一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明適用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供了一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法，所述方法包括：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18％蛋白質(zhì)，60％糖類(lèi)，22％脂肪；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標(biāo)準(zhǔn)飼料，主要成份為18％蛋白質(zhì)，69％糖類(lèi)，3％脂肪。本發(fā)明采用長(zhǎng)期膳食誘導(dǎo)糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類(lèi)糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期緩慢進(jìn)程及由此引起的全身機(jī)體變化的問(wèn)題，科學(xué)性較強(qiáng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，糖尿病的研究所采用的動(dòng)物多為大、小鼠，造模方法有自發(fā)和化學(xué)誘導(dǎo)等方法。目前糖尿病研究多采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，但嚙齒類(lèi)與人類(lèi)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且壽命短，因此，并不適于糖尿病機(jī)理及其并發(fā)癥的研究。在非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，無(wú)論是自發(fā)性、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)化合物誘導(dǎo)、基因突變、或者其他途徑獲得的糖尿病模型都有I型和2型糖尿病動(dòng)物模型的報(bào)道。所有種類(lèi)的動(dòng)物模型中，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中觀察到的血糖規(guī)律、病理特征與在人類(lèi)糖尿病患者中觀察到的臨床特征最為相似。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，在鏈脲霉素誘導(dǎo)高血糖動(dòng)物模型中，選用動(dòng)物，常用小鼠或大鼠，也可選用兔、犬及猴等，配制不同濃度或單一濃度的STZ水溶液，采用靜脈或腹腔注射方式單次或多次重復(fù)給藥。經(jīng)過(guò)不同處理時(shí)間后檢測(cè)是否成模。分別在注射STZ前，給藥后不同時(shí)間(一般2-6個(gè)月，有I年時(shí)間)進(jìn)行血糖值測(cè)定、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和血清胰島素或C肽檢測(cè)，頻率均有不同，并觀察記錄動(dòng)物的體重變化和臨床癥狀。
[0004]在鏈脲霉素誘導(dǎo)高血糖動(dòng)物模型中，存在以下問(wèn)題:
[0005](1)采用的STZ在不同動(dòng)物，甚至不同報(bào)道中誘導(dǎo)糖尿病所需要的劑量不盡相同，高劑量STZ會(huì)引起造模動(dòng)物死亡，低劑量STZ難于成模，或者成模后很快就轉(zhuǎn)陰。另外，STZ注射方式(腹腔、靜脈注射)等對(duì)造模也有一定影響。因此，采用STZ造糖尿病動(dòng)物模型時(shí)一定要選用適合的劑量和注射方式，一方面降低STZ的毒副作用；另一方面提高STZ成模的穩(wěn)定性。很難掌握，缺點(diǎn)突出。
[0006](2)由藥物STZ引起的胰島損傷并不能真正很好的模擬人類(lèi)糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期緩慢進(jìn)程及由此引起的全身機(jī)體變化，因此用于相關(guān)研究的科學(xué)性尚不足。
[0007](3)目前報(bào)道的STZ誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糖尿病為I型糖尿病，未見(jiàn)誘導(dǎo)2型糖尿病的報(bào)道，且多用作胰腺細(xì)胞的異種移植受體，極少用于新藥評(píng)價(jià)中。
[0008](4)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糖尿病造模的時(shí)間上還不長(zhǎng)，有待進(jìn)行更長(zhǎng)期的研究以確定模型的穩(wěn)定性與時(shí)相轉(zhuǎn)化。
[0009]另外，在食物誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類(lèi)糖尿病模型中，Wagner等給45只食蟹猴飼喂高碳水化合物和低膽固醇的食物[18%蛋白、22%的脂肪、60%碳水化合物(果糖含量達(dá)20% )]。雖然大部分食蟹猴的空腹血糖值保持正常，但糖耐量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其血糖濃度和胰島素含量在個(gè)體中的差別很大。那些具高胰島素(HyperinSul inemic, HI)的8只猴子或者糖耐量受損(impaired glucose tolerant, IGT)的10只猴子空腹血糖濃度和胰島素含量顯著地升高。同時(shí)具有高血糖和糖耐量受損的5只猴子(HI+IGT)出現(xiàn)肥胖，體重比對(duì)照組猴子多40%，這組猴子的廋素濃度也高。與正常食物飼喂的其他猴子相比，所有上述猴子具高血脂和低HDLC，其中HI+IGT組猴子的值最高。一年后，10只IGT猴子中的I只和5只HI+IGT猴子中的3只發(fā)展為糖尿病。[0010]在食物誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類(lèi)糖尿病模型中，存在下述問(wèn)題:
[0011](I)使用的動(dòng)物為食蟹猴，該猴為熱帶猴，國(guó)內(nèi)主要集中在廣西、廣東、海南三省，受氣候環(huán)境、資源條件的影響非常大。所以急需建立其他亞種的糖尿病模型動(dòng)物。
[0012](2)現(xiàn)有技術(shù)造模的時(shí)間在I年內(nèi)，還不能很好地觀察到模型的發(fā)展進(jìn)程和變化。[0013](3)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的頻率還不夠，穩(wěn)定的模型需要不同時(shí)間段的更加穩(wěn)定的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)支持。
[0014](4)該類(lèi)非人靈長(zhǎng)類(lèi)糖尿病模型在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)藥物造模中毒副作用強(qiáng)，穩(wěn)定性差的問(wèn)題。
[0016]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法，所述方法包括:
[0017]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18 %蛋白質(zhì)，60%糖類(lèi)，22%脂肪；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標(biāo)準(zhǔn)飼料，王要成份為18%蛋白質(zhì)，69%糖類(lèi),3%脂肪。
[0018]本發(fā)明實(shí)施例采用長(zhǎng)期膳食誘導(dǎo)糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類(lèi)糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期緩慢進(jìn)程及由此引起的全身機(jī)體變化的問(wèn)題，科學(xué)性較強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明實(shí)施例采用長(zhǎng)期膳食誘導(dǎo)糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類(lèi)糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期緩慢進(jìn)程及由此引起的全身機(jī)體變化的問(wèn)題，科學(xué)性較強(qiáng)。
[0021]在本發(fā)明實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為60只雄性恒河猴川西亞種(M.m.1asiotis)，普通級(jí)，年齡4-20歲，體重5-18kg，由國(guó)家(四川)實(shí)驗(yàn)用獼猴種源基地提供，合格證號(hào):22。喂食高脂飼料前，所有動(dòng)物空腹血糖(FPG) ^ 5mmol/L.試驗(yàn)前檢疫合格，內(nèi)容包括體檢，2次結(jié)核桿菌試驗(yàn)、寄生蟲(chóng)、沙門(mén)氏菌、致賀氏菌和B病毒檢查。不銹鋼猴籠中飼養(yǎng)，4只/籠，飼養(yǎng)室溫度和濕度:19-26°C (66-79° F)和50±20% ;換氣次數(shù):10次/h，保證12( H )/12(夜)h的光照周期。
[0022]在本發(fā)明實(shí)施例中，試驗(yàn)監(jiān)測(cè)周期為2年，每日上午自由攝取實(shí)驗(yàn)猴飼料250g，下午4點(diǎn)給予I個(gè)蘋(píng)果或等量蔬菜。50只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料(飼料詳細(xì)配方暫時(shí)略，需要再提供)，主要成份為18%蛋白質(zhì)，60%糖類(lèi)，22%脂肪；10只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標(biāo)準(zhǔn)飼料，主要成份為18%蛋白質(zhì)，69%糖類(lèi)，3%脂肪。
[0023]在本發(fā)明實(shí)施例中，飲用水為自來(lái)水，經(jīng)自動(dòng)飲水嘴自由攝取。水樣需分析可溶性固體總量、硬度、特殊微生物含量、選擇的元素、重金屬、有機(jī)物以及氯代烴含量。結(jié)果記錄在檔案中。動(dòng)物福利符合“the Nat i onal Inst i tutes of Health Guide for theCare and Use of Laboratory Animal ”要求,所有實(shí)驗(yàn)方案都經(jīng)過(guò)中心動(dòng)物福利和使用委員會(huì)的審查和同意。
[0024]在本發(fā)明實(shí)施例中，采用的儀器為全自動(dòng)生化分析儀(SYNCHRON CX4PR0)、Shimadzu CL-8000全自動(dòng)生化分析儀、分光光度計(jì)，全自動(dòng)高壓滅菌鍋(HVE-50，Hirayama) > Sigmal-15 普通離心機(jī)(Sigma 公司)、微量移液器(10 u L>200 u L> 1000 u L) >渦旋振蕩器、恒溫水浴鍋、低溫冰柜(海爾電器)>725型超低溫冰柜(Themo Forms公司)、梅特勒-托利多XK3123(METTLER TOLEDO)大動(dòng)物天平等。
[0025]在本發(fā)明實(shí)施例中，誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法詳述如下:
[0026](1)體重和體重指數(shù)(BMI)檢查
[0027]在本發(fā)明實(shí)施例中，兩年試驗(yàn)期，60只動(dòng)物每日觀察一般狀況及飼料消耗情況；于高脂飼料誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后每月測(cè)定體重和體長(zhǎng)變化。以體重除以體長(zhǎng)平方計(jì)算BMI。本次試驗(yàn)中采用人肥胖分級(jí)來(lái)診斷猴:偏瘦(BMI ( 18.5)、正常范圍(BMI:18.5-25)、偏胖(BMI:25-30)、肥胖(BMI ≥ 30)。
[0028](2)空腹血糖(FPG)、空腹血漿胰島素(FPI)和糖化血紅蛋白檢查
[0029]在本發(fā)明實(shí)施例中，60只動(dòng)物于高脂飼料誘導(dǎo)前I次，誘導(dǎo)后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小時(shí)后肢股靜脈采血，分析空腹血糖和空腹血漿胰島素水平；于高脂飼料誘導(dǎo)24月檢測(cè)HbAlc。
[0030]在本發(fā)明實(shí)施例中，空腹血糖(FPG)檢測(cè)采用貝克曼庫(kù)爾勒全自動(dòng)生化分析儀(SYNCHRON CX4PR0)測(cè)定血糖，測(cè)定用血不抗凝，測(cè)定方法為過(guò)氧化酶終點(diǎn)法。
[0031]在本發(fā)明實(shí)施例中，空腹血漿胰島素(FPI)檢測(cè)采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。
[0032]①自備物品:酶標(biāo)儀提前預(yù)熱，微量加液器及吸頭、EP管、蒸餾水和濾紙。
[0033]②樣品處理:全血標(biāo)本于室溫放置2小時(shí)后1000 Xg離心20分鐘，取上清，蒸餾水稀釋10倍待測(cè)。
[0034]③操作步驟:
[0035]a.96孔板分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，分別加入IOOyl樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，加覆膜37°C溫育2小時(shí)；
[0036]b.棄去上清，甩干，每孔加檢測(cè)液A工作液lOOiU，加覆膜37°C溫育I小時(shí)；
[0037]c.棄去上清，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約每孔400 U 1，甩干；
[0038]d.每孔加檢測(cè)液B工作液100 U 1，加覆膜37°C溫育I小時(shí)；
[0039]e.棄去上清，甩干，洗板5次，同步驟c ；
[0040]f.每孔加底物溶液90 U 1，加覆膜37°C避光顯色15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3_4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)即可終止；
[0041 ] g.每孔加終止溶液50 ill，此時(shí)藍(lán)色立刻轉(zhuǎn)變成黃色，反應(yīng)終止；
[0042]h.立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值。
[0043]④計(jì)算方法:取標(biāo)準(zhǔn)品OD值扣除空白孔OD值后作七點(diǎn)圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))用curve expertl.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣品OD值代入方程式，計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)得樣品實(shí)際濃度。
[0044]在本發(fā)明實(shí)施例中，糖化血紅蛋白(HbAlc)檢測(cè)中采用Shimadzu CL_8000fullself-biochemical測(cè)定,測(cè)定用血用肝素鈉抗凝。
[0045](3)靜脈注射葡萄糖耐受試驗(yàn)[0046]在本發(fā)明實(shí)施例中，高脂飼料誘導(dǎo)后24月，60只動(dòng)物進(jìn)行靜脈注射葡萄糖耐受試驗(yàn)(IVGTT)診斷糖耐量損傷(IGT)。以每千克體重0.5ml服用50 %右旋葡萄糖，使最終劑量達(dá)到每千克體重0.25g葡萄糖。先在基線水平檢測(cè)血糖水平，然后在空腹16小時(shí)以后靜脈注射葡萄糖分別在1、5、10、15、20和60分鐘測(cè)定血糖水平。用以下公式計(jì)算葡萄糖清除率(Ke):KG = In(5分鐘血糖水平)-1n(20分鐘血糖水平)/15分鐘100%。[0047]在本發(fā)明實(shí)施例中，采用IVGTT試驗(yàn)分析餐后胰島素分泌敏感性。高脂飼料誘導(dǎo)后24月，挑選6只FPG正常，2只處于IFG或IGT階段和I只顯性糖尿病階段猴進(jìn)行。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為:先在基線水平檢測(cè)胰島素水平，然后在空腹16小時(shí)以后靜脈注射葡萄糖(方式同前)分別在1、3、5、7、10、15、30、45和60分鐘測(cè)定胰島素。血漿胰島素(FPI)檢測(cè)采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。
[0048]在本發(fā)明實(shí)施例中，在16小時(shí)空腹即將結(jié)束之前給猴子提供含0.33g/ml葡萄糖的飲料。飲料量以猴子體重來(lái)計(jì)算供給，猴子只有在20分鐘之內(nèi)喝掉90%的量算試驗(yàn)成功，共服用葡萄糖量大約為每千克體重2g，實(shí)際消耗量需經(jīng)計(jì)算。撤走飲料2小時(shí)后，采集血液檢查2小時(shí)胰島素和血糖水平。
[0049]在本發(fā)明實(shí)施例中，采用美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)和WH02006年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為:
[0050]a.典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)，任意血糖≤11.1mmol/L或空腹血糖(FPG)≤7.0mmoI/L,為糖尿??；
[0051]b.空腹血糖(FPG) < 6.llmmol/L 并且餐后 2h 血糖(2hPG) < 7.77mmol/L,為正常；
[0052]c.餐后 2h 血糖(2hPG) > 1.77臟01/1，但< 11.lmmol/L 時(shí)為糖耐量損傷(IGT)；
[0053]d.空腹血糖(FPG)≤6.11臟01/1，但< 6.99mmo/L時(shí)為空腹血糖損傷。
[0054]在本發(fā)明實(shí)施例中，所有數(shù)據(jù)都采用均值土標(biāo)準(zhǔn)差顯示。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)，差異采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行評(píng)估。正態(tài)分布數(shù)據(jù)各組間的差異則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)分析都采用NCSS2000軟件(NCSS, Kaysvil I e，UT)，所有分析P值小于0.05都認(rèn)為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0055]⑷結(jié)果分析
[0056]本發(fā)明實(shí)施例結(jié)果為:50只猴采食含22%脂肪飼料24月，8只發(fā)展成顯性糖尿病，26只猴表現(xiàn)為糖耐量損傷或空腹血糖受損，16只猴表現(xiàn)為空服血糖水平正常；10只喂食含3%脂肪的猴標(biāo)準(zhǔn)飼料24月，空服血糖水平正常。恒河猴川西亞種糖耐量損傷和2型糖尿病發(fā)病早期階段特征表現(xiàn)為肥胖，F(xiàn)PI代償性增加，餐后葡萄糖清除速度(KGluc5-20)顯著降低，餐后胰島素分泌敏感性下降，第一時(shí)相胰島素分泌減少，第二時(shí)相胰島素分泌延遲；HbAlc隨著血糖水平增加而上升；慢性高血糖晚期猴表現(xiàn)為瘦弱、多尿多飲,空腹血糖可大于10mmol/l，HbAlc水平可達(dá)8.9%,FPI顯著降低,餐后半小時(shí)胰島素分泌增加后迅速降低。HbAlc在4.5-5%之間有發(fā)展成2型糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)可能。
[0057]本發(fā)明實(shí)施例采用長(zhǎng)期(2年期)膳食誘導(dǎo)糖尿病的模型建立，符合人類(lèi)糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期緩慢進(jìn)程及由此引起的全身機(jī)體變化，且成模后更安全穩(wěn)定，進(jìn)行相關(guān)研究具有更強(qiáng)的科學(xué)性。選用的獼猴川西亞種在四川西部廣泛分布，且具有品系純正，和體型小型化特點(diǎn)，可面向國(guó)際國(guó)內(nèi)提供動(dòng)物模型。[0058]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)糖尿病模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18%蛋白質(zhì)，60%糖類(lèi)，22%脂肪；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標(biāo)準(zhǔn)飼料，主要成份為18%蛋白質(zhì)，69%糖類(lèi),3%脂肪。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 試驗(yàn)監(jiān)測(cè)周期為2年，每日上午自由攝取實(shí)驗(yàn)猴飼料250g，下午4點(diǎn)給予I個(gè)蘋(píng)果或等量蔬菜。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 兩年試驗(yàn)期，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日觀察一般狀況及飼料消耗情況，并于高脂飼料誘導(dǎo)前、后每月測(cè)定體重和體長(zhǎng)變化。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于高脂飼料誘導(dǎo)前I次，誘導(dǎo)后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小時(shí)后肢股靜脈采血，分析空腹血糖和空腹血漿胰島素水平，并于高脂飼料誘導(dǎo)24月檢測(cè)糖化血紅蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 高脂飼料誘導(dǎo)后24月，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行靜脈注射葡萄糖耐受試驗(yàn)診斷糖耐量損傷。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 采用美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)和WH02006年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。
7.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用國(guó)家實(shí)驗(yàn)用獼猴種源基地的獼猴川西亞種。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK103478071SQ201310275715
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】羅啟慧, 陳正禮, 曾文, 程安春, 龔立, 畢鳳君, 曾利才 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)