專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效建立純系基因剔除小鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種純系基因剔除小鼠模型、建立該純系基因剔除小鼠模型的方法，以及該純系基因剔除小鼠模型的用途。
背景技術(shù)：
自基因剔除技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，在生命科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用?；蛱蕹夹g(shù)本身也在不斷發(fā)展，出現(xiàn)了發(fā)育階段特異性、組織類(lèi)型特異性和藥物誘導(dǎo)性等條件性基因剔除技術(shù)，大大方便了對(duì)基因功能的細(xì)致研究?；蛱蕹夹g(shù)已成為基因功能研究的最重要手段之一。
目前，從發(fā)生同源重組的細(xì)胞獲得基因剔除小鼠主要有三種途徑。
一是在ES細(xì)胞水平進(jìn)行基因打靶，獲得同源重組ES細(xì)胞克隆，然后經(jīng)顯微注射至囊胚內(nèi)或與早期胚胎聚合，將胚胎移植給假孕動(dòng)物，發(fā)育成嵌合體動(dòng)物。如果ES細(xì)胞嵌合到生殖系，嵌合體動(dòng)物的子代小鼠中就會(huì)出現(xiàn)ES細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物，其中一半應(yīng)為基因剔除雜合子。第一種途徑是目前應(yīng)用最廣、技術(shù)最成熟的方法。然而獲得同源重組ES細(xì)胞克隆要經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)移、藥物篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)等過(guò)程，重組ES細(xì)胞克隆向生殖系細(xì)胞分化的能力存在較大差異，導(dǎo)致嵌合體小鼠與C57BL/6黑色小鼠交配獲得灰色小鼠即基因剔除雜合子(50％)的幾率具有較大的不確定性。在部分情況下也會(huì)因基因剔除小鼠遺傳背景差異而影響表型分析。
二是利用四倍體的胚胎只能發(fā)育成胚外組織的特點(diǎn)，將同源重組的ES細(xì)胞與四倍體囊胚嵌合后移植給假孕動(dòng)物，后代都是基因剔除雜合子。這種方法對(duì)ES細(xì)胞的分化全能性要求很高，成功率較低，應(yīng)用較少。
近年來(lái)，隨著克隆(核移植)技術(shù)的發(fā)展，從同源重組細(xì)胞到基因剔除動(dòng)物出現(xiàn)了一種新的途徑按核移植的方法，將同源重組細(xì)胞(ES或其它體細(xì)胞)的細(xì)胞核移植給去核的卵細(xì)胞，發(fā)育成的個(gè)體全部是基因剔除雜合子。由于目前克隆動(dòng)物普遍存在各種健康問(wèn)題，這一方法亦很少用于基因剔除小鼠。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高效建立純系基因剔除小鼠模型的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種用于高效建立純系基因剔除小鼠模型的方法，以及用于該方法的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
本發(fā)明的另一目的是提供該純系基因剔除小鼠模型的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種產(chǎn)生精原細(xì)胞特異性表達(dá)自殺基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，包括步驟(a)提供一線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’至3’依次含有(a)IAP啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子；(b)用顯微注射技術(shù)將步驟(a)中的線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因引入非人哺乳動(dòng)物受精卵的雄原核中；(c)將步驟(b)的受精卵移植到假孕的非人哺乳動(dòng)物的輸卵管；(d)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，所述的非人哺乳動(dòng)物的基因組中整合有自殺基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有(a)IAP啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(e)對(duì)步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行鑒定。
在另一優(yōu)選例中，所述方法，還包括步驟(f)使獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行交配建系，獲得子代。
在另一優(yōu)選例中，所述的自殺基因是hsv-TK、胞嘧啶脫氨酶基因、或VIV-TK。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、兔、猴。更佳地是小鼠和大鼠。
在另一優(yōu)選例中，所述的IAP啟動(dòng)子含有Genebank登錄號(hào)為X04120中第1-1296位的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物中所述終止子密碼子后還含有IAP的3’端長(zhǎng)末端重復(fù)序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用上述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物的用途，用作基因敲除技術(shù)中的囊胚供體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)生純系基因剔除非人哺乳動(dòng)物的方法，包括步驟(a)將本發(fā)明上述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物用作基因敲除技術(shù)中的囊胚供體，獲得其囊胚；(b)將同源重組的ES細(xì)胞與囊胚供體形成嵌合囊胚，從而獲得嵌合體胚胎；(c)從嵌合體胚胎產(chǎn)生基因剔除的非人哺乳動(dòng)物；其中，在嵌合體胚胎發(fā)育過(guò)程中或在動(dòng)物出生后用選自下組的自殺基因誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)供體囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠或大鼠。


圖1顯示了轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖2顯示了IAP-TK轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠的PCR鑒定圖。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性出現(xiàn)765bp帶，野生型或陰性鼠無(wú)特異性擴(kuò)增。
圖3顯示了RT-PCR分析hsv-TK的組織表達(dá)譜。1為野生型小鼠睪丸，2為未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸RNA，3-13分別為轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸、附睪、凝結(jié)腺、精囊腺、心、肝、肺、脾、腎、肌肉、腦。除轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸之外的其余組織均無(wú)特異帶擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，建立了精原細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)自殺基因(如hsv-TK)小鼠，將該小鼠作為囊胚供體，在嵌合體發(fā)育過(guò)程中或發(fā)育成熟后用藥物(如gancyclovir)誘導(dǎo)囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡，則僅重組ES細(xì)胞來(lái)源的精原細(xì)胞可以存活。這樣的嵌合體小鼠與ES細(xì)胞同品系的小鼠交配就可得到遺傳背景單一的子代小鼠，甚至大大增加獲得基因剔除雜合子小鼠的機(jī)會(huì)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
可用于本發(fā)明的自殺基因沒(méi)有特別限制，可以選用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種自殺基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-TK、胞嘧啶脫氨酶(CD)，VIV-TK等。
可用于本發(fā)明的IAP啟動(dòng)子沒(méi)有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)來(lái)源于WEHI-3B細(xì)胞的IAP啟動(dòng)子、其它來(lái)源或其它類(lèi)型的IAP啟動(dòng)子等。IAP啟動(dòng)子即囊內(nèi)A顆粒(intracisternal A-particle)啟動(dòng)子，IAP的序列信息可從Genebank中找到，其登錄號(hào)為X04120，其中5’端重復(fù)序列(IAP5’)(也稱(chēng)為IAP啟動(dòng)子)為第1-1296位，3’端重復(fù)序列(IAP3’)為第3741-5095位。
在本發(fā)明中，自殺基因的表達(dá)受在精原細(xì)胞特異性表達(dá)的IAP啟動(dòng)子(即含有登錄號(hào)X04120所示序列的第1-1296位)控制，從而實(shí)現(xiàn)在精原細(xì)胞的特異性表達(dá)。在優(yōu)選例中，在自殺基因的3‘端還含有IAP的3’端重復(fù)序列(IAP3’)，例如含有X04120所示序列的第3741-5095位的核苷酸序列，以便進(jìn)一步提高表達(dá)的特異性和穩(wěn)定性。
此外，在自殺基因中，除了可以選用其自身的polyA尾之外，還可選用其他來(lái)源的polyA尾，例如SV40的polyA尾。
在本發(fā)明中，非人哺乳動(dòng)物的例子包括(但并不限于)小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠(如C57BL/6J純系小鼠)。
在本發(fā)明的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法中，首先構(gòu)建一構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’至3’依次含有(a)IAP啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子。
在獲得了構(gòu)建物之后，可用常規(guī)方法將線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)入受精卵中。待小鼠出生后用PCR檢測(cè)等方法鑒定自殺基因是否發(fā)生整合入其基因組，從而獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。
用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠具有生殖能力，自殺基因(如hsv-TK)以孟德?tīng)栆?guī)律遺傳給后代小鼠。
用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠建立純系基因剔除小鼠時(shí)，可通過(guò)顯微注射，在小鼠胚胎期將同源重組的ES細(xì)胞引入精原細(xì)胞特異性表達(dá)自殺基因的小鼠。
由于啟動(dòng)子的組織特異性，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中，自殺基因僅僅在睪丸組織中特異性表達(dá)，因此用自殺基因誘導(dǎo)劑，如9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤(gancyclovir)，無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovir)或pencyclovir可選擇性地誘導(dǎo)供體囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡，從而嵌合體小鼠的精原細(xì)胞全部來(lái)源于ES細(xì)胞。這樣，提高ES細(xì)胞來(lái)源的精原細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，進(jìn)而提高嵌和體小鼠后代中出現(xiàn)基因剔除小鼠的幾率。此外，由于嵌合體可直接與ES細(xì)胞同品系的小鼠交配，從而便于獲得遺傳背景單一的基因剔除小鼠。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，從WEHI-3B小鼠白血病細(xì)胞(可購(gòu)自保藏機(jī)構(gòu)ECACC，England)基因組DNA中克隆了IAP(intracisternal A-particle)除CDS外的全部序列，構(gòu)建了IAP-TK轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，經(jīng)顯微注射獲得了11只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，經(jīng)交配繁育建立了3個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系。用RT-PCR方法對(duì)49系雄性小鼠各種組織中hsv-TK的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsv-TK只在睪丸組織中特異性表達(dá)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因小鼠可高效地產(chǎn)生純系基因剔除小鼠模型。
(b)本發(fā)明可以提高獲得基因剔除小鼠的效率下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1IAP-TK質(zhì)粒的構(gòu)建合成引物IAPP1和IAPP2，以小鼠細(xì)胞基因組DNA為模板，擴(kuò)增含IAP3’端的片段IAPP1P2；合成引物IAPP3和IAPP4，擴(kuò)增含IAP5’端的片段IAPP3P4。
表I引物序列

將經(jīng)BamHI和SalI酶切的IAPP1P2片段克隆至pGL3-basic(Promega公司)的SalI-BamHI位點(diǎn)，隨后將全長(zhǎng)的hsv-TK基因(此片段來(lái)自于pPNT(可購(gòu)自University of Michigan的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模式中心))克隆至XbaI-XhoI位點(diǎn)，最后將IAPP3P4片段克隆至KpnI-SmaI位點(diǎn)，獲得轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒IAP-TK的構(gòu)建(圖1)。
實(shí)施例2hsv-TK經(jīng)顯微注射引入小鼠受精卵以及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒IAP-TK用SalI和NotI線性化后，回收含有IAP和hsv-TK基因基因的片段。
線性化的DNA(約500拷貝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植給假孕小鼠。約20天后，小鼠出生。小鼠出生3周后，剪尾提取DNA，PCR(hsv-TK基因特異引物5’-CCCCTTCTTCGCTGGTACGAGGAG-3’(SEQ ID NO5)和5’-AAGCGCGTGGAGTTGACCTGAAGT-3’(SEQID NO6))檢測(cè)分析是否有轉(zhuǎn)基因整合。
結(jié)果如圖2所示。共獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠11只，這些小鼠經(jīng)交配繁育建系，共建立了3個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因在小鼠睪丸組織中的表達(dá)為了檢測(cè)IAP-TK融合基因在小鼠體內(nèi)是否表達(dá)，用Trizol試劑按常規(guī)方法提取小鼠唾液腺總RNA。按Takara RNA PCR Kit(Ver2.1)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)hsv-TK表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸、附睪、凝結(jié)腺、精囊腺、心、肝、肺、脾、腎、肌肉、腦等組織總RNA進(jìn)行分析。
結(jié)果表明，hsv-TK只在睪丸組織中表達(dá)(圖3)。
實(shí)施例4該轉(zhuǎn)基因小鼠可用于提高基因剔除小鼠技術(shù)的效率將實(shí)施例3獲得的IAP-TK轉(zhuǎn)基因小鼠作為基因剔除技術(shù)中的囊胚供體，在嵌合體胚胎發(fā)育過(guò)程中或出生后，用藥物9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤(gancyclovir)，無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovir)或pencyclovir誘導(dǎo)供體囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡，只有來(lái)源于ES細(xì)胞的精原細(xì)胞被保留，甚至被殺死的精原細(xì)胞可能由來(lái)源于ES細(xì)胞的精原細(xì)胞代償，提高ES細(xì)胞來(lái)源的精原細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，從而提高嵌和體小鼠后代中出現(xiàn)基因剔除小鼠的幾率。
實(shí)施例5利用該轉(zhuǎn)基因小鼠獲得遺傳背景單一的基因剔除小鼠將實(shí)施例3獲得的IAP-TK轉(zhuǎn)基因小鼠作為基因剔除技術(shù)中的囊胚供體，在嵌合體胚胎發(fā)育過(guò)程中或出生后，用藥物9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤(gancyclovir)，無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovir)或pencyclovir誘導(dǎo)供體囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡，嵌合體小鼠的精原細(xì)胞全部來(lái)源于ES細(xì)胞。嵌合體無(wú)需與C57BL/6小鼠交配，而與ES細(xì)胞同品系的小鼠交配獲得遺傳背景單一的基因剔除小鼠。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司中科院上海生命科學(xué)研究院上海第二醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)中心上海第二醫(yī)科大學(xué)上海南方模式生物研究中心<120>一種高效建立純系基因剔除小鼠模型的方法<130>033916<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cattcgacgc gttctcacga 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ctgctcaagt attctcctgc 20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>3ggctggcaag cctgtctaac t 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cacggagtgg aaacaggttg t 21<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5ccccttcttc gctggtacga ggag 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6aagcgcgtgg agttgacctg aagt 2權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生精原細(xì)胞特異性表達(dá)自殺基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，包括步驟(a)提供一線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’至3’依次含有(a)IAP啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子；(b)用顯微注射技術(shù)將步驟(a)中的線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因引入非人哺乳動(dòng)物受精卵的雄原核中；(c)將步驟(b)的受精卵移植到假孕的非人哺乳動(dòng)物的輸卵管；(d)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，所述的非人哺乳動(dòng)物的基因組中整合有自殺基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有(a)IAP啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(e)對(duì)步驟(d)獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行鑒定。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括步驟(f)使獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行交配建系，獲得子代。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自殺基因是hsv-TK、胞嘧啶脫氨酶基因、或VIV-TK。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、兔、猴。
6.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的IAP啟動(dòng)子含有Genebank登錄號(hào)為X04120中第1-1296位的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物中所述終止子密碼子后還含有IAP的3’端長(zhǎng)末端重復(fù)序列。
8.一種用權(quán)利要求1所述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物的用途，其特征在于，用作基因敲除技術(shù)中的囊胚供體。
9.一種產(chǎn)生純系基因剔除非人哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，包括步驟(a)將權(quán)利要求1的所述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物用作基因敲除技術(shù)中的囊胚供體，獲得其囊胚；(b)將同源重組的ES細(xì)胞與囊胚供體形成嵌合囊胚，從而獲得嵌合體胚胎；(c)從嵌合體胚胎產(chǎn)生基因剔除的非人哺乳動(dòng)物；其中，在嵌合體胚胎發(fā)育過(guò)程中或在動(dòng)物出生后用選自下組的自殺基因誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)供體囊胚來(lái)源的精原細(xì)胞死亡。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠或大鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生純系基因剔除小鼠模型的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，在該動(dòng)物的基因組中轉(zhuǎn)入了外源性的自殺基因，所述表達(dá)盒含有(a)啟動(dòng)子，(b)與啟動(dòng)子操作性相連的自殺基因，(c)終止密碼子。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)建系后，自殺基因僅在睪丸組織中表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用做基因敲除技術(shù)中的囊胚供體，以提高基因剔除技術(shù)的效率及解決基因敲除小鼠遺傳背景不純的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1580251SQ0314210
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者王鑄鋼, 趙旭東, 任維華, 王龍, 孔輝 申請(qǐng)人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司, 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海第二醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)中心, 上海第二醫(yī)科大學(xué), 上海南方模式生物研究中心