一種以棉花幼胚為受體接種trv病毒誘導(dǎo)基因沉默方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以棉花幼胚為受體接種trv病毒誘導(dǎo)內(nèi)源基因沉默的方法，屬于 植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 陸地棉全基因組測序已完成，產(chǎn)生海量DNA序列信息，深入研究這些序列的功能尤 為迫切。傳統(tǒng)的基因功能研究手段主要以遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，但棉花的轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化過程 繁瑣且對受體基因型的依賴性較強，嚴重限制棉花功能基因組研究的發(fā)展。
[0003] 病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一種快速、高效、 高通量的反向遺傳學(xué)技術(shù)，其原理是利用重組病毒抑制植物內(nèi)源基因的表達，通過表型及 生理數(shù)據(jù)的分析鑒定基因功能。VIGS技術(shù)克服傳統(tǒng)研究方法需要依賴遺傳轉(zhuǎn)化的局限性， 近幾年在棉花基因功能研究中得到廣泛應(yīng)用。其中，煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV)載體是棉花中應(yīng)用最為廣泛VIGS載體。雖然VIGS沉默起效快、效率高，但該技術(shù) 在具體實驗操作中的不足之處亦很明顯，如接種病毒的方式多利用注射器滲透子葉或摩擦 破壞葉表皮接種，對棉苗造成損傷;接種時間一般在子葉完全平展后，因此，不能用來研究 發(fā)育較早期的基因功能;接種病毒時所需農(nóng)桿菌侵染液制備量大，實驗成本高;接種過程耗 時長等。對VIGS技術(shù)體系中的不足之處進行改良，可使該技術(shù)在棉花基因功能研究中發(fā)揮 更大作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無損傷、沉默時間更早、成本更低、操作更 簡便的轉(zhuǎn)化方法，即以棉花幼胚為受體的TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法。
[0005] -種以棉花幼胚為受體的TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法，步驟如下：
[0006] (1)將目的基因插入TRV病毒載體中，制備重組載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得轉(zhuǎn)化后 的農(nóng)桿菌；
[0007] (2)取棉花種子，經(jīng)脫絨、滅菌后，經(jīng)萌發(fā)后去除萌發(fā)種子的內(nèi)、外皮，幼胚放入含 有2.5~3.5mg/L GA3(赤霉素）的MS液體培養(yǎng)基中，25~30°C，120rpm/min暗培養(yǎng)6~10h，制 得待侵染胚；
[0008] (3)培養(yǎng)步驟（1)制得的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，制得農(nóng)桿菌侵染液，然后加入農(nóng)桿菌侵 染液質(zhì)量百分比0.15~0.25%的表面活性劑，制得侵染液，將步驟(2)制得的待侵染胚浸入 侵染液中，22~28°C，100~150rpm/min，暗培養(yǎng)20~40分鐘，去除多余侵染液，經(jīng)共培養(yǎng)后， 栽種到滅菌的營養(yǎng)土中，進行營養(yǎng)土培養(yǎng)，即可。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的目的基因為棉花GhCLAl基因，核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的重組載體，為將目的基因用限制性內(nèi)切酶 EcoRI和ΚρηΙ雙酶切后，連接入同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Κρη頂每切后的TRV病毒載體中。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的轉(zhuǎn)化為凍融法轉(zhuǎn)化。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的病毒載體TRV載體系統(tǒng)，包含TRV1和TRV2載 體;農(nóng)桿菌為GV3101。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中脫絨為采用濃硫酸脫絨，滅菌為采用質(zhì)量濃度 為15 %的雙氧水浸泡0.5~1.5h，然后用大量的無菌水沖洗。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中萌發(fā)為在滅菌水中25~30 °C浸泡15~18h。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中農(nóng)桿菌侵染液的制備步驟如下：
[0016] 將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg//L慶大霉素、50mg//L利福平 的LB固體培養(yǎng)基上，25~30°C暗培養(yǎng)2~3天;挑取單克隆接入含有相同濃度抗生素的LB液 體培養(yǎng)基中，25~30°C振蕩過夜培養(yǎng)，制得液體培養(yǎng)物；
[0017] 取lmL液體培養(yǎng)物擴繁至100mL含有上述相同濃度抗生素且附加了 10mM的MES和20 μΜ乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，25~30°C過夜培養(yǎng);25°C，4500rpm離心菌體，將菌體重懸 在含有10mM MgCl2，10mM MES(2-(N-嗎啉）乙磺酸），200μΜ AS(乙酰丁香酮）的MS液體培養(yǎng) 基中，調(diào)整〇D6Q() = 1.5，22~28°C，暗處理2.5~3h，制得農(nóng)桿菌侵染液。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中表面活性劑為Silwet L-77。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中共培養(yǎng)為在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中于22~28 °C暗培 養(yǎng)2~3天;共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基；
[0020] 進一步優(yōu)選的，所述含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基為將200μΜ乙酰丁香酮 的MS液體培養(yǎng)基浸潤4~7層濾紙制得。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中營養(yǎng)土培養(yǎng)為將生根后的幼苗在22~25°C， 14h光照/10h黑暗的條件下，與營養(yǎng)土中培養(yǎng)，即可。
[0022] 上述MS液體培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0023] NH4NO3 1650mg、KN03 1900mg、KH2P〇4 170mg、CaCl2 · 2H20 440mg、MgS〇4 · 7H20 440mg、FeS〇4*7H20 27.85mg、Na2-EDTA 37.25mg、MnS〇4*4H20 22.3mg、ZnS〇4*7H20 8.6mg、H3B〇3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2Mo〇4*2H2〇 0.25mg、CuS〇4*5H2〇 0.025mg、CoCl2*6H2〇 0.02511^、肌醇10〇11^、鹽酸硫胺素(￥131)1〇11^、鹽酸吡咳醇(￥136)111^、煙酸111^。
[0024] LB固體培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0025] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl 10g、10g/L瓊脂粉，pH = 7.0;高壓蒸汽滅菌 20min〇
[0026] LB液體培養(yǎng)基，每升組分如下：
[0027] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl 10g，pH=7.0;高壓蒸汽滅菌20min。
[0028] 有益效果
[0029] 1、本發(fā)明首次以棉花幼胚作為受體接種TRV病毒，誘導(dǎo)基因沉默;該方法不對幼胚 進行破壞性處理，不產(chǎn)生任何損傷，克服了接種病毒時對棉苗造成機械損傷的缺點；
[0030] 2、本發(fā)明采用浸泡幼胚接種方式，操作簡單，有效縮短接種時間；
[0031] 3、采用本發(fā)明的技術(shù)對棉花進行基因沉默實驗，第一片真葉即可發(fā)生基因沉默， 可用于棉花發(fā)育早期基因的功能研究。
【附圖說明】
[0032]圖1是侵染后的棉苗生長2個月時的白化表型照片；
[0033]圖中：左圖為GhCLAl基因沉默棉株，葉片和莖部可見明顯的白化表型；右圖為對 照，未出現(xiàn)白化現(xiàn)象；
[0034]圖2是一步法RT-PCR檢測沉默植株不同組織中病毒RNA的累積情況的電泳檢測結(jié) 果照片；
[0035] RT-PCR結(jié)果顯示，在侵染苗的根、莖、葉、子葉中均能擴增出明亮的特異性條帶，說 明TRV病毒可全株擴散，未接種病毒的對照株中未擴增出任何產(chǎn)物。
[0036] 圖3是利用QualiPlate Kit for CrylAb/CrylAc試劑盒檢測棉株中BT蛋白的含量 的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于 此。
[0038] 生物材料來源：
[0039] TRV載體的構(gòu)建參考Xiquan Gao等論文Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton(Journal of visualized experiments,8/20/2011, URL:http://www. jove· com/details .php?id = 2938)中的內(nèi)容進行制備；
[0040] 供試棉花品種為C〇ker312和魯棉研37號，購自臨清魯壹種業(yè)有限公司；
[0041]農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購自華越洋生物科技有限公司；
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