為3 ? 5mg/ml;
[0025]圖6:測定加入CvT-SERPIN重組蛋白的情況下，枯草芽孢桿菌的生長曲線，其中Amp 濃度為〇 ? lmg/ml，TBS為0 ? 01M, CvT-SERPIN濃度為3 ? 5mg/ml。 具體實施方案
[0026]為進一步解釋說明本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步詳細說 明，實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0027]實施案例1:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的cDNA克隆
[0028] l.lTRIzol 法提取總 RNA
[0029] 1)將一定量（5只左右菜蛾盤絨繭蜂）冰凍lmin，放入1.5ml離心管中，加入lml TRIzol試劑，充分研磨勾衆(zhòng)，室溫靜置5min，加入lml Trizol，混勾，室溫靜置5min
[0030] 2)向離心管中加入0.2ml氯仿，振蕩15s，混合液轉(zhuǎn)入TIANGEN離心管中，靜置2min。
[0031] 3)4°C，12000g離心15min，取上清液，將其轉(zhuǎn)入一新1.5ml的離心管中。
[0032] 4)向離心管中加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置lOmin。
[0033] 5)4°C，12000g 離心 lOmin，棄掉上清液。
[0034] 6)向離心管中加入lml 75 %乙醇，輕輕洗滌沉淀，4°C，7500g離心5min，棄掉上清 液。（此時加入無水乙醇，可于_80°C超低溫冰箱中長期保存）
[0035] 7)晾干離心管，加入適量的DEPC H20溶解（65°C促溶），分光光度計測量0D260/ 0D280的值，比值在1.8~2.0之間時，進行下一步實驗。
[0036] 1 ? 2cDNA 第一鏈合成
[0037] (1)往0.5ml無菌的離心管中分別加入lyl提取的RNA，lyl SMARTIV/5'PCR正向引 物，lyl CDSm/3'PCR反向引物，加2yl DEPC H20使總體積達到5yl。
[0038] (2)混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C孵育2min。
[0039] (3)迅速將離心管冰浴2min，短暫離心。
[0040] (4)往離心管中分別加入2ul 5XFrist_strand Buffer，liil 20mM二硫蘇糖醇 (DTT)，lyl 10mM dNTP，liil Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶，反復(fù)吹打混勾，短暫離心。 [0041 ] (5)42。(：孵育lh。
[0042] (6)將離心管置于冰上2~3min，終止反應(yīng)。取一部分用于進一步實驗，其余于-80 °(:超低溫冰箱冷凍保存。
[0043] 1.3dsDNA 合成
[0044] (1)往0.5離心管中分別加入lyl第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物，5yl 10XLA Buffer(Mg2+ free)，5yl Mg2+，8yl dNTP，lyl SMARTIV/5'PCR正向引物，lylCDSm/3'PCR反向引物，0.5y 1 LA Tag DNA聚合酶，29.5yl ddH20,充分混勻，短暫離心。
[0045] (2)PCR 儀中按以下擴增程序(95°C，20s;25 ~28X(95°C，5s;68°C，6min))擴增。
[0046] (3)取5yl PCR產(chǎn)物用于凝膠檢測(檢測條帶所含分子量范圍及條帶亮暗），取檢測 結(jié)果良好的lyl產(chǎn)物稀釋100倍用于做以后PCR的模板，其余于_80°C超低溫冰箱冷凍保存。 [0047] 1.4用RACE的方法擴增菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的5 '和 3'末端
[0048]按Clontech公司試劑盒SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit說明書進行。根 據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已知的CvT-SERPIN基因EST序列分別設(shè)計兩條上、下游特異性引物， 以進行巢式PCR。所用引物分別為:第一次PCR反應(yīng)條件為:95°C，3min; 30 X (95°C，25s; 58 °C，20s;72°C，lmin) ;72°C，6min。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，反應(yīng)條件 為：95 °C，3min; 35 X (95 °C，25s; 60 °C，20s; 72 °C，lmin); 72 °C，6min。將擴增產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上得到重組質(zhì)粒，并用pMD-19T的通用引物M13土進行序列測定，測定結(jié)果與已知序 列片段進行比較和序列拼接。序列拼接結(jié)果在NCBI上進行BlastX，結(jié)果顯示該基因具有一 個保守的SERPIN結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域中包含一個RCL(reactive center loop)。
[0049]實施例2:菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的蛋白原核誘導(dǎo)表 達和純化
[0050] 2.1構(gòu)建CvT-SERPIN的重組表達載體
[00511 (1)根據(jù)獲得的CvT-SERPIN序列的全長設(shè)計引物，正反向引物分別還有BamH I和 Xho I酶切位點，擴增基因開放閱讀框，去除信號肽，以cDNA為模板，用50u 1的LA-taq酶體系 做PCR擴增，將擴增的帶有酶切位點的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶進行DNA 凝膠回收。
[0052] (2)分別以PET-28a表達載體質(zhì)粒和第一步回收的DNA作為DNA模板，配制雙酶切體 系50ul:限制性內(nèi)切酶BamH I 2.5ul，限制性內(nèi)切酶Xho I 2.5ul，DNA模板或者表達載體質(zhì) 類20ul，酶切buffer 5ul，ddH20 20ul。輕輕混勻，短暫離心，37°C酶切20min，然后80°C、 5min，停止酶切。
[0053] (3)用第二步雙酶切的反應(yīng)產(chǎn)物跑回收膠，切下目的DNA條帶，進行DNA凝膠回收 [0054] (4)雙酶切的表達載體和目的片段連接，連接體系為20ul，分別加入5ul的雙酶切 后目的片段DNA，2ul雙酶切后的表達載體質(zhì)粒，lul的T4Ligase，2ul的T41igase buffer， 10ul ddH20,4°C條件下，連接過夜。
[0055] (5)將連接過夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)中，涂在含有抗生素卡那的LB培養(yǎng)基平板上， 37°C培養(yǎng)過夜。挑菌斑搖菌，以通用引物T7Promoter引物和T7Terminator引物進行rTaq的 菌液檢測PCR反應(yīng)體系，對于陽性樣品每份取200ul保存，其余送測序
[0056] (6)對測序結(jié)果進行比對，選取正確的保存菌液進行下一步的實驗。
[0057] 2.2菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的蛋白誘導(dǎo)表達
[0058] (1)在15ml的無菌三角瓶中加入5ml含有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基，然后加入50ul 的含有正確重組質(zhì)粒的菌液。在37°C，180rpm的搖床中培養(yǎng)過夜，接著取5ml，回收重組質(zhì) 粒。
[0059] (2)取5ul的回收的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DE3(BL21)感受態(tài)菌株中，涂布于含有卡那抗 性的LB培養(yǎng)基平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。挑斑培養(yǎng)菌液至對數(shù)期，以通用引物T7Promo ter引物 和T7Terminator引物進行rTaq菌液檢測PCR反應(yīng)體系，選取其中一份陽性樣品，取50ul菌夜 加入到裝有50ml含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基的150ml無菌三角瓶中，37°C，250rmp的搖 床中培養(yǎng)對數(shù)期，大約0D = 0.6~0.8。
[0060] (3)取6支15ml的滅菌后的試管，每管加入5ml加入培養(yǎng)到對數(shù)期的菌液，并分別加 入Oul，10ul，20ul，30ul，40ul，50ul 100mM IPTG，使六支試管菌液中的IPTG的終濃度分別 為 0禮，0.2111]\1，0.411亂0.6111]\1，0.8111]\1，1.01111;將試管至于22°(：，210印111的搖床中培養(yǎng)過夜，以 誘導(dǎo)蛋白表達
[0061 ] (4)用12 %的SDS-PAGE電泳分析(3)誘導(dǎo)表達的蛋白情況，誘導(dǎo)表達的菌液各吸取 lml到2ml的離心管中，12000g離心5min后，去除上清，分別加入60ul的PBS吹打均勻，然后加 入15ul的5x的蛋白上樣緩沖液，混勾，接著沸水中煮lOmin, 16000g離心后，取上清，即為分 析樣品。用微量加液器分別吸取5ul以上分析樣品加入點樣孔中，其中一個空加入蛋白 Marker，作為參照。先60V恒壓電泳，待樣品濃縮膠部分濃縮成一條線后，再調(diào)電壓到120V， 待溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳;取出凝膠，置于考馬斯亮藍R-250染色液中，置 于水平搖床上，染色30mi;然后脫色液脫色，期間換脫色液2~3次，直至背景干凈透明，條帶 清晰。用Bio-Rad GS_800Calibrated Densitometer凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果并掃描拍 照。
[0062] (5)根據(jù)(4)的成像結(jié)果，選取特異性條帶最粗的誘導(dǎo)條件，此IPTG濃度作為最優(yōu) IPTG濃度，作為下一次的擴大培養(yǎng)條件，并將這個條件下的剩余菌液，取2ml，離心去上清； 用200ul BugBuster Master Mix裂解，離心取上清，沉淀加200ul的PBS混勾，然后加入蛋白 上樣緩沖液，沸水中l(wèi)〇min，最后跑12%的SDS-PAGE蛋白膠，檢測蛋白是可溶性表達還是包 涵體表達。如上清中有表達，然后擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達用于純化重組蛋白。誘導(dǎo)方法參 見步驟(2 )、（ 3 )，但只使用最優(yōu)IPTG濃度，用300ml的錐形瓶加入200ml對數(shù)期的菌液，進行 誘導(dǎo)。
[0063] 2.3菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑0!'-5￡1^預(yù)基因的誘導(dǎo)表達蛋白的純化
[0064] (1)按照HisTALON? Gravity Columns Purification Kit(Clontech，USA)中的說 明書對誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)進行蛋白純化。具體步驟參照試劑盒中的說明書進行。 純化蛋白用12 %的SDS-PAGE檢測結(jié)果。
[0065] (2)采用截留分子量為10kDa的超濾管AmiC〇n?Ultra-4對重組蛋白進行濃縮，脫 鹽。第一次使用的超濾管是干燥的，在使用前要進行預(yù)冷，加入過膜的ddH 20,冰浴或者冰箱 里預(yù)冷幾分鐘，倒掉水后，加入（1)純化的蛋白樣品。以4000g的轉(zhuǎn)速進行離心，當濃縮到剩 余l(xiāng)ml時，加入0.01M TBS(PH = 8.0)，進行緩沖液的置換，這個步驟重復(fù)至少4次，最后一次 濃度的終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上進行。取出蛋 白濃縮液用Bradford方法定量，存于液氮中，后續(xù)使用。
[0066]實施案例3.菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的原核表達重組 蛋白的活性檢測
[0067] 3.1菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因的原核表達重組蛋白對商 業(yè)化的絲氨酸蛋白酶的抑制活性
[0068] 本實驗檢測的蛋白酶分別為牛胰腺糜蛋白酶（b 〇 v i n e p a n c r e a t i c a -chymotrypsin,Sigma)，牛膜蛋白酶（bovine pancreatic trypsin，Sigma)，豬膜腺彈性蛋 白酉每（porcine pancreatic elastase，Sigma)和人血衆(zhòng)凝血酉每（thrombin from human plasma，Sigma)，其對應(yīng)的底物分別是N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (sigma S-7388)，Na-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(sigma B-3133) ,N-Succinyl-Ala-Ala-Pr〇-Leu p-nitroanilide (sigma S-8511)和?^-^-!^}^)-Gly-Pro-Arg p-nitroanilide acetate salt(sigma T1637)。
[0069] 實驗方法如下：不同體積的CvT-SERPIN(3.5mg/ml)的重組蛋白，分別為Oul，2ul， 4ul，6ul，8ul，10ul，12ul，分別于以上10ul蛋白酶（lug/ul)，然后每個反應(yīng)用0.01Tris-HCl (PH = 8.0)含有0.1M NaCl和ImM CaC12的緩沖液調(diào)節(jié)到總體積45ul，在30°C下反應(yīng)lOmin; 然后加入5ul對應(yīng)酶特異性顯色底物，至顯色底物的終濃度為ImM，在30°C條件下，再反應(yīng) 10min;測量0D41Q表示p-ni troani 1 ine產(chǎn)物的增長作為剩余酶活;每個反應(yīng)重復(fù)三次，繪制 CvT-SERPIN重組蛋白濃度依賴型的剩余酶活曲線。
[0070]試驗結(jié)果顯示:不同體積的菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因原 核表達獲得的重組蛋白（3.5mg/ml)與10ul(lmg/ml)的不同蛋白酶反應(yīng)，隨著加入的重組蛋 白的量的增加，糜蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的剩余酶活減少，但是胰蛋白酶的剩余酶活 不受影響。當重組蛋白的體積達到12ul時，對糜蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的抑制效果分 別達到78.51%、31.83%、36.63%。結(jié)果表明，該重組蛋白對糜蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血 酶具有一定的抑制效果，但是對胰蛋白酶沒有抑制作用；因此，該重組蛋白具有作為蛋白酶 抑制劑類藥物的潛在應(yīng)用價值。
[0071] 3.2菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因原核表達獲得的重組蛋白 對微生物的生長抑制
[0072] 本發(fā)明涉及供試菌株有革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌。其中革蘭氏陽性菌為金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，革蘭氏陰性 菌為大腸桿菌(Escherichia coli);
[0073] 將供試菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，大約0D6Q() = 0.6~0.8,然后分別將處于生長對數(shù)期的 供試菌株用MH培養(yǎng)基稀釋至0D6Q() = 0 ? 001;取80ul的稀釋菌液和20ul的CvT-SERPIN( 3 ? 5mg/ ml)重組蛋白混勻，在96孔板中，37°C條件下，每隔10min測一次各管的吸光度，共測12h。其 中Amp(0. lmg/ml)作為陽性對照，TBS(0.01M，PH=8)作為陰性對照。以上處理重復(fù)3次。 [0074]實驗結(jié)果顯示:供試菌株中加入20ul (3.5mg/ml)的菜蛾盤絨苗蜂絲氨酸蛋白酶抑 制劑基CvT-SERPIN基因原核表達獲得的重組蛋白，與陰性對照相比，金黃色葡萄球菌和枯 草芽孢桿菌的生長狀況都發(fā)生顯著的變化。該重組蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制劑效果在 630min的時候達到最大值59.96%，對枯草芽孢桿菌的抑制劑效果在67〇1^11時達到最大值 55.38%。結(jié)果表明，該重組蛋白對革蘭氏陽性菌的生長具有抑制作用；因此，該重組蛋白具 有作為抑菌劑在食品或者飼料添加劑生產(chǎn)上應(yīng)用的潛在價值。
【主權(quán)項】
1. 菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN基因，其特征在于，該基因的核苷酸 序列如SEQ ID N0.1所示。2. 由權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 由權(quán)利要求2所述蛋白制得的菜蛾盤絨繭蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑CvT-SERPIN重組蛋 白，其特征在于，是將所述蛋白去除信號肽前體后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所 不。4. 權(quán)利要求3所述重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括:去除信號肽的序列用于構(gòu) 建原核表達載體，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag純化重組蛋白。5. 權(quán)利要求3所述重組蛋白在制備抑制糜蛋白酶、凝血酶和彈性蛋白酶活性的藥物中 的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求3所述重組蛋白作為抑菌劑在制備食品防腐劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/81GK105821050SQ201610290698
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】陳學(xué)新, 谷啟娟, 時敏, 楊健
【申請人】浙江大學(xué)